مقالة منهجية

تصوير متحد البؤر ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للحاجز الدموي الدماغي في قسم دماغ الفأر

يونيو 18, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Villaseñor، R and Collin. L. التصوير متحد البؤر عالي الدقة للحاجز الدموي الدماغي: التصوير ، وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد ، والقياس الكمي للانتقال الخلوي. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو تصويرا ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للحاجز الدموي الدماغي (BBB) باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر ، مما يعرض أقسام دماغ الفأر الملطخة بالأجسام المضادة لتحليل مكونات BBB والهياكل داخل الخلايا ، والتي تنطبق على دراسة توازن الدماغ ، والتفاعلات العصبية الوعائية ، والخلل الوظيفي BBB المرتبط بالأمراض.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

  1. التصوير متحد البؤر عالي الدقة للحاجز الدموي الدماغي
  2. قم بإجراء الحصول على الصور باستخدام مجهر متحد البؤر مناسب للمسح بالليزر (انظر جدول المواد) مع خطوط ليزر عند 405 و 488 و 561 و 633 نانومتر لإثارة الفلوروفورات في المناطق الزرقاء والخضراء والبرتقالية والحمراء من طيف الضوء. للحصول على الصور، استخدم هدف الزيت 63X بفتحة عددية تبلغ 1.4.
  3. في قائمة الاستحواذ الخاصة بالبرنامج الذي يتحكم في المجهر ، قم بتعيين معلمات الحصول على الصورة. في القائمة المنسدلة "حجم الصورة"، اختر قيمة 1024 × 1024 بكسل. قم بتعديل حجم البكسل إلى قيمة تتراوح بين 200 و 300 نانومتر عن طريق ضبط قيمة قائمة "التكبير".
    ملاحظة: لتحليل الهياكل داخل الخلايا ، قم بتقليل حجم البكسل إلى 75 نانومتر. يزيد إعداد حجم الصورة هذا بشكل كبير من وقت الاستحواذ ويمكن تقليله إلى 512 × 512 بكسل لتقليل وقت الاستحواذ عن طريق تصوير مجال رؤية أصغر.
  4. في القائمة المنسدلة "سرعة الاكتساب"، حدد قيمة 400 هرتز، أي 400 سطر في الثانية. في قائمة "إعدادات الأنظمة" ، حدد القائمة المنسدلة "عمق البكسل " ، وقم بتغيير القيمة إلى 12 بت.
  5. في برنامج المجهر ، ضمن علامة التبويب "الاستحواذ" ، قم بالتبديل إلى خيار الحصول على الإطار المتسلسل. اضبط سمك المقطع البصري على قيمة تتراوح بين 0.75 و 1 ميكرومتر لكل قناة عن طريق تعديل القيمة في قائمة "Pinhole".
  6. في لوحة الإثارة الفلورية ، قم بتنشيط الليزر المطلوب لإثارة الفلوروفورات في العينة على النحو الأمثل ، على سبيل المثال ، خط ليزر 488 نانومتر للفلوروفور الباعث للأخضر.
    ملاحظة: استخدم عارض أطياف الفلوروفور (انظر جدول المواد) لتحديد ليزر الإثارة المناسب.
  7. في لوحة الكشف عن الفلورسنت، حرك شريط التمرير لتحديد الأطوال الموجية التي سيتم قياسها في كل قناة، على سبيل المثال، بين 510 و550 نانومتر للفلوروفور الباعث للأوراق الخضراء.
    ملاحظة: استخدم عارض أطياف الفلوروفور (انظر جدول المواد) لتحديد الأطوال الموجية للكشف المناسبة.
  8. أضف قطرة من زيت الغمر مع معامل انكسار 1.52 أعلى الغطاء مع قسم الدماغ لتتناسب مع معامل الانكسار للغطاء الزجاجي والهدف. ضع العينة في المجهر وقم بتشغيل مصباح epifluorescent لتصور العينة باستخدام مناظير المجهر.
  9. باستخدام الأزرار الموجودة على حامل المجهر ، قم بتغيير عجلة المرشح لتحديد مرشح مناسب لتصور النوى الملطخة ب DAPI (4 '، 6-diamidino-2-phenylindole). استخدم التركيز البؤري الخشن لتركيز الإشارة من النوى الملطخة ب DAPI.
  10. باستخدام الأزرار الموجودة على حامل المجهر ، قم بتغيير المرشحات لتصور الإشارة من علامات الأوعية الدموية (على سبيل المثال ، CollagenIV أو CD31) وتوسيط مجال الرؤية على جزء شعري فردي.
  11. اضغط على الزر لبدء وضع المسح المباشر. أثناء المسح الضوئي، اضبط الكسب وشدة الليزر لكل قناة لزيادة النطاق الديناميكي للصور وتجنب تشبع البكسل.
