الحقن المجهري لدماغ القوارض باستخدام إبرة كوارتز دقيقة

الملخص

المصدر: Paolone، G.، et al. إبر مخصصة للحقن المجهري في دماغ القوارض. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو حقن الإبرة الدقيقة في دماغ القوارض باستخدام إبرة كوارتز دقيقة بها ثقوب. يتم توصيل الإبرة الدقيقة بحقنة ومضخة صغيرة للتحكم في معدل التسليم. يتم إدخال الإبرة بمحلول الحقن في الدماغ مع ضبط سرعة التوصيل على منخفضة. بمجرد وضعه ، يتم زيادة سرعة التسليم. يتم سحب الإبرة بعد توقف قصير.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تحضير إبر الكوارتز

1. قم بتنظيف وتعقيم الشعيرات الدموية الكوارتز (انظر جدول المواد) عن طريق وضعها لمدة 5 دقائق في الماء المقطر ، و 5 دقائق في الإيثانول 99٪ ، و 5 دقائق في ثنائي إيثيل الأثير.
2. اترك الشعيرات الدموية تحت الغطاء لمدة 1 ساعة على الأقل حتى تجف تماما.
3. قم بإعداد الإبر باستخدام مجتذب ليزر وفقا للمعايير التي تسمح بإنتاج إبرة طويلة بما فيه الكفاية ورفيعة بما فيه الكفاية ، اعتمادا على الاحتياجات الفردية.
   ملاحظة: نستخدم مجتذب ليزر (انظر جدول المواد). استخدم برنامجا من سطرين للسحب. يستخدم السطر الأول طاقة عالية ، وأكبر طول مسح (يتوافق مع قيمة الفتيل) ، ولا توجد قوة سحب. يؤدي هذا المزيج من المعلمات إلى ذوبان الجزء الأكبر من الشعيرات الدموية بأقل سرعة تمديد ، مما يسمح بتشكيل إبرة طويلة ذات حجم داخلي / خارجي كبير وساق منخفضة. بهذه الطريقة ، تحافظ الإبرة على مقاومة ميكانيكية عالية وقطر داخلي واسع يسمح بمرور الخلايا الجذعية أو الجزيئات الفيروسية دون انسداد. يجب أن توقف سرعة وتأخير خط البرنامج هذا الامتداد الشعري قبل أن يصبح الطرف صغيرا جدا وطويلا ، ويفقد الخصائص الميكانيكية والشكل المطلوبة. يتم تنفيذ السطر الثاني من برنامج السحب تلقائيا بمجرد أن يبرد الكوارتز (5 ثوان). تعمل معلمات القوة والفتيل وقوة السحب لقطع طرف بأقصر طول ممكن للطرف وساق شديدة الانحدار ، وتجنب فصل الإبرتين مع تمزق الطرف. بشكل روتيني ، مع معداتنا ، نستخدم ما يلي: (أ) الخط 1 = القوة 990 ، الفتيل 5 ، السرعة 130 ، التأخير 110 ، السحب 0 ؛ (ب) السطر 2 = القوة 970 ، الفتيل 3 ، السرعة 0 ، التأخير 70 ، السحب 0.
4. ضع الإبر في طبق بتري تم تنظيفه مسبقا بنسبة 70٪ من الإيثانول.
   1. قم بتغطية الطبق بغشاء بلاستيكي من البارافين.
5. قطع الشعيرات الدموية مع التشريح الدقيق.
   1. عند بدء التشغيل، دع الليزر يقوم بتشغيل عملية معايرة تلقائية للتحقق من الطاقة والطاقة التي يتم توصيلها. بعد ذلك ، قم بتعيين معلمات القطع.
      ملاحظة: نستخدم تشريحا دقيقا (انظر جدول المواد) والمعلمات التالية: طاقة نبض طاقة الليزر (63 ميكروجول) ، وقطر شعاع الليزر 20٪ من الفتحة القصوى (الفتحة القصوى: 1.0 ميكرومتر) ، وسرعة القطع بنسبة 10٪ من السرعة القصوى (السرعة القصوى: 30 ميكرومتر / ثانية).
   2. قم بتثبيت الإبرة بإحكام على طاولة المجهر وضع طرفها في وسط شاشة الكمبيوتر.
   3. في شريط القائمة ، انقر فوق رمز القلم الرصاص واستخدمه لرسم علامة لقطع الإبرة بالليزر.
      ملاحظة: يجب أن يكون القطع بزاوية حوالي 45 درجة فيما يتعلق بسطح الإبرة.
   4. في وظيفة الشريط الجانبي ، حدد العلم الذي يحتوي على زر "START CUT" للسماح لليزر بقطع البقعة المحددة مسبقا.
   5. إذا لزم الأمر ، قم بقطع الثقب (الثقوب) الجانبية عن طريق تكرار الإجراءات الموضحة في 1.5.2-3 ؛ ليست هناك حاجة لإعادة وضع الإبرة (الشكل 1).
6. التنظيف بعد القطع.
   1. قم بتوصيل الإبرة بمضخة فارغة من خلال أنبوب بلاستيكي.
   2. قم بتشغيل المضخة واضبط معدل التدفق الأمامي يدويا بسرعة معتدلة (3 ميكرولتر / دقيقة).
   3. استنشق الإيثانول بنسبة 99٪ أولا ثم الماء المقطر لإزالة الشوائب الناتجة عن القطع.
   4. استنشق الإيثانول بنسبة 99٪ مرة أخرى لتسهيل التجفيف.
      ملاحظة: يجب أن تستمر كل خطوة لمدة 3 دقائق على الأقل.
7. قم بتخزين الإبر في طبق بتري مغطى بشكل صحيح حتى يوم الجراحة.
8. يمكن إعادة استخدام الإبر ؛ في نهاية التجربة ، قم بتنظيفها باستخدام المبيض والإيثانول لإزالة المحلول وبقايا الأنسجة المحتملة. لتنظيف أكثر اكتمالا ، ضع الإبر في وعاء تخزين ماصة دقيقة مع توجيه الطرف لأسفل ، واملأ البرطمان بالماء المقطر حتى يتم تغطية الأطراف ، واتركه يغلي لمدة 1.5 دقيقة لإزالة أي بقايا من الأنسجة ، ثم اغسلها بالإيثانول.

