الحقن تحت الشبكية للنواقل الفيروسية في ظهارة صبغة الشبكية في نموذج الفأر

الملخص

المصدر: Park, S. W., et al. النهج الحزوي - الحقن تحت الشبكية للنواقل الفيروسية للعلاج الجيني في الفئران صبغة الشبكية الظهارية. J. Vis. Exp. (2015)

يصف الفيديو طريقة الحقن تحت الشبكية للنواقل الفيروسية في ظهارة صبغة الشبكية (RPE) في نموذج الفأر. يفصل الإجراء من التخدير وإعداد العين إلى التوصيل الدقيق لنواقل الفيروسات ، مما يضمن تكامل الجينات والتعبير عنها في RPE.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تحضير طقم الحقن والنواقل

1. الفيروسية تحضير حقنة الميكرولتر المجهزة بإبرة حادة 33 جم معقمة باستخدام غاز أكسيد الإيثيلين. تمييع النواقل الفيروسية في PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) للحصول على عيار كاف في الأنبوب الدقيق (أي 1 × 10⁶ TU / ميكرولتر). اغسل المحقنة عدة مرات بنواقل فيروسية لإزالة أي مساحة ميتة في المحقنة.

2. الحقن تحت الشبكية للنواقل الفيروسية

1. تخدير الفئران البالغة (أي من 6 إلى 8 أسابيع) بحقن داخل الصفاق من خليط التيتيتامين والزولازيبام (1: 1 ، 2.25 مجم / كجم من وزن الجسم) والزيلازين هيدروكلوريد (0.7 مجم / كجم من وزن الجسم) أو نظام تخدير بديل مناسب.
2. قم بتوسيع حدقة العين بقطرة عين من فينيليفرين 0.5٪ وتروبيكاميد 0.5٪.
3. قم بإعداد حقنة الميكرولتر عن طريق تحميلها ب 1.5 - 2 ميكرولتر من النواقل الفيروسية.
4. افتح الجفن وبرز العين لكشف خط الاستواء للحقن المريح. ركز عليها تحت مجهر التشغيل. حافظ على وضع العين البارزة حتى الانتهاء من الحقن ، أو يمكن أن يحدث إزاحة الإبرة أثناء الحقن. لإمساك مقلة العين بإحكام ، ضع الأصابع خارج الحافة المدارية.
5. ضع قطرة من محلول اللزجة المرنة للعيون على سطح القرنية.
6. ضع شريحة غطاء دائرية صغيرة على الجزء العلوي من القرنية لتصور شبكية العين.
7. ثقب ثقب صغير في الجزء الخلفي الطفيف من ليفي الأطراف باستخدام إبرة معقمة 30 جم 1/2 لمزيد من الحقن تحت الشبكية. للراحة ، اجعل الثقب أدنى للعين اليمنى ومتفوقا على العين اليسرى.
   ملاحظة: إذا تم عمل الثقب في الصدغ أو الأنف ، فمن الصعب أن يتم تغطيته بالجفن بعد الحقن. يجب إجراء البزل الأولي خلفيا قليلا للطرف لتجنب الأوعية القصوية التي تمتد على طول الأطراف ويمكن التعرف عليها بسهولة. احرص على تجنب ضرب العدسة بإبرة أثناء إجراء الثقب الأولي. لا تقم بإدخال شطبة الإبرة بالكامل لتجنب ثقب العدسة.
8. ضع الإبرة الحادة 33 جم من حقنة الميكرولتر من خلال الفتحة المثقوبة مسبقا واقترب من الإبرة في الفضاء تحت الشبكية حتى تشعر بمقاومة خفيفة.
   ملاحظة: بالنسبة للحقن تحت الشبكية ، فإن أفضل زاوية اقتراب للإبرة هي حوالي 45 درجة ضد مستوى القزحية ، ويجب دفع الإبرة الحادة للخلف باتجاه المنطقة المحيطة بالحليمة. يشير المربع المنقط إلى مسار الإبرة المقترح عبر التجويف الزجاجي للحقن تحت الشبكية في الشكل 1.
   ملاحظة: لن تكون هناك مقاومة محسوسة عند ثقب (أو تمرير) طبقات الشبكية لأنها ناعمة جدا. وبالتالي ، فإن الشعور الأول بالمقاومة الخفيفة يشير إلى أن الإبرة قد لمست بالفعل طبقة RPE (ظهارة صبغة الشبكية) ، ويجب إيقاف إدخال الإبرة. احرص على عدم اختراق الأنسجة الصلبة بضغط مفرط لأنه يجب وضع الإبرة في الفضاء تحت الشبكية المحتمل. إذا ثقبت الإبرة الأنسجة الصلبة بقوة مفرطة ، فإنها تدخل في المساحات المدارية خارج العين دون مقاومة. (هذه الخطوة حاسمة)
9. حقن النواقل الفيروسية (على سبيل المثال ، 1 × 10⁶ TU / ميكرولتر) برفق في الفضاء تحت الشبكية دون رعشة لتجنب تلف الأنسجة غير المرغوب فيه. ثم اسحب الإبرة برفق. امسك مقلة العين بقوة أثناء الحقن ، كما هو موضح في 2.4.
10. راقب تكوين الفقاعات تحت الشبكية بعد الحقن تحت المجهر التشغيلي للتأكد من عدم وجود نزيف في الشبكية.

النتائج

فئة الشكل = 'صورة image-style-align-center image_resized' style='display:table;margin-left;auto;margin-right:auto;width:75٪;'>

الشكل 1. رسم تخطيطي للحقن تحت الشبكية. H & E (تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين) المقطع العرضي الملون لعين الفأر يصور الهياكل بمسار إبرة للحقن تحت الشبكية ملحوظ (مربع منقط). التكبير: 40X ، شريط المقياس: 500 ميكرومتر.

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول' >< فئة الجدول = 'ck-table-resize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Tweezers DUMONT # 5 11 سم DUMOSTAR 0.1 × 0.06 مم نصائحWPI500233 VANNAS Scissors S / S ، 105 ممWPI555583S 33G إبرة حادةWPINF33BL-2 حقنة NanoFil ، 10 ميكرولترWPINANOFIL RPE-KITWPIRPE-KITلسهولة الحقن بيد واحدة30 جيجا × 1 / 2 (0.3 مم × 13 مم) BD PrecisionGlideTM NeedleBD305107ثقب أولي لحقن تحت الشبكيةنظارات غطاء المجهر (رقم 1 قطر 3 مم) تعمل شركة Warner Instruments64-0720 (CS-3R) Leica مجهرLeicaLM M80 مجهر الفلوريسيننيكونEclipse 80i LentivirusThermo ScientificTMO. LV-Ctrيستخدم لتخفيف النواقلPBSGibco10010-015يستخدم لتخفيف النواقلTroperin (فينيليفرين 0.5٪ - تروبيكاميد 0.5٪) Hanmi لتوسيعمحلول العيون Proparacaine Hydrochloride USP ، 0.5٪ (معقم) Bausch & Lomb للتخدير الموضعيHealon GV OVDAbbott Medical Optics Inc. زولتيل 50 (هيبوكلوريد التيلامين وزولازيبام هيبوكلوريد)فيرباك للتخدير العامحقن رومبون® (زيلازين هيدروكلوريد)باير للتخدير العام