    ملاحظة: استخدم جدول بحث يصنف وحدات البكسل المشبعة لتقييم التشبع الزائد بصريا. لتجنب الإفراط في تشبع الإشارة ، اضبط الإعدادات مع العينة التي من المتوقع أن تحتوي على أعلى إشارة فلورسنت.
  12. قم بتعيين قيمة متوسط الخط إلى 2.
    ملاحظة: عند استخدام سرعات اكتساب أعلى، قم بزيادة هذه القيمة لتقليل التشويش.
  13. إنشاء أقسام البداية والنهاية لأداء مكدسات z البصرية التي تمتد على كامل حجم الشعيرات الدموية. استخدم حجم خطوة يبلغ 0.45 ميكرومتر
    ملاحظة: إذا كان سيتم استخدام الصور للقياس الكمي اللاحق ، فاحتفظ بنفس إعدادات الاكتساب لمجموعة البيانات الكاملة.
  14. للقياس الكمي ، احصل على 10 إلى 20 مكدس z لكل قسم من ثلاثة فئران مختلفة على الأقل للمقارنات الإحصائية.
    ملاحظة: احصل على مجموعة البيانات الكاملة في نفس الجلسة لتقليل التباين الناجم عن تبييض العينة وتقلبات شدة الليزر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات rat a-antibody antibody anti monolines ER-MP12 ضد CD31 / PECAMNovus BiologicalsMCA2388Labels الخلايا البطانية الدماغاستخدم عند التخفيف 1:100اكتشف مع الحمار متعدد النسيلة المضاد للفئران IgG (H + L) إلى جانب صبغة AlexaFluor المناسبة ، المستخدمة عند التخفيف 1:400الأجسام المضادة أحادية النسيلة للفئران ضد Podocalyxinأنظمة البحث والتطويرMAB1556تسميات تجويف الشعيرات الدمويةاستخدم عند التخفيف 1: 100اكتشف مع الحمار متعدد النسيلة المضاد للفئران IgG (H + L) إلى جانب صبغة AlexaFluor المناسبة ، المستخدمة في التخفيف 1: 400أجسام مضادة متعددة النسيلة للأرانب ضد CollagenIVBiotrendBT21-5014-70الملصقات غشاء القاعدي للشعيرات الدمويةاستخدم عند التخفيف 1: 100الكشف عن الحمار متعدد النسيلة المضاد للأرانب IgG (H + L) إلى جانب صبغة AlexaFluor المناسبة ، المستخدمة في التخفيف 1: 400جسم مضاد متعدد النسيلة للماعز ضدأنظمة البحث والتطويرCD13 AF2335ملصقات السعي استخدم عند التخفيف 1: 100الكشف عن الحمار متعدد النسيلة المضاد للماعز IgG (H + L) إلى جانب صبغة AlexaFluor المناسبة ، المستخدمة في التخفيف 1: 400استنساخ الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر G-A-5 ضد GFAP مقترنا ب Cy3Abcamab49874تسميات الخلايا النجمية استخدم عند التخفيف 1: 100أجسام مضادة متعددة النسيلة للأرانب ضد Iba-1واكو019-19741ملصقات الخلايا الدبقية الدقيقةاستخدم عند التخفيف 1: 100الكشف عن الحمار متعدد النسيلة المضاد للفئران IgG (H + L) إلى جانب صبغة AlexaFluor المناسبة ، المستخدمة في التخفيف 1: 400الجسم المضاد أحادي النسيلة للفئران ABL93 gainst LAMP2Fitzgerald10R-CD107BBMSPالملصقات الجسيمات الحالةاستخدم عند التخفيف 1:100الكشف عن الحمار متعدد النسيلة المضاد للفئران IgG (H + L) إلى جانب صبغة AlexaFluor المناسبة ، المستخدمة في التخفيف 1: 400جسم مضاد متعدد النسيلة للحمار ضد الفأر IgG (H + L) AlexaFluor594LifeTechnologiesA21203استخدم عند التخفيف 1: 400جسم مضاد متعدد النسيلة للحمار ضد الفأر IgG (H + L) AlexaFluor488LifeTechnologiesA21202استخدم عند التخفيف 1: 400الماعز الأجسام المضادة متعددة النسيلة ضد الفأر IgG (H + L) AlexaFluor555LifeTechnologiesA21422الاستخدام عند التخفيف 1:400تركيب الفلورسنتالمتوسط DakoS3023Dako تركيب الفلورسنتمتوسط المسح الضوئي بالليزر المجهر متحد البؤرLeica MicrosystemsNALeica TCS SP8 X مع كاشفات HyD وبرنامجمعالجة الصور بالليزر الأبيض Leica MicrosystemsNALeica Application Suite AF الإصدار 3.1.0 build 8587برنامج تحليل الصورBitplane البرنامج العلميNAImaris الإصدار 7.6.5 بناء 31770 ل x64Fluorescence SpectraViewerThermoFisher ScientificNAhttps://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Z Stack

مقالات ذات صلة