الحقن داخل الجمجمة للمستقلبات الميكروبية المشتقة من الأمعاء في نموذج الفأر

الملخص

المصدر: Liou، C. et al. التوصيل داخل المخ البطيني للمستقلبات الميكروبية المشتقة من الأمعاء في الفئران التي تتحرك بحرية. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح هذا الفيديو الحقن داخل الجمجمة للأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs) في فأر يتحرك بحرية لدراسة آثارها على السلوك بوساطة الدماغ. يتم إدخال قنية حاقن في قنية توجيه مزروعة في دماغ الفأر. بعد الشفاء ، يتأقلم الفأر في قفص جديد. ثم يتم إدارة SCFAs ، ويتم تسجيل السلوك الحركي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. التحضير للحيوان التجريبي

1. احصل على ذكور الفئران البرية C57BL / 6JNarl البالغة من العمر 6-8 أسابيع من البائع.
2. ضع الفئران في قفص فأر قياسي مع طعام فأر قياسي وماء معقم إعلان آزاد.
   ملاحظة: ظروف السكن لمركز المختبر هي درجة حرارة 22 ± 1 درجة مئوية ، ورطوبة 55٪ ± 10٪ ، ودورة إضاءة / ظلام 13 ساعة / 11 ساعة.

2. الجراحة التجسيمية

1. قم بإعداد وتعقيم الأداة التجسيمية والأدوات الجراحية والعناصر ذات الصلة.
   ملاحظة: يجب تعقيم جميع العناصر التي ستتصل مباشرة بموقع الجراحة لتجنب العدوى.
2. قم بتخدير الماوس عن طريق وضعه في قفص زجاجي يحتوي على 1٪ -5٪ من الأيزوفلوران في الأكسجين.
   ملاحظة: راقب الماوس عن كثب لضمان الحفاظ على معدل التنفس بحوالي نفس واحد في الثانية.
3. أخرج الفأر من غرفة التخدير. احلق موقع الجراحة (رأس الفأر) باستخدام أداة تشذيب الأليفة. ضع الماوس على الإطار التجسيمي عن طريق تثبيت قواطع الماوس على شريط القاطع في حامل القواطع التجسيمية. غطي الأنف بقناع الأنف.
4. تخدير الفأر باستخدام 1٪ -2.5٪ من الأيزوفلوران في الأكسجين طوال الجراحة التجسيمية. قم بتقييم الشعور بالألم لدى الفأر عبر منعكس قرصة إصبع القدم وتأكد من معدل تنفس ثابت قبل شق موقع الجراحة.
5. ضع وسادة تدفئة (37.0 درجة مئوية) أسفل الماوس على الإطار التجسيمي للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء الجراحة. بدلا من ذلك ، حافظ على درجة الحرارة الأساسية بمساعدة مسبار حراري للمستقيم يربط المدفأة المبرمجة ووسادة التدفئة.