2. الإجراء باتباع

1. التعليمات المقدمة في دليل مستخدم المضخة ، حدد قائمة الإعدادات لمعايرة المضخة وفقا لقطر / حجم حقنة الحقن المجهري واضبط معدل التدفق على 0.3 ميكرولتر / دقيقة.
2. املأ حقنة سعة 10 مل مزودة بإبرة حادة (على سبيل المثال ، إبرة هاميلتون ، 30 جم) وأنبوب بولي تترافلورو إيثيلين قصير بالماء المعقم واستخدمه لملء حقنة الحقن المجهري (بعد إزالة المكبس بحذر شديد) ومجموعة أجزاء تجميع الحقن لمضخة الحقن الدقيق اليدوية (MMP).
   ملاحظة: يتم استخدام مجموعة MMP لتركيب الإبرة بشكل آمن في الإطار التجسيمي (الشكل 2). تشتمل المجموعة على أنبوب بولي تترافلورو إيثيلين ، ومقرنة luer إلى أنبوب ، وحامل ماصة ، وحشيات للماصات بأقطار خارجية مختلفة.
3. قم بتوصيل الإبرة بمجموعة MMP.
   1. اغسل المزيد من الماء عبر النظام من خلال المحقنة سعة 10 مل ، وتحقق مما إذا كان الماء يخرج من الإبرة.
      NOTE: تأكد من إزالة أي فقاعات هواء داخل النظام عن طريق تكرار خطوات التعبئة.
4. افصل المحقنة سعة 10 مل من حقنة الحقن المجهري مع دفع المكبس ببطء لترك قطرة ماء في الجزء العلوي من حقنة الحقن المجهري. أدخل المكبس في حقنة الحقن المجهري.
5. قم بتوصيل حقنة الحقن الدقيق بالمضخة واضبط معدل التدفق على 0.3 ميكرولتر / دقيقة.
   ملاحظة: انتظر حتى تتسرب قطرة من طرف الإبرة ، ثم اتركها لمدة 3 دقائق أخرى.
6. اضبط التدفق على 0.1 ميكرولتر / دقيقة وابدأ إجراء الجراحة. يجب أن تعمل المضخة أثناء إجراء الجراحة.
   ملاحظة: بالنسبة للتجارب التي تم الإبلاغ عنها في هذه المقالة ، نستخدم ذكور فئران Sprague Dawley التي يبلغ وزنها 300 جرام (3 أشهر من العمر). ومع ذلك ، فإن الإجراء ينطبق على الأنواع الأخرى ، والفئران على وجه الخصوص.
7. الحث على التخدير العام باستخدام طريقة معتمدة من قبل اللوائح المحلية.
   ملاحظة: نستخدم مزيجا من الحقن داخل الصفاق (IP) من 85 مجم / كجم من الكيتامين و 8 مجم / كجم زيلازين لمدة 20-50 دقيقة من التخدير. من المهم استخدام قرصات الذيل و / أو أصابع القدم لضمان تخدير بالكامل. يتم تقييم مستوى التخدير والمؤشرات الحيوية الأساسية قبل بدء الجراحة ومراقبتها كل 10 دقائق أثناء إجراء الجراحة. يتم الحفاظ على درجة حرارة جسم ثابتة قبل وأثناء وبعد العمليات الجراحية باستخدام وسادة تسخين إعادة تدوير المياه. تتم مراقبة حتى تتعافى تماما (على سبيل المثال ، فهي منتصبة ومتنقلة). بالإضافة إلى ذلك ، تتلقى المسكنات (ترامادول ، 5-7 مجم / كجم IP) بعد الجراحة كل 24 ساعة لمدة ثلاثة أيام.
