التصوير ثلاثي الأبعاد للخلايا النجمية ذات العلامات المناعية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر

Abstract

المصدر: Bagheri, M., et. al. بروتوكول التحليل المورفومتري متحد البؤر ثلاثي الأبعاد للخلايا النجمية. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو تصوير الخلايا النجمية المصنفة بالفلورسنت في قسم دماغ الفأر باستخدام مجهر متحد البؤر. يتم وضع قسم الدماغ تحت العدسة الموضوعية المناسبة ، ويتم اختيار الفلوروفورات والمرشحات المناسبة. بعد تحسين التعرض تلقائيا ، يتم تحديد معلمات المسح الضوئي لضمان صور ثنائية الأبعاد عالية الدقة. يتم تكوين معلمات Z-stack ، ويتم الحصول على صور ثلاثية الأبعاد.

Protocol

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. والجراحة ومستحضرات العينات

ملاحظة: تحضير أنسجة المخ للتحليل المجهري متحد البؤر ثلاثي الأبعاد (3D).

1. قسم بشكل عشوائي إلى مجموعتين: الأميلويد بيتا (Aβ) _1-40\u2012 الحقن (ن = 8) ، و Aβ_1-40 \u2012 الحقن مع علاج الجينيستين (ن = 8) ؛ إعطاء الجينيستين (10 مجم / كجم مخفف في مركبة مثل زيت الخروع متعدد الإيثوكسيلات) عن طريق التزقيم قبل ساعة واحدة من الجراحة.
2. تخدير بالكيتامين (100 مجم / كغ) والزيلازين (10 مجم / كغ). تأكد من التخدير المناسب من خلال عدم وجود منعكس انسحابي بعد الضغط على إصبع القدم. استخدم مرهما على العينين أثناء الجراحة لمنع الجفاف.
3. ضع في جهاز تجسيمي وحلق الرأس. ضع محلول اليود لتنظيف فروة الرأس قبل الشق وحافظ على موقع العملية معقما أثناء الجراحة لتقليل خطر الإصابة بالعدوى. حقن Aβ_1-40 بشكل تجسيمي (4 ميكرولتر) في الحصين عند -3.5 مم خلف بريجما ، ± 2 مم جانبيا لخط الوسط ، و -2.8 مم تحت الجافية ، وفقا لأطلس دماغ الفئران.
4. توفير المراقبة / الرعاية بعد الجراحة حتى تصبح واعية تماما لضمان راحة. حافظ على دفء أثناء التعافي ، ولا تعيدها إلى قفص مع الأخرى حتى الشفاء التام. انتبه إلى أي علامات للعدوى في بعد الجراحة.
5. تخدير بعمق بالكيتامين (150 مجم / كجم) بعد ثلاثة أسابيع من الجراحة. قم بإجراء تثبيت عبر القلب عن طريق حشو بنسبة 0.9٪ محلول ملحي متبوعا ب 4٪ بارافورمالدهيد في محلول ملحي عازل للفوسفات 0.1 M أو PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4) ، ثم قم بإزالة الدماغ وإصلاحه.
6. بعد إصلاح الأدمغة في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 2-3 أيام عند 4 درجات مئوية.
7. قم بتضمين الأنسجة في كتل البارافين باستخدام معدات تضمين الأنسجة ، وتجنب نقص ملء الكاسيت أو الإفراط في ملئه لأنه قد يتداخل مع المحاذاة أو التقسيم الصحيح. انتبه إلى اتجاه الأنسجة في كتلة البارافين.
   ملاحظة: الحصين الفئران ، على سبيل المثال ، قريب من الجزء الخلفي من نصف الكرة الدماغية. وبالتالي ، يجب تضمين الأنسجة بطريقة تبدأ فيها التقسيم في الجزء الخلفي من الدماغ. استخدم أطلس Paxinos كدليل للوصول إلى البنية التشريحية المطلوبة.
8. ضع الميكروتوم بعيدا عن التيارات الهوائية أو المداخل لأن حركات الهواء تجعل التعامل مع الأقسام أمرا صعبا.
9. استخدم أقساما بسمك ≥20 ميكرومتر ، حيث سيكون هذا العمق ضروريا لإنتاج صور Z-Stack للخلايا النجمية الكاملة. لا تستخدم القسمين الأولين ، حيث قد يكون لهما سمك غير مرغوب فيه بسبب التمدد الحراري.
10. ضع الأقسام على سطح الماء الدافئ (5 ± 2 درجة مئوية ، تحت درجة حرارة انصهار البارافين) لفترة كافية لتسطيح الأقسام.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي التوسع المفرط للقسم إلى إزعاج مورفولوجيا الهيكل. استخدم فرشاة رسم صغيرة لنقل الأقسام بعناية. اجمع قسمين إلى ثلاثة أقسام في كل شريحة.
11. قم بتخزين الشرائح في رف عمودي واتركها تجف عند 37 درجة مئوية لعدة ساعات أو طوال الليل (O / N).