6. قم بإزالة الفراء المشذب على الرأس باستخدام شريط لاصق. حقن الفأر بمسكن كيتوبروفين (5 مجم / كجم) تحت الجلد لتخفيف الألم. ضع مرهم العين لتجنب جفاف العين.
7. أدخل شريط الأذن المدبب في قناة الأذن لإصلاح الرأس.
8. قم بتوسيط الرأس عن طريق ضبط مقياس شريط الأذن.
9. شد مشبك الأنف على حامل القاطع لتجنب الحركة الرأسية. اضغط على الرأس برفق للتحقق من ثبات الرأس وتجنب ارتخاء الرأس أثناء الجراحة اللاحقة.
10. تطهير فروة الرأس بثلاث مقشرات متناوبة من الكلورهيكسيدين باستخدام قطعة قطن. ابدأ كل مقشر من المنتصف باتجاه الجانب الخارجي (من المنطقة المركزية الأكثر تطهيرا إلى المنطقة الأقل تطهيرا).
    ملاحظة: يمكن أن يساعد استخدام الدعك من المنتصف إلى الخارج العلماء على تقليل العدوى والتلوث من الفراء. المنطقة الخارجية قريبة من منطقة الرأس غير المحلوقة ، والتي لا تزال تحتوي على كمية كبيرة من الفراء وليس من السهل تطهيرها جيدا.
11. شق فروة الرأس بطريقة أمامية / خلفية (<1 سم) باستخدام شفرة جراحية. افتح الشق وامسح الجمجمة بقطعة قطن مثبتة بواسطة ملقط تشريح دقيق.
    NOTE: يجب تعقيم ملقط التشريح الدقيق والشفرة الجراحية ومسحات القطن عن طريق التعقيم قبل الجراحة. أثناء العملية الجراحية ، قم بتعقيم جميع المعدات الجراحية باستخدام معقم الخرز الزجاجي (150 درجة مئوية) لمدة 5 ثوان على الأقل قبل وبعد كل. قم بإعداد دورق معقم لتثبيت الشفرة الجراحية والملقط أثناء العملية الجراحية وبين.
12. حدد بريجما ولامدا على الجمجمة. استخدم Bregma كمرجع لتحديد منطقة الاهتمام.
    1. اختياري: قم بتركيب المثقاب التجسيمي على حامل الحفر التجسيمي، واستخدم طرف المثقاب للإشارة إلى Bregma كمرجع. قم بتعقيم المثقاب التجسيمي باستخدام معقم الخرز الزجاجي (150 درجة مئوية) لمدة 5 ثوان على الأقل.
13. قم بمعايرة ومحاذاة المستوى الأفقي للجمجمة المسطحة في المستوى الأيسر / الأيمن والأمامي / الخلفي بواسطة Bregma / Lambda.
    ملاحظة: إذا لم يكن في مستوى أفقي صحيح ، فأعد تركيب الماوس على الأداة التجسيمية.

