توصيل siRNA المستهدف إلى الخلايا العصبية لإسكات بروتين البريون باستخدام المجمعات الشحمية

الملخص

المصدر: Bender، H. R.، et.al. توصيل siRNA العلاجي إلى الجهاز العصبي المركزي باستخدام الجسيمات الشحمية الموجبة والأيونية. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو التوصيل المستهدف لبروتين البريون (PrP) siRNA إلى الخلايا العصبية باستخدام مجمعات siRNA-الببتيد الشحمية (LSPCs). تربط الجسيمات الشحمية الموجبة siRNA التي تستهدف PrP إلكتروستاتيكيا ، والتي يتم تثبيتها بشكل أكبر بواسطة الببتيد RVG-9r للنقل بوساطة المستقبلات عبر الحاجز الدموي الدماغي. بمجرد دخولها الدماغ ، تخضع LSPCs للالتقام الخلوي في الخلايا العصبية ، وتطلق siRNA لبدء تداخل الحمض النووي الريبي ، مما يقلل من تعبير PrP ويقطع تطور مرض البريون.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تحضير LSPCs

1. استخدم 1: 1 DOTAP (1،2-dioleoyl-3-trimethylammonium-proban): نسبة الكوليسترول ل LSPCs. لتحضير الجسيمات الشحمية 4 نانومول ، امزج 2 نانومول من DOTAP و 2 نانومول من الكوليسترول في 10 مل من محلول الكلوروفورم 1: 1: الميثانول في قارورة.
2. تبخر 9 مل من محلول الكلوروفورم: الميثانول باستخدام غاز N₂ في غطاء الدخان. تبخر آخر 1 مل من المذيب في غطاء الدخان طوال الليل بدون غاز. لاحظ طبقة دهنية رقيقة في الجزء السفلي من القارورة.
3. سخني 10 مل من محلول السكروز 10٪ إلى 55 درجة مئوية.
4. صب محلول السكروز الساخن بنسبة 10٪ على طبقة الدهون الرقيقة ببطء ، أي 1 مل / دقيقة ، مع تحريك القارورة برفق. حافظ على 10٪ من السكروز والقارورة مع الدهون عند 55 درجة مئوية حتى تظل جزيئات الدهون في مرحلة الهلام السائل. ينتج عن الإماهة تكوين حويصلة متعددة الصفائح (MLV).
5. اسمح للدهون بإعادة الترطيب عند 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل تحديد حجم الجسيمات الشحمية.
6. قم بتجميع الطارد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام مرشحات 1.0 ميكرومتر أو استخدم مرشحات حقنة 1.0 ميكرومتر للتحجيم.
7. أضف 1 مل من تعليق الجسيم الشحمي الساخن إلى إحدى المحاقن الموجودة على الطارد وقم بتمرير التعليق بين المحاقن 11 مرة. تأكد من أن التعليق في المحقنة المعاكسة للحقنة البدائية بعد 11 تمريرة.
8. قم بقياس الجسيمات الشحمية مرة أخرى من خلال مرشحات 0.45 ميكرومتر ثم 0.2 ميكرومتر لتوليد حويصلات أحادية الصفيحة كبيرة (LUVs). حافظ على تسخين معلق الجسيم الشحمي لتسهيل التحجيم.
9. احتضان 20 ميكرولتر من معلق الجسيمات الشحمية 4 نانومول (200 ميكرومتر) مع 200 ميكرولتر من محلول siRNA للمخزون 20 ميكرومتر (إجمالي 4 نانومول) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
10. احتضان 80 ميكرولتر من محلول RVG-9r سعة 500 ميكرومتر (إجمالي 40 نانومول) مع محلول siRNA / الجسيم الشحمي لمدة 10 دقائق في RT. يجب استخدام LSPCs في أسرع وقت ممكن ولكن يمكن استخدامها لمدة تصل إلى عدة ساعات بعد التحضير. قم بتخزين LSPCs على حرارة 4 درجات مئوية لعدة ساعات بعد التحضير.

2. حقن الفئران ب LSPCs

1. قم بتعريض الفئران لمدة 5-10 دقائق إلى مصباح حراري لتوسيع الأوعية الدموية.
2. قم بتخدير الفأر بتدفق الأيزوفلوران / الأكسجين بنسبة 2-3٪ قبل 5-10 دقائق من الحقن وأثناء الحقن. تأكد من التخدير عندما لا يكون متنقلا ، وتباطأ التنفس ، عن طريق الضغط على إصبع القدم. ضع الماوس على ظهره أو جانبه للوصول إلى وريد الذيل. استخدم مرهما بيطري على عيون الفأر لمنع الجفاف أثناء التخدير.
3. امسح / رش الذيل بنسبة 70٪ EtOH وحقن 300 ميكرولتر من LSPCs على وريد ذيل الفأر باستخدام حقنة أنسولين 26 جم. ابدأ في الحقن بعيدا في الوريد الذيل وتحرك بالقرب من الوريد أو تمزق.
4. ضع الماوس في قفص نظيف حتى يحافظ على الرق القصي. لا تضع الفأر مع زملائه الآخرين في القفص حتى يتعافى تماما. يجب أن تتعافى الفئران في غضون 5 إلى 15 دقيقة. يمكن وضعها على وسادة تدفئة أو تحت مصباح حراري للحفاظ على درجة حرارة الجسم إذا استغرق التعافي وقتا أطول. يجب مراقبة الفئران عن كثب للحماية من ارتفاع درجة الحرارة.
5. راقب بعد عدة ساعات من الحقن للتأكد من زوال التخدير ، وعدم وجود آثار سيئة للعلاج. اسمح ل LSPCs بالدوران لمدة 24 ساعة على الأقل.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DOTAP lipidAvanti Lipids890890 CholesterolAvanti Lipids700000 ChloroformFisher ScientificAC268320010 MethanolEMD Millipore113351 N₂ غازالهواء السكروزفيشر ScientificS5-500 الطاردAvanti Lipids610023 مرشحات 1.0 و 0.4 و 0.2 ميكرومترAvanti Lipids610010 ، 610007 ، 610006