حقن النواقل المؤتلفة المرتبطة بالغدة في نموذج فأر ضمور عضلي في العمود الفقري والبصلي

الملخص

المصدر:
Pourshafie, N., et al. التوصيل الجهازي للحمض النووي الريبي الصغير باستخدام النمط المصلي للفيروس المرتبط بالغدة المؤتلف 9 لعلاج الأمراض العصبية العضلية في القوارض. J. Vis. Exp. (2018).

في هذا الفيديو ، يخضع ضمور عضلي في العمود الفقري والبصلي أو الفأر المتأثر ب SBMA لحقن وريد الذيل لنواقل AAV المؤتلفة (النواقل المرتبطة بالغدان) التي تحمل بلازميد يشفر microRNA العلاجي. ينتج الناقل الحمض النووي الريبي الصغير الذي يرتبط ب AR (مستقبل الأندروجين) -mRNA (الحمض النووي الريبي المرسال) ، مما يؤدي إلى تدهوره. هذا يقلل من تراكم البروتين السام ويساعد على تحسين الوظيفة العصبية العضلية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. حقن وريد الذيل لبلازميد AAV-miRNA

ملاحظة: تحتاج هذه الخطوة إلى تعديل وفقا للجين المستهدف وعمر ووزن الفئران. استخدم إرشادات لجنة الرعاية المؤسسية ورعاية واستخدامه (IACUC) لتحديد نطاق الجرعة والحجم وأفضل طريقة للإعطاء بناء على عمر الفئران ووزنها. من المتوقع أن تصل إشارة GFP (بروتين الفلورسنت الأخضر) ومستويات تعبير miRNA في الأنسجة المستهدفة إلى ذروتها بدءا من أسبوعين بعد الحقن. يشير البروتوكول التالي إلى ذكور الفئران في مرحلة البلوغ المبكرة. يجب التعامل مع AAV كخطر بيولوجي بموجب إرشادات السلامة البيولوجية من المستوى 1.

1. قسم مخزون بلازميد AAV-miRNA إلى 100-200 ميكرولتر تحتوي على حمولة فيروسية تبلغ 10^{10-10 11} جينوم فيروسي لكل مل (vg / mL) باستخدام محلول ملحي معقم بمخزن فوسفات (PBS). يجب استخدام معدات الحماية الشخصية للمخاطر البيولوجية في المختبر للتعامل مع محلول AAV.
   ملاحظة: بمجرد إذابة الكمية ، يمكن تخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. يمكن تخزين المخزون الفيروسي في فريزر -80 درجة مئوية.
2. كبح الماوس في القيود المتاحة تجاريا مثل أنبوب الفيلم البلاستيكي أو المدبب بالحجم المناسب.
3. نظف سطح الذيل بمناديل كحولية بنسبة 70٪.
4. امسك وسادة دافئة (28-30 درجة مئوية) تحت الذيل لمدة 30 ثانية لزيادة توسع الأوعية. بدلا من ذلك ، قم بتسخين باستخدام مصباح حراري أحمر (على مسافة 2-3 أقدام) أو عن طريق غمس الذيل في الماء الدافئ.
5. بدءا من الجزء البعيد من الذيل ، أدخل الإبرة (27-30 جم) المحملة ب aliquot الفيروسي ، شطبة ، 15 درجة من الذيل ، في الوريد. قبل الحقن ، تأكد من إدخال الإبرة بشكل صحيح.
   1. إذا شعرت بالمقاومة أثناء الحقن أو ظهر تورم تحت الجلد، فأوقف الإجراء. قم بإزالة الإبرة وإعادة إدخالها فوق موقع الحقن السابق.
      NOTE: بدلا من ذلك ، يمكن تحقيق ذلك عن طريق شفط الإبرة برفق ومراقبة الدم. يمكن أن يؤدي الشفط الصعب إلى انهيار الوريد الذيل. إذا ابيض الوريد أثناء الحقن ، يتم إدخال الإبرة بشكل صحيح.
6. بعد اكتمال الحقن، انتظر بضع ثوان قبل رفع الإبرة.
7. مراقبة موقع الحقن للنزيف. ضع ضغطا معتدلا باستخدام إصبعين على الموقع حتى يتوقف النزيف.
8. أعد إلى قفصه.

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ScalePelouzeSP5 Nalgene دلوThermo Scientific120140004000 ملأنبوب الطرد المركزيالدقيق الولايات المتحدة الأمريكية Scientific1615-5500 Lactated Ringer الحل باكسترللرعاية الصحية0338-0114-04 دوامة صغيرةفيشر 128101 الطرد المركزيEppendorf22624415 فيلم مختبرBemisPM996 حقنة 1 ملBD309626يأتي مع إبرة 25 جرام متصلة. استبدل بإبرة 27-30 جم للحقن30 جرام إبرةBD305106 IsofluranePiramal Healthcare66794-013-25Isoflurane USP 250 ملقناع التخديرKopf Instruments906 GauzeHenry Schein100-25242 "× 2" (5 سم × 5 سم) نصائح PipetUSA Scientific1111-0816MicropipetGilson4642080 مبخر التخدير بالغازSurgiVet4214322Classic T3Gas Catalyst CavengerSurgiVet32373B10Enviro-PUREوسادة تسخينسيرز17280 وسادة مقعدVWR56617-006 روتارودبانلاب / جهاز هارفارد76-07724 فئران / 4 فئران70٪ مختبرات الإيثانولديكون ، إنك.2401140 برهان70٪ إيزوبروبانولVWR89108-160