3. زرع قنية الدليل المخصص

1. التجاري تحديد وتسمية موضع البطين الجانبي الأيمن بناء على الإحداثيات التجسيمية: المسافة إلى Bregma ، الأمامي / الخلفي (A / P): 0.26 مم ، الإنسي / الجانبي (M / L): -1.0 مم ، الظهري / البطني (D / V): -2.0 مم.
   ملاحظة: يمكن تعديل الإحداثيات بناء على منطقة الاهتمام. استندت إحداثيات البطين الجانبي إلى الفئران البالغة C57BL / 6J التي يتراوح وزنها بين 26 و 30 جم.
2. حفر ثقب (القطر = 1.5 مم) من خلال الجمجمة في الموقع المسمى باستخدام مثقاب تجسيمي لزرع قنية دليل تجارية.
3. قم بحفر ثقبين إلى أربعة ثقوب أخرى (القطر = 1.5 مم) على الجمجمة باستخدام مثقاب تجسيمي لتركيب مسامير الفولاذ المقاوم للصدأ.
   ملاحظة: قم بتعقيم المثقاب التجسيمي باستخدام معقم حبة زجاجية (150 درجة مئوية) لمدة 5 ثوان على الأقل قبل وبعد كل.
4. امسح بقايا العظام وتوقف عن النزيف بقطعة قطن.
5. امسح الجمجمة بالليدوكائين (1 مجم / كجم) باستخدام قطعة قطن للحصول على تأثيرات مخدرة موضعية ومضادة للحكة ومسكنة للألم. إذا لم يتوقف النزيف بعد الحفر ، ضع قطعة قطن برفق على الحفرة لإرقاء.
6. قم بتركيب اثنين إلى أربعة براغي غير قابلة للصدأ على الفتحات لتوفير مثبتات لأكريليك الأسنان.
7. ضع قنية الدليل التجارية على حامل القنية التجسيمية وقم بتطهيرها باستخدام معقم الخرز الزجاجي (150 درجة مئوية).
   ملاحظة: تم تخصيص قنية الدليل التجاري والدمية التجارية والحاقن التجاري (الشكل 1 أ) بالمواصفات الموضحة في جدول المواد.
8. انقل حامل القنية التجسيمية إلى الفتحة المحفورة للبطين الجانبي وأدخل قنية التوجيه التجارية ببطء في الحفرة حتى العمق المطلوب (2.5 مم).
   ملاحظة: يمكن تحديد الإحداثيات الظهرية / البطنية عن طريق ضبط طرف قنية التوجيه التجارية كمرجع عندما يتم إدخال الطرف بالكاد في الحفرة.
9. ضع 10 ميكرولتر من مادة لاصقة n-butyl cyanoacrylate (غراء لاصق للأنسجة) لتثبيت قنية التوجيه التجارية في الحفرة المحفورة وانتظر لمدة 3-4 دقائق. حرر قنية الدليل التجارية برفق من حامل القنية التجسيمية وحرك الحامل بعيدا.
10. ضع أكريليك الأسنان على فروة الرأس المقطوعة لإصلاح قنية التوجيه التجاري وانتظر لمدة 5 دقائق على الأقل. زرع الدمية التجارية في قنية الدليل التجاري لتجنب انسداد القنية بالدم أو سوائل الجسم (الشكل 1 ب).
11. حرر شريط الأذن من قناة الأذن وقم بإزالة الماوس من الإطار التجسيمي.
12. ضع الماوس في قفص جديد مع وسادة تدفئة تحته للتعافي من التخدير وراقب باستمرار حتى يستيقظ الماوس تماما.
    ملاحظة: لا تترك دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. يجب ألا يعود الذي خضع لعملية جراحية إلى صحبة الأخرى حتى يتعافى تماما.
13. أعد الماوس إلى سكن فردي أو سكن جماعي ، اعتمادا على بروتوكول لجنة رعاية المؤسسي واستخدامه (IACUC) والتصميم التجريبي. بالنسبة للسكن الجماعي ، تأكد من وضع عدد أقل من الفئران في قفص لتقليل الإصابات غير المرغوب فيها أو انفصال القنية.
14. يجب تطبيق الإيبوبروفين (0.2 ملغم/مل) في مياه الشرب لمدة 3 أيام على الأقل للرعاية اللاحقة للجراحة، ومراقبة مرتين يوميا بحثا عن علامات الألم والضيق لمدة 3 أيام على الأقل.
    1. أثناء رعاية ما بعد الجراحة، ضع مرهم روكسيثروميسين حول الجلد لمنع الالتهاب والعدوى في الفئران.
    2. استمر في مراقبة حالة وأعط حقنة داخل الصفاق في الوقت المناسب من 5٪ جلوكوز و / أو 0.9٪ كلوريد الصوديوم لتوفير طاقة كافية.
    3. إذا تدهورت حالة الألم أو الضيق أو العدوى بشكل مطرد ، فقم بالقتل الرحيم للفأر عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون₂.
15. انتظر لمدة أسبوع واحد بعد العملية حتى يكون الفأر جاهزا للتوصيل داخل المخ البطيني للأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs) والاختبار السلوكي.

4. تحضير SCFAs

1. قم بإذابة أسيتات الصوديوم وزبدات الصوديوم وبروبيونات الصوديوم في السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (ACSF) (انظر جدول المواد).
2. تأكد من إذابة المواد الكيميائية تماما ، ثم اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 ، وقم بتصفية خليط SCFAs من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر للتعقيم.

