تصوير التلألؤ الحيوي في الجسم الحي للخلايا السلفية العصبية البشرية في دماغ الفأر

الملخص

المصدر: Weber، R.Z.، et al.، Intrace Intrace Bioluminescence in vivo للخلايا السلفية العصبية البشرية في دماغ الفأر. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو طريقة التصوير الحيوي في الجسم الحي للخلايا السلفية العصبية البشرية المعدلة وراثيا المحقونة في دماغ الفأر. تتضمن العملية حقن اللوسيفيرين وإعداد التصوير والكشف عن إشارات الإضاءة الحيوية من الخلايا المزروعة في موقع الحقن.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

التصوير في الجسم الحي

1. تحضير نمط اللوسيفيرين < ol = 'نوع نمط القائمة: عشري" ؛ >
2. قم بإذابة ملح البوتاسيوم D-luciferin في درجة حرارة الغرفة (RT) وقم بإعداد محلول مخزون جديد من D-luciferin عند 30 مجم / مل في PBS.
قم
3. بتعقيم محلول المخزون من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.
   ملاحظة: يوصى باستخدام محلول العمل على الفور. إذا لزم الأمر ، يمكن تخزين اللوسيفيرين المذاب عند -20 درجة مئوية. ومع ذلك ، قد يؤدي التخزين المطول إلى تدهور الإشارة. لوسيفيرين هو كاشف حساس للضوء. احتفظ بها بعيدا عن الضوء المباشر كلما أمكن ذلك. يمكن أيضا النظر في ركائز بديلة ، على سبيل المثال ، cycluc ، لتحسين حد الدقة.

التصوير

1. الإعداد الأولي
   ملاحظة: تم إجراء التصوير الحيوي باستخدام نظام تصوير في الجسم الحي (انظر جدول المواد) يتكون من غرفة مظلمة وكاميرا جهاز مقترن بالشحن المبرد (CCD).
   1. انقر نقرا مزدوجا فوق رمز برنامج Live Image وحدد معرف مستخدم من القائمة المنسدلة.
   2. انقر فوق تهيئة في لوحة التحكم التي تظهر. بمجرد اكتمال عملية التهيئة ، سيتحول صندوق درجة الحرارة في لوحة التحكم إلى اللون الأخضر.
   3. في لوحة التحكم، حدد مربعي الإنارة والتصوير الفوتوغرافي وحدد التعريض الضوئي التلقائي (~60 ثانية). حدد مجال رؤية (تم اختيار D/12.5cm لهذا البروتوكول). أدخل ارتفاع الهدف (1.5 سم) وحدد خيار استخدام تركيز ارتفاع الهدف. قم بتعيين المعلمات التالية يدويا: التجميع الكبير ، f / 2 ، مرشح الإثارة المحظور ، ومرشح الانبعاث المفتوح.
2. تحديد كمية حقن D-luciferin عند 300 مجم / كجم من وزن الجسم.
   ملاحظة: الجرعة القياسية الموصى بها هي 150 مجم / كجم من D-luciferin. تم تعديل هذا الإجراء وفقا لبروتوكول أبلغ عن حساسية أعلى باستخدام 300 مجم / كغ.
3. حقن اللوسيفيرين داخل الصفاق (i.p.).
   ملاحظة: إذا احتاج إلى التخدير قبل الحقن ، فكن على دراية بأنه قد يطيل وقت ذروة التعبير عن لوسيفيراز.
4. انتظر لمدة 5 دقائق ، ثم قم بتخدير بإمدادات مستمرة من الأيزوفلوران (4.5٪ في مرحلة الحث و 1.5-2٪ في مرحلة الصيانة أثناء إجراء التصوير).
5. ضع مزلق العيون على العينين ، ثم احلق المخدرة على منطقة الرأس باستخدام ماكينة حلاقة الشعر التقليدية. ضع في غرفة التصوير وابدأ التصوير بعد 15 دقيقة من حقن اللوسيفيرين بالنقر فوق الحصول على في لوحة التحكم.

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات consumables synringe filter ; 0.22 μmTPP99722 Equipment وسادة التدفئة المنتج المفضلنظام التصوير في الجسم الحي (IVIS Lumina III مع حزمة برامج Living Imaging 4.2)Perkin Elmer CLS136334 مبخر الأيزوفلوران Provet AG 330724 المستحضرات الصيدلانية والكواشف D-Luciferin ملح البوتاسيوم بيركين إلمر122799 الإيثانول ؛ 70٪ منتج مفضلإيزوفلوران (إيزوفلوران (1-كلور-2،2،2-ثلاثي فلور إيثيل ثنائي فلورو ميثيل إيثر) 99.9٪) Provet AGتم توفير جميع الأدوية من قبل صيدلية الكانتون ، زيوريخ ، سويسرا زيوت تشحيم العيون (الريتينول بالميتات: 15,000 UI) Bausch & Lomb Swiss AGتم توفير جميع المستحضرات الصيدلانية من قبل صيدلية الكانتونات ، زيوريخ ، سويسرا