   1. احلق رأس وجهز موقع الجراحة بشكل كاف للجراحة المعقمة. قم بإجراء فرك على مرحلتين بمحلول قائم على اليود (بيتادين) متبوعا بنسبة 70٪ إيثانول. علاوة على ذلك ، للحفاظ على التعقيم ، لف موقع الجراحة بسترى جراحية (تم حذف الفيديو لأغراض العرض التوضيحي).
8. ضع الجرذ في الإطار التجسيمي فوق بطانية تسخين لإعادة تدوير الماء. لتوفير تخفيف إضافي للألم ، في موقع الجراحة ، ضع محلول ليدوكائين 0.5٪ (لا تتجاوز 7 مجم / كجم). قم بالتعقيم المسبق لجميع الأدوات الجراحية باستخدام معقم الخرز أو التطهير السائل البارد عن طريق غمر الجهاز إما في 2٪ جلوتارالديهايد بالإضافة إلى 7.05٪ فينول (Sporodicin أو Cidex) ، متبوعا بشطفه بالماء المعقم أو المحلول الملحي. يجب إجراء التطهير حتى بين الإجراءات. قم بعمل قطع طولي على الجمجمة باستخدام مشرط معقم. كن لطيفا لتجنب النزيف المفرط. افتح فروة الرأس باستخدام ملعقة مسطحة وقم بتطبيق مشابك جراحية على سدائل الجلد لإبقائها مفتوحة. برفق شديد ، افصل السمحاق لفضح البريجما ومنطقة الجمجمة التي سيتم من خلالها إدخال الإبرة.
9. قم بتركيب الذراع على الإطار التجسيمي (أثناء استمرار التدفق) وحرك طرف الإبرة بالضبط أعلى البريجما ، مع الانتباه إلى عدم كسر طرفها. على الإحداثيات الأمامية الخلفية والمتوسطة الجانبية للبريجما وترجمها إلى الإحداثيات المطلوبة. مسترشدا بمجهر مجسم ، اخفض الإبرة حتى يلامس طرفها الجمجمة تقريبا ، وقم بتمييز بقعة الحفر بعد رفع الذراع التجسيمية قليلا.
10. حفر (طرف الحفر Ø: 0.8 مم ؛ سرعة الحفر: 1,000 دورة في الدقيقة) الجمجمة في المكان المحدد. يجب الحرص على عدم اختراق الجافية أثناء إجراءات الحفر. أثناء الحفر ، قم بالتنقيط بالمحلول الملحي المعقم لتجنب تلف العظام والنخر.
11. قطع قطعة صغيرة من فيلم البارافين البلاستيكي ووضعها على الجمجمة. باستخدام الماصة سعة 10 ميكرولتر، اصنع قطرة من المحلول للحقن على طبقة البارافين البلاستيكية. أوقف المضخة ، واسترجع دافع المضخة قليلا وقم بإنشاء فقاعة هواء صغيرة في الشعيرات الدموية عن طريق سحب مكبس حقنة الحقن المجهري برفق.
12. اخفض الذراع التجسيمية حتى يصل طرف الإبرة إلى القطرة. ارسم العينة عن طريق سحب مكبس حقنة الحقن المجهري (ببطء شديد) ، وتجنب أي تكوين فقاعة. استبدل دافع المضخة الملامس للمكبس وقم بتشغيل المضخة بمعدل تدفق 0.3 ميكرولتر / دقيقة. انتظر تكوين قطرة (بضع دقائق) قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