5. قم بإعداد نظام التسريب للتوصيل داخل البطين من SCFAs أثناء الاختبار السلوكي

1. قم بتركيب كاميرا سقف لتسجيل السلوك. قم بتوصيل الكاميرا بجهاز كمبيوتر للتحكم في برنامج تسجيل الفيديو (الشكل 2).
2. املأ حقنة سعة 10 ميكرولتر بالماء المقطر.
   ملاحظة: تجنب فقاعات الهواء في حقنة الميكرولتر.
3. قم بتوصيل مضخة الحقن المجهري بوحدة التحكم في الحقن المجهري.
4. قم بتركيب حقنة الميكرولتر على مضخة الحقن المجهري. لتثبيت المحقنة ، اضغط على الزر لفك المشبك وتثبيت المحقنة في الموضع المقابل. أغلق المشبك وشد المسمار المثبت على المكبس الموجود على مضخة الحقن المجهري (الشكل 3 أ).
5. أدخل الحاقن التجاري في أنبوب البولي إيثيلين (الشكل 1 أ).
6. قم بتعليق أنبوب البولي إيثيلين على كاميرا السقف فوق ساحة الاختبار.
7. املأ أنبوب البولي إيثيلين بالماء المقطر باستخدام حقنة الأنسولين. قم بتوصيل حقنة الميكرولتر بأنبوب البولي إيثيلين المعلق.
   ملاحظة: تأكد من أن أنبوب البولي إيثيلين طويل بما يكفي للسماح للماوس بالتحرك بحرية في جميع أنحاء ساحة الاختبار.

6. إعدادات النظام لوحدة التحكم في الحقن المجهر:

1. قم بتشغيل وحدة التحكم في الحقن المجهري واضغط على عرض جميع القنوات للوصول إلى شاشة الأوامر (الشكل 3C). اضغط على التكوين واضبط مستوى الصوت المستهدف على 9,800 nL مع معدل التسليم إلى 100 nL / s. قم بنقع 9,800 نانولتر من الماء المقطر من أنبوب البولي إيثيلين المتصل بحقنة الميكرولتر (اضغط على الاتجاه للتبديل إلى وضع النفخ واضغط على RUN) (انظر المربعات الحمراء في شاشة الأوامر في الشكل 3C).
2. اضغط على التكوين واضبط مستوى الصوت المستهدف على 3,000 نانولتر مع معدل التسليم إلى 100 نانولتر / ثانية. اسحب 3,000 نانولتر من الزيت المعدني (اضغط على الاتجاه للتبديل إلى وضع السحب واضغط على RUN) (انظر المربعات الحمراء في شاشة الأوامر في الشكل 3C).
   ملاحظة: يجب ملاحظة فصل واضح لطور الزيت عن الماء على أنبوب البولي إيثيلين.
قم
3. بتفكيك أنبوب البولي إيثيلين من إبرة حقنة الميكرولتر. بصق 3,000 نيولتر من الماء المقطر من إبرة حقنة الميكرولتر (اضغط على الاتجاه للتبديل إلى وضع النفخ واضغط على RUN).
4. أدخل حقنة الميكرولتر مرة أخرى في أنبوب البولي إيثيلين. اضغط على التكوين واضبط مستوى الصوت المستهدف على 9,500 nL بمعدل تسليم يبلغ 100 nL / s. اسحب 9,500 نيولتر من SCFAs (اضغط على الاتجاه للتبديل إلى وضع السحب واضغط على RUN). قم بتسمية مرحلة SCFAs النفطية للتحقق مما إذا كان قد تم غرس SCFAs بنجاح.
5. اضغط على التكوين واضبط مستوى الصوت المستهدف المطلوب مع معدل التسليم على 7 نانولتر / ثانية. اضغط على الاتجاه للتبديل إلى وضع Infuse (انظر المربعات الحمراء في شاشة الأوامر في الشكل 3C).
   ملاحظة: حدد مستوى الصوت بناء على وقت التسريب. على سبيل المثال ، إذا كان وقت التسريب 3 دقائق لمعدل التوصيل 7 نانولتر / ثانية ، فإن الحجم المستهدف = 1،260 نانولتر.
6. اضغط على RUN لنقع حقنة الميكرولتر للأمام حتى يخرج السائل في الطرف الأمامي للحاقن التجاري قبل إدخال الحاقن في القنية لحقن SCFAs.

