قنوات Schwann المصنفة بالخلايا لتجديد المحور العصبي بعد إصابة الحبل الشوكي

الملخص

المصدر: Lee، Y.، et.al. زرع خلايا شوان داخل قنوات PVDF-TrFE لسد جذوع الحبل الشوكي للفئران المنقولة لتعزيز تجديد المحور العصبي عبر الفجوة. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو استخدام قناة بوليمر كهرضغطية مزروعة بخلايا شوان لتعزيز تجديد المحور العصبي في الحبل الشوكي للفئران المنقولة. توفر القناة التوجيه الهيكلي ، بينما تحفز خصائصها الكهربية الحيوية نمو العصب. تفرز خلايا شوان داخل القناة عوامل تغذية عصبية ، مما يدعم الجسر المحوري بين جذوع الجذوع المنقارية والذيلية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. التقسيم عند T8

1. ضع الضام حول T7 إلى T9. بمجرد إزالة جميع الصفيحة ، تأكد من أن الفجوات بين العمليات المستعرضة مرئية ، خاصة في T8. افحص أيضا العظام على طول كلا الجانبين بين T7 إلى T9 للتأكد من عدم وجود شظايا عظمية بارزة للخارج.
   ملاحظة: هذه الفجوة في T8 مهمة لإجراء القطع الكامل. يجب إزالة الفقرات على طول الطول لتسهيل إدخال القناة.
2. قطع الجذور الظهرية والبطنية أعلى وأسفل T8 باستخدام مقص زنبركي بزاوية. أضف المحلول الملحي إلى الحبل الشوكي وانتظر حتى يتجلط الدم.
   ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لإدخال القناة بشكل صحيح.
3. ضع مقص الزنبرك الزاوي فوق الحبل الشوكي في الفجوات بين العمليات المستعرضة في T8 وقم بعمل قطع واحد لقطع الحبل الشوكي تماما. ضع قطعة صغيرة من الرغوة المضغوطة في الفجوة الناتجة 2-2.5 مم وأضف المحلول الملحي إلى المنطقة على الفور.

2. إدراج القناة

1. أثناء انتظار وصول جذوع الحبل المقطوع إلى الإرقاء ، أخرج قناة من 1x PBS. قطع مثلثات الامتصاص إلى قطع طويلة رفيعة وضعها في القناة لإزالة PBS الزائد. تأكد من أن النوافذ المقطوعة مسبقا مفتوحة.
2. قم بإزالة المحلول الملحي والدم باستخدام قطع رفيعة طويلة من مثلثات الامتصاص. ارفع جذعي الحبل الشوكي باستخدام ملعقة صغيرة لضمان الفصل الجيد. ارفع الجذع المنقاري برفق باستخدام الملعقة الدقيقة وانزلق القناة فوق الجذع بحيث تكون النوافذ مواجهة لنفسك. تأكد من إدخال الجذع بالكامل وعدم وجود نزيف زائد في القناة.
3. ارفع الجذع الذيلي برفق وانزلق الطرف الآخر من القناة فوق الجذع. تأكد من إدخال الجذع بالكامل وأن النوافذ على السطح الظهري (الشكل 1 أ).

3. خلية شوان (SC) / تحضير المصفوفة القابلة للحقن والحقن

1. أثناء انتظار وصول الحبل المقطوع إلى الإرقاء ، قم بإزالة الوسط فوق حبيبات GFP-SC. قم بإعادة تعليق GFP-SCs في 10 ميكرولتر من DMEM / F12 البارد. أضف 10 ميكرولتر من الجل القابل للحقن البارد إلى معلق الخلية واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات المتكرر. احتفظ بخليط المصفوفة GFP-SC / DMEM / F12 / القابل للحقن على الثلج حتى يكتمل إدخال القناة.
2. بعد التأكد من أن النوافذ الموجودة على السطح الظهري مفتوحة (الشكل 1 أ) ، قم بحقن 20 ميكرولتر من خليط المصفوفة GFP-SC / DMEM / F12 / الحقن في القناة من خلال إحدى النوافذ المقطوعة مسبقا باستخدام طرف تحميل لطخة غربية وماصة دقيقة. إذا كان يجب أن يملأ خليط المصفوفة القابل للحقن SC / DMEM / F12 القناة ، فقم بإزالة الفائض بمثلثات الامتصاص. أغلق النوافذ بعد الحقن ؛ ليست هناك حاجة إلى خياطة (الشكل 1 ب).

النتائج

فئة الشكل = 'image image-style-align-center image_resized' style='display:table;margin-left:auto;margin-right:auto;width:75٪;'>

الشكل 1: إغلاق النافذة بعد حقن SC/DMEM/F12/المصفوفة. يتم فتح النوافذ عن طريق طي كل رفرف للخلف بعد وضع القناة بين جذوع الجذوع المنقارية والذيلية (A). يتم إغلاق النوافذ بعد الحقن (B). شريط المقياس = 1 مم.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Dulbecco's Eagle's Medium: Dual Blend F-12ThermoFisher Scientific11039-021 "DMEM / F12" في البروتوكول.أنثى فأر فيشر (160-180 جم)مقص Envigo Vannas ، مستقيمFST15018-10 Micro SpatulaFST10089-11يمكن أن يكون أي علامة تجارية مفضلة.مقص منحني بنهاية حادةFST14017-18يمكن أن يكون أي علامة تجارية من اختيارها.ملقط حادFST11006-12يمكن أن يكون أي علامة تجارية من اختيارك.يمكن أن يكون RongeurFST16121-14أي علامة تجارية مفضلة.مقص زنبركي بزاويةFST15006-09يمكن أن يكون أي علامة تجارية من اختيارك.يمكن أن تكون مثلثات الامتصاصFST18105-03أي علامة تجارية من اختيارها.GelfoamHenry Schein9083300 "رغوة مضغوطة" في البروتوكول.# 10 شفراتSklar06-3010يمكن أن تكون أي علامة تجارية من اختيارها.MatrigelCorning354234"المصفوفة القابلة للحقن" في البروتوكول.