    ملاحظة: في تجربة المثال الحالية ، تم حقن السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF) في المخطط [AP (الأمامي الخلفي): +1.5 ، ML (الوسطي الجانبي): ±2.7; DV (الظهري البطني): -5.0] وفي الحصين الظهري (AP: -3.5 ، ML: ±2.1 ؛ DV: -3.5 ؛ بالملم من الجافية) ، 2 ميكرولتر / موقع. لتسهيل المقارنة بين طريقتي الحقن ، تم غرس كل منطقة من مناطق الدماغ باستخدام إبرة كوارتز في نصف الكرة الأرضية وطرف غير حاد 26 جم أو إبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ ذات طرف مائل 30 جم في النصف الآخر.
13. اخفض التدفق إلى 0.1 ميكرولتر / دقيقة ، وقم بتقطيع الجافية بإبرة مخروطية من الفولاذ المقاوم للصدأ وقم بخفض الذراع التجسيمية ببطء على الفأس الظهري البطني ، ودخول أنسجة المخ. عند الوصول إلى الموضع المطلوب ، انزل 0.1 مم إضافيا ، وأوقف المضخة ، وارفع الذراع التجسيمي بمقدار 0.1 مم وابدأ المضخة مرة أخرى عند التدفق إلى 0.3 ميكرولتر / دقيقة
    ملاحظة: سبب الحفاظ على تدفق بطيء أثناء خفض الإبرة هو ضمان ضغط إيجابي يتجنب تغلغل شظايا صغيرة من الأنسجة في الإبرة نفسها. مثل هذا الحدث من شأنه أن يعيق الطرف ، مما يضعف توصيل المحلول. نظرا لأن معدل التدفق بطيء جدا أثناء خفض الإبرة وسرعة الخفض حوالي 10 ثانية / مم ، فهذا يعني أن كميات المحلول المتبقية على طول مسار الإبرة لا تكاد تذكر مقارنة بتلك التي يتم حقنها في الموقع المستهدف. يمكن تجنب هذا الاحتياط عند استخدام الإبر ذات الثقوب الجانبية.
14. ابدأ المؤقت وانتظر الوقت المطلوب اعتمادا على الحجم المطلوب للحقن (على سبيل المثال ، 6 دقائق و 40 ثانية في حالة حقن 2 ميكرولتر). راقب حركة الفقاعة أثناء الحقن. في النهاية ، أوقف المضخة وانتظر 5 دقائق قبل استرداد الإبرة ببطء. عندما يتم استخراج إبرة الكوارتز بالكامل ، ابدأ تشغيل المضخة مرة أخرى وتحقق من تكوين قطرة عند طرف الإبرة.
15. أغلق الفتحة الموجودة في سطح الجمجمة بشمع العظام ، وقم بإزالة المشابك المرقئة وخياطة فروة الرأس ، وقم بتغطية المنطقة المحيطة بالجرح بكريم مضاد حيوي (على سبيل المثال ، نيوسبورين) وأعد إلى قفص المنزل.

النتائج

فئة الشكل = 'الصورة image_resized image-style-align-center' style='display: table؛ margin-left: auto؛ margin-right: auto ؛ width: 75٪ ؛ '>

الشكل 1: صورة مجهرية لطرف إبرة كوارتز ، تظهر أقطار مختلفة من الطرف والثقوب المستخدمة في حقن السوائل. صورة تكبير منخفضة في (A) وتكبير أعلى في (B) و (C). يمكن تحضير الإبرة بطرق مختلفة (أطوال مختلفة وأرقام ثقوب وأبعاد ثقب) وفقا لتشر...

المواد