7. ضخ SCFAs في البطين الجانبي من خلال قنية التوجيه التجاري في فأر يتحرك بحرية

1. تخدير الماوس عن طريق وضعه في قفص زجاجي مع 1٪ -5٪ من الأيزوفلوران في الأكسجين.
   ملاحظة: راقب الماوس عن كثب لضمان الحفاظ على معدل التنفس بحوالي نفس واحد في الثانية.
قم
2. بتقطيع الماوس وأدخل الحاقن التجاري في قنية التوجيه التجارية (الشكل 3 ب).
   ملاحظة: إذا كانت قنية الدليل التجارية مسدودة بالدم أو سوائل الجسم ، فقم بفك انسدادها برفق باستخدام الملقط.
3. اسمح للفأر بالتعافي من التخدير لمدة 15 دقيقة في قفص قبل الاختبار السلوكي.
4. لاختبار الحركة الأساسي ، ضع الماوس في قفص جديد واتركه يستكشف بحرية لمدة 35 دقيقة. قم بغرس SCFAs باستخدام معدل تسليم يبلغ 7 نانولتر / ثانية لحجم مستهدف يبلغ 2,100 نانولتر في أول 5 دقائق (اضغط على الاتجاه إلى وضع Infuse واضغط على RUN).
   ملاحظة: يمكن تحليل الحركة في القفص الجديد باستخدام برنامج تتبع فيديو سلوك.
5. قم بتخدير الماوس (كرر الخطوة 7.1) وقم بإزالة الحاقن التجاري من قنية الدليل التجاري.
   ملاحظة: يمكن حقن الماوس بشكل متكرر بعناصر تحكم / مستقلبات مختلفة بعد إعطاء المدة الزمنية المناسبة لغسل الحقن السابق. ما دامت القنية مثبتة على رأس الفأر ، يمكن اختبار الفأر بشكل متكرر باستخدام مستقلبات مختلفة.

8. استعادة نظام الحقن المجهر

:

1. قم بتفكيك أنبوب البولي إيثيلين من حقنة الميكرولتر.
قم
2. بحقن الهواء في الأنبوب باستخدام حقنة الأنسولين للتخلص من الماء المقطر في أنبوب البولي إيثيلين. أفرغ حقنة الميكرولتر.
3. اضغط على إعادة تعيين نقطة البيع على شاشة التكوين لفتح شاشة تعريف الشكل لإيقاف الحقنة (الشكل 3C).
4. اضغط على سحب حتى يحدث صوت صفير لإعادة ضبط مضخة الحقن المجهري إلى الوضع المسحوب بالكامل (الشكل 3C).
5. ارجع إلى شاشة الأوامر وقم بإيقاف تشغيل وحدة التحكم في الحقن الدقيق إذا كانت هناك علامة ** END REACH ** على هذه الشاشة (الشكل 3C).

النتائج

فئة الشكل = 'صورة image_resized image-style-align-center' style='display: table؛ margin-left؛ auto؛ margin-right: auto؛ width: 75٪;'>

الشكل 1: زرع قنية الدليل التجاري في الفئران. (أ) الصورة التمثيلية لقنية الدليل التجاري والدمية والحاقن. (ب) الصورة التمثيلية لقنية الدليل التجاري والدمية المزروعة في دماغ الفئران عن طريق التثبيت باستخدام أكريليك الأسنان.

<فئة الش...

