تصوير حالة الأكسدة والاختزال في الخلايا العصبية الأولية باستخدام مؤشر القياس النسبي

الملخص

المصدر: Katsalifis، A.، et al. التصوير الحي لحالة أكسدة الجلوتاثيون والاختزال في الخلايا العصبية الأولية باستخدام مؤشر النسب. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو تصوير حالة الأكسدة والاختزال في الميتوكوندريا في الخلايا العصبية الأولية باستخدام مؤشر الفلورسنت النسبي. من خلال تطبيق طولين موجيين للإثارة تحت المجهر الفلوري ، يتم قياس نسبة شدة التألق لتقييم أكسدة الميتوكوندريا. يتضمن البروتوكول تحفيز N-methyl-D-aspartate (NMDA) للحث على تدفق الكالسيوم وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، متبوعا بالمعايرة باستخدام عوامل مؤكسدة ومختزلة لتحديد أكسدة الميتوكوندريا التي يسببها NMDA.

البروتوكول

1. تحميل الخلايا ببيركلورات إيثيل إستر رباعي ميثيل رودامين (TMRE)

ملاحظة: في هذا البروتوكول ، يتم استخدام TMRE في وضع عدم التبريد بتركيز نهائي يبلغ 20 نانومتر. بشكل عام ، يجب استخدام أقل تركيز ممكن ل TMRE الذي لا يزال يوفر شدة إشارة كافية على المجهر المفضل. بسبب التبخر غير المتكافئ ، يمكن أن يختلف حجم الوسط في الآبار المختلفة في الثقافات الأولية طويلة الأجل. لضمان تركيز TMRE المتسق في جميع الآبار ، لا تضيف TMRE مباشرة إلى الآبار. بدلا من ذلك ، استبدل الوسط الموجود في كل بئر بنفس الكمية من الوسط المحتوي على TMRE. تم تصميم البروتوكول أدناه للخلايا العصبية الأولية في ألواح 24 بئرا تحتوي على ~ 1 مل من الوسط لكل بئر.

1. من خلال العمل في غطاء تدفق رقائقي لزراعة الأنسجة ، اجمع 500 ميكرولتر من الوسط من كل بئر في أنبوب مخروطي واحد.
2. لكل بئر ، أضف 0.5 ميكرولتر من مخزون TMRE 20 ميكرومتر في الأنبوب المخروطي (على سبيل المثال ، 12 ميكرولتر ل 24 بئرا).
3. استنشق الوسط المتبقي بعناية من البئر الأول واستبدله ب 500 ميكرولتر من الوسط المحتوي على TMRE. استمر ، جيدا ، مع الآبار المتبقية.
   ملاحظة: احرص على عدم ترك الخلايا تجف وعدم إزعاج الخلايا.
4. أعد الخلايا إلى الحاضنة وانتظر لمدة 60 دقيقة على الأقل لتحقيق توازن الصبغة.
   ملاحظة: يمكن تمديد وقت التحميل إلى عدة ساعات دون آثار ضارة.
5. لضمان تركيز TMRE وتوازن متسق طوال تجربة التصوير ، تأكد من تضمين تركيز نهائي يبلغ 20 نانومتر TMRE في المخزن المؤقت للتصوير وجميع محاليل التحفيز.

2. تحسين إعدادات المجهر متحد البؤر المسح

ملاحظة: تهدف هذه الخطوة إلى إيجاد أفضل حل وسط بين جودة الصورة وقابلية الخلية للبقاء أثناء التصوير المباشر. يصف هذا القسم تحسين إعدادات تصوير البروتين الفلوري الأخضر الحساس للأكسدة (roGFP). إذا تم إجراء تصوير متعدد المعلمات ، فيجب إجراء تحسين مماثل ، بما في ذلك التحقق من وجود خط أساس مستقر دون علامات التبييض أو السمية الضوئية ، للمؤشرات الإضافية.

