حقن النواقل المؤتلفة المرتبطة بالغدة في نموذج فأر ضمور عضلي في العمود الفقري والبصلي

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. حقن وريد الذيل لبلازميد AAV-miRNA

ملاحظة: تحتاج هذه الخطوة إلى تعديل وفقا للجين المستهدف وعمر ووزن الفئران. استخدم إرشادات لجنة الرعاية المؤسسية ورعاية واستخدامه (IACUC) لتحديد نطاق الجرعة والحجم وأفضل طريقة للإعطاء بناء على عمر الفئران ووزنها. من المتوقع أن تصل إشارة GFP (بروتين الفلورسنت الأخضر) ومستويات تعبير miRNA في الأنسجة المستهدفة إلى ذروتها بدءا من أسبوعين بعد الحقن. يشير البروتوكول التالي إلى ذكور الفئران في مرحلة البلوغ المبكرة. يجب التعامل مع AAV كخطر بيولوجي بموجب إرشادات السلامة البيولوجية من المستوى 1.

1. قسم مخزون بلازميد AAV-miRNA إلى 100-200 ميكرولتر تحتوي على حمولة فيروسية تبلغ 10^{10-10 11} جينوم فيروسي لكل مل (vg / mL) باستخدام محلول ملحي معقم بمخزن فوسفات (PBS). يجب استخدام معدات الحماية الشخصية للمخاطر البيولوجية في المختبر للتعامل مع محلول AAV.
   ملاحظة: بمجرد إذابة الكمية ، يمكن تخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. يمكن تخزين المخزون الفيروسي في فريزر -80 درجة مئوية.
2. كبح الماوس في القيود المتاحة تجاريا مثل أنبوب الفيلم البلاستيكي أو المدبب بالحجم المناسب.
3. نظف سطح الذيل بمناديل كحولية بنسبة 70٪.
4. امسك وسادة دافئة (28-30 درجة مئوية) تحت الذيل لمدة 30 ثانية لزيادة توسع الأوعية. بدلا من ذلك ، قم بتسخين باستخدام مصباح حراري أحمر (على مسافة 2-3 أقدام) أو عن طريق غمس الذيل في الماء الدافئ.
5. بدءا من الجزء البعيد من الذيل ، أدخل الإبرة (27-30 جم) المحملة ب aliquot الفيروسي ، شطبة ، 15 درجة من الذيل ، في الوريد. قبل الحقن ، تأكد من إدخال الإبرة بشكل صحيح.
   1. إذا شعرت بالمقاومة أثناء الحقن أو ظهر تورم تحت الجلد، فأوقف الإجراء. قم بإزالة الإبرة وإعادة إدخالها فوق موقع الحقن السابق.
      NOTE: بدلا من ذلك ، يمكن تحقيق ذلك عن طريق شفط الإبرة برفق ومراقبة الدم. يمكن أن يؤدي الشفط الصعب إلى انهيار الوريد الذيل. إذا ابيض الوريد أثناء الحقن ، يتم إدخال الإبرة بشكل صحيح.
6. بعد اكتمال الحقن، انتظر بضع ثوان قبل رفع الإبرة.
7. مراقبة موقع الحقن للنزيف. ضع ضغطا معتدلا باستخدام إصبعين على الموقع حتى يتوقف النزيف.
8. أعد إلى قفصه.