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Material Advil Liqui-Gels المذاب الإيبوبروفين A2: D41Pfizern / A فلتر فراغ علوي للزجاجة ، 500 مل ، 0.22 ميكرومتر ، PES ،NEST معقم121921LA01 CaCl₂Sigma-AldrichC1016ACSF: 0.14 جم / لترمقشر الكلورهيكسيدين 2٪ PhoenixNDC 57319-611-09 محلول الكلورهيكسيدينPhoenixNDC 57319-599-09 وهمية تجاريةRWD Life Science62004Single_OD 0.20 مم / M3.5 / G = 0.5 مم دليل تجاري cannulRWD Life Science62104Single_OD 0.41 مم -27G / M3.5 / C = 2.5 ممحاقن تجاريRWD Life Science62204Single_OD 0.21 مم -33G / رفقاء مع M3.5 / C = 3.5 مم / جم = 0.5 ممD- (+) -الجلوكوزسيجما-ألدريتشG8270ACSF: 0.61 جم / لترأكريليك الأسنانHYGENICN / A مسامير التثبيتRWD Life Science62521 مصل الحصانThermoFisher Scientific16050130 محاقن الأنسولينBBraunXG-LBB-9151133S-1BX1 ملIsofluranePanion & BF biotechDG-4900-250D KClSigma-AldrichP3911ACSF: 0.19 جم / لتركيتوبروفينالسويسرية للأدويةغير متوفرة ليدوكائينAstraZenecan / a نقطة انصهار منخفضة agaroseInvitrogen16520 MgCl₂Sigma-AldrichM8266ACSF: 0.19 جم / لترشرائح مجهرThermoFisher Scientific4951PLUS-001E ضوء الزيت المعدني ، أبيض NFماكرون للكيماويات الدقيقةMA-6358-04 NaClSigma-AldrichS9888ACSF: 7.46 جم / لترNaH₂PO₄Sigma-AldrichS8282ACSF: 0.18 جم / لترNaHCO₃Sigma-AldrichS5761ACSF: 1.76 جم / لترلاصق n-butyl cyanoacrylate (غراء لاصق للأنسجة) 3M1469SB3M VetbondNeural tracerSanta CruzSC-358883FluoroGoldParaformaldehydeSigma-AldrichP6148 أنبوب البولي إيثيلينRWD Life Science62329OD 1.50 ، ID 0.50 مم و OD 1.09 ، ID 0.38 ممPuralube Vet (العين) مرهمDechra12920060 أسيتات الصوديومSigma-AldrichS2889SCFAs: 13.5 ملي منأزيد الصوديومسيجما-ألدريتشS2002زبدات الصوديومSigma-AldrichB5887SCFAs: 8 ملي مولاربروبيونات الصوديومسيجما-ألدريتشP1880SCFAs: 5.18 ملي منقنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأChun Ta شركة الفولاذ المقاوم للصدأ CO.، LTD.ن / أOD 0.63 مم ؛ البائع المحليحاقن الفولاذ المقاوم للصدأChun Ta شركة الفولاذ المقاوم للصدأ المحدودة.غير متوفر OD0.3 مم ؛ دمية مصنوعة من حاقن ؛ البائع المحليSuperglueKrazy GlueKG94548R Triton X-100Merck1.08603.1000 حامل قنية المعدات RWD Life ScienceB485-68217 كاميرا السقفFOSCAMR2 أدوات التجسيم الرقميةStoelting51730D تشريح المجهرINNOVIEWSEM-HT / TW معقم الخرزة الزجاجيةRWD Life ScienceRS1501 وسادة التدفئةStoelting53800M ملقط تشريح دقيقROBOZRS-5136مسنن ، منحنى طفيف. حساسية اضافية. 0.5 مم عرض الطرف ؛ مقص تشريح دقيق بطول 4 بوصاتROBOZRS-59184.5 "وحدةتحكم بالحقن الدقيق بزاوية حادة أدوات الدقة العالمية (WPI)MICRO2TSMARTouch Controllerمضخة حقنة الحقن الدقيق العالمية للأدوات الدقيقة (WPI)UMP3T-1حقنة ميكرولترHamilton8001410 ميكرولترالألياف الضوئية الضوء البارد مع خطوة الألياف المزدوجةLGY-150البائع المحليماكينة تشذيب الأليفةWAHL09962-2018 برنامج تتبع الفيديو لسلوكNoldusEthoVisionالإصدار: 15.0.1416