1. ابدأ المجهر متحد البؤر وقم بتحميل الإعدادات القياسية لتصوير GFP (إثارة 488 نانومتر ، انبعاث 505 - 550 نانومتر).
2. اضبط الكاشف على 12 بت أو 16 بت. ملاحظه: عادة ، 8 بتات غير كافية للتصوير الكمي.
3. قم بتنشيط وضع المسح المتسلسل وأضف التسلسل / المسار الثاني (إثارة 405 نانومتر ، انبعاث 505 - 550 نانومتر).
4. بالنسبة لكلتا القناتين، حدد جدول بحث عن الألوان الزائفة يشير إلى وحدات البكسل ذات التعريض الزائد والمنخفض (على سبيل المثال، GLOW OU).
5. حدد هدفا مناسبا للموضوع محل الاهتمام.
   ملاحظة: 10x-40x مناسبة لتحليل الخلية الواحدة ، 63x-100x مناسبة لتحليل الميتوكوندريا الفردية.
6. قم بتركيب غطاء بالخلايا في غرفة التصوير ، وأضف 1 مل من المخزن المؤقت للتصوير ، وضع الغرفة على المجهر.
7. استخدم العدسة العينية والضوء المنقول لتركيز الخلايا.
   NOTE: لا تستخدم ضوء التألق لتحديد موقع الخلايا وتركيزها. حتى في حالة الطاقة المنخفضة ، سيؤثر هذا سلبا على الخلايا.
8. سجل الصور بتنسيقات بكسل مختلفة. بناء على هذه الصور ، حدد أقل رقم بكسل يعطي دقة مقبولة للبنية ذات الاهتمام.
   ملاحظة: عادة ما تعمل 512 × 512 بكسل بشكل جيد للتصوير أحادي الخلية مع أهداف 20x و 40x ، وعادة ما تعمل 1024 × 1024 أو 2048 × 2048 بكسل بشكل جيد للتصوير أحادي الميتوكوندريا بهدف 63x.
9. سجل الصور بأحجام ثقب مختلفة. بناء على هذه الصور ، حدد أكبر حجم ثقب يعطي دقة مقبولة للهيكل محل الاهتمام.
   ملاحظة: عادة ما تعمل 3-7 وحدات جيدة التهوية بشكل جيد.
10. سجل الصور بكثافة ليزر مختلفة.
    1. اضبط كسب الكاشف وعتبة وفقا لذلك. بناء على هذه الصور ، حدد أقل شدة ليزر تعطي شدة إشارة مقبولة ونسبة إشارة إلى خلفية.
       1. لتحديد نسبة الإشارة إلى الخلفية، قم بقياس شدة الإشارة في منطقة الاهتمام (ROI) التي تحتوي على خلايا أو الميتوكوندريا (ROI1) وفي عائد استثمار بدون خلايا أو ميتوكوندريا (ROI2). بعد ذلك ، اقسم شدة عائد الاستثمار 1 على شدة ROI2.
          >ملاحظة: استهدف نسبة الإشارة إلى الخلفية >3 وشدة الإشارة لعائد الاستثمار الفردي من 200-1,000 لإثارة 405 نانومتر مع طاقة ليزر 1-3٪ وشدة عائد الاستثمار الفردي من 300-1,500 لإثارة 488 نانومتر مع طاقة ليزر 1٪.
11. سجل الصور بسرعات مسح مختلفة وعدد متوسطات الإطارات. سجل 4-5 صور لكل مجموعة من الإعدادات. استنادا إلى سلسلة الصور هذه، حدد أعلى سرعة وأقل متوسط للإعدادات التي تعطي تشويشا مقبولا للصورة وتقلب من صورة إلى أخرى.
    ملاحظة: سرعة مسح ضوئي تبلغ 600 هرتز و1-2 إطار لمتوسط العمل بشكل جيد في معظم الحالات.
12. باستخدام قسيمة غلاف جديدة ، قم بتسجيل سلسلة بفاصل زمني بالإعدادات المحسنة.
    NOTE: يجب أن تشبه المدة والفاصل الزمني للصورة للسلسلة تلك الخاصة بالتجارب المخطط لها.
13. في نهاية سلسلة اللقطات المتتابعة، أضف 1 مل من محلول 2x ثنائي الأميرد (DA) إلى غرفة التسجيل. الصورة لمدة 2 دقيقة إضافية.
14. قم بشفط المخزن المؤقت للتصوير باستخدام مضخة تمعجية أو ماصة محمولة. أضف 1 مل من محلول 1x Dithiothreitol (DTT). الصورة لمدة 5 دقائق إضافية.
15. تحليل تجربة الفاصل الزمني.
    1. تحقق من أن أيا من القناتين لا تتعرض بشكل مفرط أو أقل أثناء معالجة DA- و DTT باستخدام الإعدادات المحسنة.
    2. تأكد من عدم ظهور أي من القناتين بشكل كبير من التبييض أثناء تسجيل الفاصل الزمني ؛ استهدف فقدان الكثافة بنسبة <2٪ بين الصور الأولى والأخيرة.
    3. تحقق من أن نسبة 405:488 لا تتغير بشكل كبير أثناء التصوير.
16. كرر الإجراء بأكمله بطريقة تكرارية، باستخدام العديد من أغطية، حتى يتم تحديد الإعدادات التي توفر نتائج مقبولة باستمرار.

