$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. زرع الخلايا داخل الحصين
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات الواردة في هذا القسم خارج غطاء زراعة الخلايا في منشأة. تم إجراء عملية زرع الخلايا في الدماغ بعد الولادة في وقت مبكر على P2 ، مع الأخذ في الاعتبار P0 في يوم الولادة.
- استعد لتجربة الزرع باتباع الخطوات أدناه.
- الأوتوكلاف جميع المواد الجراحية أو تعقيمها بطريقة أخرى معتمدة.
- قم بتركيب حقنة الحقن في الحامل دون أي شعرية زجاجية. اشطف الإبرة بالماء.
ملاحظة: يجب أن تكون الإبرة 33 جم. - منحنى 90 درجة طرف إبرة الأنسولين 30 جم.
- قم بإنشاء مرحلة تشبه Play-Doh محلية الصنع لوضع الجرو مع وضع الرأس مسطح (الشكل 1 أ).
- أحضر قفص الفأر مع الأم والجراء قبل تحضير أي شيء للجراحة للسماح لهم بالتأقلم مع البيئة الجديدة.
- قم بإعداد صينية بها ثلج مبلل وقفص فارغ به بعض الورق للأيزوفلوران.
- تخدير جرو الفأر.
- انقع قطعة من الورق مع الأيزوفلوران (انظر جدول المواد) وضعها داخل القفص الفارغ. خذ جروا واحدا بحذر وضعه في القفص مع الورق المنقوع في الأيزوفلوران.
ملاحظة: لا تترك أبدا أقل من ثلاثة صغار مع الأم. لا تتجاوز 20-30 ثانية من تخدير الأيزوفلوران ، وإلا فقد يموت الجرو. - التحقق من تأثير التخدير عن طريق التوقف عن الحركة.
- مباشرة بعد التخدير ، ضع الجرو على منديل مبلل على سطح الجليد الرطب. احتفظ بالحيوان على الجليد لمدة 3 دقائق حتى تصبح الأطراف العلوية بيضاء (الشكل 1 ب ، السهم الأزرق). يستغرق هذا عادة 2-3 دقائق.
- استخدم هذا الوقت لتحميل المحقنة بتعليق الخلية. أعد تعليق الخلايا بعناية باستخدام ماصة من قبل.
- ضع الجرو على الإطار التجسيمي. استخدم قضبان الأذن في الاتجاه المعاكس (الشكل 1 أ ، الأسهم الأرجوانية).
ملاحظة: الجانب الخلفي من قضبان الأذن أقل مدببا ، وبما أن صغار P2 ليس لديهم آذان ، استخدم الجانب المسطح لتجنب إيذاء. - من الجانب ، تحقق مما إذا كان الرأس مستقيما. يجب أن يكون الرأس مسطحا. استخدم المرحلة الشبيهة ب Play-Doh للتكيف مع ذلك.
ملاحظة: لم تفتح الجراء في هذا العمر أعينها بعد ، لذلك لا داعي لاتخاذ خطوات إضافية في هذا الصدد. لا تحتوي الجراء على الفراء في هذا العمر ، لذلك لا يلزم حلاقة المنطقة. لا يتم إعطاء علاج محدد للألم لأنه ليس شقا مفتوحا على الجلد ، ولا يوجد خياطة. - احتفظ بالجرو مغطى بالثلج (فوق المناديل الورقية) طوال مدة الجراحة.
ملاحظة: لا تضع الثلج على اتصال مباشر بجلد الجرو.
- إجراء الحقن.
- نظف سطح الجلد باستخدام منديل ناعم مبلل بالإيثانول.
- حدد lambda واضبط الإحداثيات على الصفر على وحدة التحكم في العرض الرقمي للأداة التجسيمية (الشكل 1C ، الخط الأصفر المتقطع). يمكن رؤية الغرز السهمية واللامدويد بسهولة للعين لأنها تصب الأوعية الدموية كخطوط حمراء.
ملاحظة: إذا كنت تواجه صعوبات في تصور لامدا ، ضع قطعة صغيرة من الثلج على الجلد وانتظر بضع دقائق حتى تبرد. بعد ذلك ، قم بإزالة قطعة الثلج ، وسيسمح لك التبييض الدقيق للبشرة بالتصور. - انقل إبرة الحقن إلى الإحداثيات المطلوبة. في البروتوكول الموصوف ، كانت المنطقة المستهدفة هي الحصين ، وكانت الإحداثيات على النحو التالي: الأمامي الخلفي (AP) +0.85 والمتوسطة الجانبية (ML) +1.35.
- استخدم إبرة الأنسولين المثنية بزاوية 90 درجة لاختراق الجمجمة وإنشاء ثقب صغير.
- قم بإسقاط إبرة الحقن حتى تعبر الجمجمة ، وصفر إحداثيات الظهر البطني (DV). اخفض الإبرة حتى تنسق DV المطلوب. في البروتوكول الموصوف ، كانت الإحداثيات DV -1.1.
- الحقن وفقا للفترات الزمنية المحددة مسبقا.
ملاحظة: في البروتوكول الموصوف ، كانت التوقيت الدقيق كما يلي: (1) بعد النزول إلى إحداثيات DV ، انتظر 3 دقائق ، (2) حقن 1 ميكرولتر من الحجم لمدة 5 دقائق ، و (iii) بعد حقن كل الحجم ، انتظر 3 دقائق. - اسحب الإبرة ببطء.
- قم بإنهاء الإجراء.
ملاحظة: لا يمكن أن تستمر الجراحة لأكثر من 15 دقيقة لضمان بقاء الجرو على قيد الحياة وتجنب أي ضرر ناتج عن التخدير بسبب انخفاض حرارة الجسم. - قم بتسخين الجرو بيديه حتى يبدأ في التحرك قبل إعادته إلى الأم.
- أعط DOX بتركيز 1 مجم / مل في محلول سكروز 0.5٪ كمياه شرب لمدة يومين على الأقل قبل الزرع و 3 أسابيع بعد الزرع (PT) لمواصلة تمايز الخلايا في الجسم الحي.
