$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. تحضير للجراحة
- قم بإجراء العمليات الجراحية في مكان نظيف ومخصص. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية, وتعقيم مع معقم الخرز الزجاجي قبل الجراحة.
ملاحظة: في هذا البروتوكول ، استخدم بعد الولادة 10-12 (P10-12) الفئران FVB. يمكن استخدام أعمار وسلالات مختلفة من الفئران لتلبية احتياجات مشروع معين. يمكن أن تكون الفئران الأكبر من P40 صعبة لأن عظم الفقاعات يصبح أكثر صلابة. - تخدير الفئران بحقن داخل الصفاق من خليط من هيدروكلوريد الكيتامين (100 مجم / كجم) ، زيلازين هيدروكلوريد (10 مجم / كجم) ، وأسيبرومازين (2 مجم / كجم). ابدأ التحضير الجراحي فقط بعد أن لا يستجيب للمنبهات المؤلمة ، مثل قرص إصبع القدم. إذا لزم الأمر ، قم بإعطاء جرعة معززة (خمس الجرعة الأصلية) من كوكتيل التخدير لاستعادة مستوى التخدير الأصلي.
ملاحظة: توخي الحذر في هذه الخطوة لأن معظم الوفيات التي لوحظت في هذا العمر ناتجة عن جرعة زائدة من التخدير. - قم بتغطية عيون بمرهم واقي للعيون للحفاظ على رطوبة العينين أثناء التخدير ، مما يؤدي إلى قمع منعكس وميض.
- لمنع انخفاض حرارة الجسم بعد التخدير ، ضع الفأر مع تمديد رقبته على وسادة تدفئة طوال العملية حتى يستيقظ تماما.
- حلق المنطقة اليسرى بعد الأذن باستخدام مقص وتطهير ب 70٪ من الإيثانول وبوفيدون اليود قبل التلاعب الجراحي.
2. الإجراء الجراحي وحقن النواقل
- استخدم نهجا ما بعد الأذن لفضح الفقاعة الطبلية. شق الأنسجة تحت الجلد بمقص صغير لكشف عضلة ما بعد الأذن. بعد سحب الأنسجة الدهنية إلى الجانب الخلفي من الشق ، افصل العضلات الموجودة على الجانبين الأيمن والأيسر بشكل عمودي على الشق لكشف العظم الصدغي. تأكد من أن هذا الشق طويل بما يكفي للعمل بشكل مريح مع التصور المناسب.
- قم بثقب الفقاعات الطبلية بإبرة 25 جم وقم بتوسيع الفتحة حسب الضرورة باستخدام ملقط عن طريق تقشير العظم للخلف للسماح بالوصول إلى المنعطف القاعدي للقوقعة ، ثم قم بتوسيعها بشكل كاف لتصور الشريان الثابت وغشاء النافذة المستديرة (RWM).
- قم بثقب RWM برفق في المنتصف باستخدام ماصة شعرية من البورسليكات. مراقبة تدفق السوائل عبر RWM في هذه المرحلة ؛ هذا طبيعي. انتظر حتى يستقر التدفق (يتم تجفيف السائل المنبعث من القوقعة بورق ترشيح معقم).
ملاحظة: توخ الحذر عند إمساك الإبرة الزجاجية وتقدمها بحيث يكون ثقب RWM صغيرا قدر الإمكان. اعتمادا على المجهر المستخدم، أمسك الماصات باستخدام مناور دقيق أو يدويا باستخدام حامل الماصة. - جهز الماصات للحقن باستخدام مجتذب الماصة، بنفس الطريقة التي يتم بها تحضير ماصات مشبك الترقيع. تأكد من أن قطر الطرف كبير (قطره حوالي 15 ميكرومتر) بحيث يتم سحب العينة للفيروس للداخل والخارج بسهولة.
- ارسم ما يصل إلى 2 ميكرولتر من الفيروسات المرتبطة بالغدة (AAV1-VGLUT3 أو AAV1-GFP أو AAV2-GFP) في ماصة الحقن. بعد استقرار التدفق (من 5 إلى 10 دقائق) ، قم بحقن هذا الحجم الثابت في scala tympani من خلال نفس الفتحة التي تم إجراؤها مسبقا في RWM.