3. تقييم حالة الأكسدة والاختزال القاعدية

1. ابدأ المجهر وقم بتحميل الإعدادات المحسنة من القسم 2.
2. اضبط متوسط الإطار على 3-5.
3. قم بتركيب غطاء بالخلايا في غرفة التصوير ، وأضف 1 مل من المخزن المؤقت للتصوير ، وضع الغرفة على المجهر.
4. استخدم العدسة العينية والضوء المنقول لتركيز الخلايا.
   NOTE: لا تستخدم ضوء التألق لتحديد موقع الخلايا وتركيزها. حتى في حالة الطاقة المنخفضة ، سيؤثر هذا سلبا على الخلايا.
5. قم بالتبديل إلى وضع المسح واستخدم قناة 488 نانومتر في المنظر المباشر للتركيز وتحديد موقع الخلايا للتصوير.
6. استخدم وظيفة النقاط المتعددة لتحديد 3-5 مجالات رؤية على قسيمة الغطاء.
7. سجل صورة أساسية.
8. أضف 1 مل من محلول 2x DA إلى الغرفة.
9. بعد 1 و 2 و 3 دقائق ، استخدم العرض المباشر لتأكيد / ضبط التركيز ثم تسجيل صورة.
   ملاحظة: عادة ما تتأكسد الخلايا بالكامل بعد دقيقتين.
10. استبدل المخزن المؤقت في غرفة التصوير ب 1 مل من محلول 1x DTT.
11. بعد 3 و 5 دقائق ، استخدم المنظر المباشر لتأكيد / ضبط التركيز ثم تسجيل صورة.
    ملاحظة: عادة ما يتم تقليل الخلايا بالكامل بعد 4-5 دقائق.

4. التصوير الحي للعلاجات الحادة

ملاحظة: يصف البروتوكول أدناه تصوير استجابة الأكسدة والاختزال في الميتوكوندريا لعلاج NMDA. قد تحتاج الفواصل الزمنية للصور ومدة التجربة إلى التعديل لعلاجات أخرى.

1. ابدأ المجهر وقم بتحميل الإعدادات المحسنة من القسم 3.
2. اضبط الفاصل الزمني للفاصل الزمني على 30 ثانية والمدة على 25 دقيقة.
3. قم بتركيب غطاء به خلايا في غرفة التصوير ، وأضف 1 مل من المخزن المؤقت للتصوير ، وضع الغرفة على المجهر.
   ملاحظة: لتجنب انجراف التركيز الحراري ، اترك الخلايا على مرحلة المجهر لمدة 10-15 دقيقة قبل بدء التصوير بفاصل زمني.
4. استخدم العدسة العينية والضوء المنقول لتركيز الخلايا.
   NOTE: لا تستخدم ضوء التألق لتحديد موقع الخلايا وتركيزها. حتى في حالة الطاقة المنخفضة ، سيؤثر هذا سلبا على الخلايا.
5. قم بالتبديل إلى وضع المسح الضوئي واستخدم قناة 488 نانومتر في المنظر المباشر للتركيز وتحديد موقع الخلايا للتصوير.
6. اختياري: لزيادة عدد الخلايا المسجلة في كل تشغيل، استخدم الدالة متعددة النقاط لتصوير 2-3 حقول رؤية لكل قسيمة غطاء.
7. ابدأ الحصول على الفاصل الزمني وسجل 5 صور كتسجيل أساسي لمدة دقيقتين.
8. أضف 500 ميكرولتر من محلول 3x NMDA إلى الغرفة (التركيز النهائي 30 ميكرومتر) وسجل 20 صورة إضافية كاستجابة NMDA لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: الخلايا العصبية حساسة جدا للتغيرات في الأسمولية. لذلك ، تأكد من تقليل تبخر المخزن المؤقت للتصوير. للعلاجات الأطول ، يجب تغطية غرفة التصوير بغطاء.
9. أضف 500 ميكرولتر من محلول 4x DA إلى الغرفة وسجل 6 صور أخرى (معايرة 3 دقائق كحد أقصى).
10. استنشق المخزن المؤقت من غرفة التصوير واستبدله ب 1 مل من محلول 1x DTT. سجل 10 صور أخرى (معايرة 5 دقائق كحد أدنى).
11. قم بإنهاء التسجيل واحفظ سلسلة الصور.

المواد