2. الكيمياء المناعية

إزالة

1. البارافينات من الأقسام في الزيلين ، 2 × 10 دقائق ، وإعادة الترطيب من خلال تدرج الكحول (99.8٪ ، 95٪ ، و 70٪ ، 10 دقائق لكل منهما) و PBS.
2. احتضان بالأجسام المضادة ضد البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) المخفف 1: 1،500 في PBS يحتوي على 0.25٪ ألبومين مصل بقري (BSA) ، 0.25٪ Triton X-100 ، و 3.5٪ مصل طبيعي (O / N عند 4 درجات مئوية).
3. اغسل الأقسام في PBS لمدة 3 × 5 دقائق.
4. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفوسفات القلوي لمدة 1 ساعة (1: 100 ، 21 درجة مئوية ، مخففة في PBS).
5. اغسل الأقسام في PBS لمدة 3 × 5 دقائق
   ملاحظة: من المهم غسل الأقسام بشكل صحيح بعد الأجسام المضادة الثانوية لتقليل تلطيخ الخلفية.
6. احتضان الأقسام في الظلام باستخدام الكروموجين الأحمر الدائم السائل (15-20 دقيقة).
   ملاحظة: قم بإعداد المحلول قبل الاستخدام بمدة لا تزيد عن 30 دقيقة.
7. اغسل الأقسام في PBS لمدة 3 × 5 دقائق.
8. أخيرا ، قم بتلطيخ النوى ب 4-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ؛ 1: 500 ، مخفف في PBS) قبل انزلاق الغطاء. قم بتخزين الشرائح في الثلاجة لمدة 24-48 ساعة قبل الفحص المجهري.

3. الفحص المجهري متحد البؤر

ملاحظة: للتقييم الكمي (انظر أدناه) ، حدد خلية نجمية ذات نواة ملطخة بوضوح ب DAPI مع الحد الأدنى من الفروع المتداخلة لتقليل مخاطر الأخطاء. يستغرق إنتاج صور Z-Stack وقتا طويلا. تحلى بالصبر ولا تتوقف أثناء المعالجة. يستخدم مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر المستقيم لإنشاء صور ثلاثية الأبعاد للخلايا النجمية.

1. ضع الشريحة على مرحلة المجهر وحدد هدف 63X.
2. افتح برنامج التصوير وانقر فوق بدء النظام. انقر فوق علامة التبويب تحديد الموقع. انتقل إلى تعيين وحدد GFP لضبط الإضاءة المناسبة.
3. افتح الغالق لعكس الضوء. ابحث عن مسدس العاكس على الجانب الأيمن من الغالق واختر اللون الذي يجب أن تنعكس بواسطة الخلايا النجمية (أخضر أو أحمر أو بنفسجي) ؛ تم استخدام اللون الأحمر (FSet20 wf) هنا.
   ملاحظة: لا تنس تركيز الصورة مباشرة في عين المجهر.
4. للعثور على أفضل تركيز ، انقر فوق All Closed ، ضع دبوس المجهر في وضع الشاشة ، وانقر فوق علامة التبويب Acquisition.
5. انقر فوق الإعداد الذكي ضمن علامة التبويب اكتساب ؛ تفتح نافذة. حدد الفلوروفور المناسب (أي DAPI و Alexa Fluor 555 ، في المشروع الحالي) من القائمة. يتم تحديد اللون تلقائيا.
6. انقر فوق أفضل إشارة وتطبيق ، ثم انقر فوق تعيين التعرض ؛ سيقوم الكمبيوتر بعد ذلك بتعيين معلمات التعريض الضوئي تلقائيا.
7. لتحسين الصورة ، انتقل إلى نافذة القنوات. قم بإلغاء تحديد المسار 2 ، وقم بتمييز Track1 وانقر فوق Live. ركز على الصورة إذا لزم الأمر.
8. في نافذة القنوات ، اضبط المفاتيح التالية ؛ انقر فوق 1AU لتحسين الثقب تلقائيا. من المهم جدا القيام بهذه الخطوة وإلا فإن الصور متحدة البؤر ستكون غير مثالية. اضبط الكسب للحصول على أفضل كثافة (حافظ على هذا الإعداد أقل من 800 لتقليل الضوضاء الزائدة). أخيرا ، اضبط الكسب الرقمي بين 2 و 3.
9. قم بإلغاء تحديد Track1 ، وانقر فوق Track2 ، وكرر الخطوة 3.8 ل Track2. ثم توقف عن البث المباشر.
10. انتقل إلى نافذة وضع الاكتساب. قم بتحسين الصورة عن طريق تحسين حجم الإطار والمتوسط. لتغيير حجم الإطار ، انتقل إلى X * Y وحدد 1,024 × 1,024. اختر سرعة بطيئة لإنشاء صورة أفضل.
11. انتقل إلى متوسط المؤشرات وحدد الرقم ≥4. تشير قيمة المتوسط هذه إلى عدد عمليات الفحص التي سيتم حساب متوسطها لإنتاج الصورة المكتسبة. الآن ، انقر فوق الزر "Snap" واحفظ الصورة ثنائية الأبعاد الملتقطة.
12. للتصوير ثلاثي الأبعاد، ضع علامة على عنصر Z-Stack ضمن Smart Setup، مما يؤدي إلى فتح نافذة Z-Stack.
13. قم بتعيين الموضعين الأول والأخير ل Z-Stack ، أي عمق الخلية. أولا ، انقر فوق Live. ثم استخدم محرك التركيز البؤري للمجهر للتركيز على الموضع العلوي للخلية النجمية في الأنسجة ، حيث يبدأ Z-Stack. انقر فوق تعيين أولا. بعد ذلك ، ركز لأسفل على أدنى موضع للخلية النجمية في الأنسجة ، حيث يجب إيقاف فحص Z-Stack. انقر فوق تعيين الأخير. ثم توقف عن البث المباشر.
14. اختر الفاصل الزمني ؛ يتم استخدام 1.01 ميكرومتر في الدراسة الحالية ؛ يمكن اختيار الفاصل الزمني بالنقر فوق الأمثل لتعيين عدد الشرائح.
15. انقر فوق بدء التجربة. احفظ الصور بمجرد اكتمال الفحص. سيتم استخدام هذه الصورة لقياس المعلمات التالية: مساحة السطح وحجم منطقة الخلايا النجمية ، بالإضافة إلى الخلايا النجمية بأكملها ، بما في ذلك الفروع وجسم الخلية والنواة.

Materials