التحليل الطيفي المتماسك المضاد للستوكس رامان لتصور الخلايا العصبية النخاعية في أنسجة دماغ الفئران

الملخص

المصدر: McCullagh، E. A.، et al. تطبيق التحليل الطيفي المتماسك المضاد للستوكس رامان (CARS) لتصوير النخاع في شرائح الدماغ. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح الفيديو التصوير الفلوري والتصوير الطيفي المتماسك المضاد للستوكس رامان (CARS) لتصور بنية الخلايا العصبية في أنسجة دماغ القوارض. يقوم تلطيخ Nissl بتسمية أجسام الخلايا عن طريق الارتباط بالحمض النووي الريبي الريبوسومي ، بينما يستهدف التصوير CARS المايلين الغني بالدهون من خلال الإشارات التي يسببها الليزر. يوفر تراكب صور التألق و CARS عرضا تفصيليا لأجسام الخلايا والمحاور النخاعي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. تلطيخ

1. أقسام عائمة خالية من البقع ل Nissl ، لتصور أجسام الخلايا (1: 100) ، في وسائط الأجسام المضادة (وسائط AB: 0.1 M عازلة الفوسفات (PB: 50 ملي مولار KH2PO4 ، 150 ملي مولار Na2HPO4) ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 3 ملي مولار تريتون-X ، 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA)) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مختبر قياسي.
   1. حماية الأقسام من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم و / أو الغطاء. تتوافق الأطوال الموجية 550 نانومتر أو أقل مع تصوير CARS (الشكل 1).
      ملاحظة: على الرغم من أننا لا نتوقع أن يكون ل Triton-X أو الكواشف الأخرى تأثير على تصوير CARS للدهون ، فقد يكون هناك ما يبرر وجود عناصر تحكم إضافية باستخدام وسائط محددة للأجسام المضادة.
2. نقطة الإيقاف المؤقت: قم بتخزين الأقسام العائمة بحرية (أثناء الحماية من الضوء) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) حتى التصوير. بمجرد تقسيمها ، قم بتصوير أقسام الدماغ في غضون أسبوعين.

2.

ملاحظة التصوير: يحتوي إعداد ليزر CARS على ليزر ألياف يوفر ساعة 80 ميجاهرتز ، وليزر OPO (مذبذب بارامتري بصري) بنطاق قابل للضبط من 770-990 نانومتر مع شعاع ستوكس ثابت عند 1031 نانومتر ، وهو أمر ضروري لجمع إشارة CARS. هناك فتحة واحدة لكلا الحزمتين.

1. قبل إحضار العينات إلى المجهر ، قم بتشغيل وتسخين ليزر CARS لمدة 1 ساعة على الأقل ، وقم بمحاذاة ليزر CARS ، وقم بتشغيل بصريات المكثف والحجاب الحاجز للمجهر لتصوير CARS الأمامي.ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية للوظيفة المناسبة للفحص المجهري CARS.
   1. للمحاذاة المكانية لشعاعي الليزر (المضخة والستوكس)، قم بالوصول إلى جهازي PSD الداخليين (أجهزة الكشف الحساسة للموضع) عبر واجهة المستخدم الرسومية بالليزر CARS (واجهة المستخدم الرسومية).
   2. حقق المحاذاة الزمنية باستخدام وظيفة التأخير في واجهة المستخدم الرسومية (GUI) الخاصة بالليزر CARS، والتي يمكن أن تساعد في تداخل نبضات الليزري (المضخة والستوك) اللذين لهما تشتتات مختلفة بسبب أطوالهما الموجية المختلفة. لذلك ، يتم كل من التداخل الزمني والمكاني للمضخة وحزم المضخات مع إدخال المستخدم من خلال واجهة المستخدم الرسومية.
   3. اضبط المنظار الخارجي (آخر مرآتين من الإعداد) لتوسيط ليزرين متداخلين مكانيا على مرايا رأس المسح الضوئي للمجهر.
   4. للحصول على أفضل اكتشاف أمامي غير قابل للمسح الضوئي ، تأكد من أن المكثف هو Koehler-ed (مما يعني أن المكثف متمركز ويركز على الحجاب الحاجز لتحقيق إضاءة موحدة)
2. بالنسبة للتصوير متحد البؤر المناعي والتصوير بتنسيق CARS ، قم بتركيب ليزر CARS ، مع كل من أجهزة الكشف غير الممسوحة ضوئيا (NDDs) الأمامية و epi CARS ، من خلال دمج مجهر متحد البؤر مجهز بالليزر المرئي للتصوير الفلوري (الشكل 2).
3. ضع الأقسام في طبق ثقافة مع غطاء (للفحص المجهري المقلوب) ، و PBS لتجنب جفاف الأنسجة ، ووزن زجاجي للحفاظ على الأنسجة بالقرب من الغطاء.
4. التقط مكدسات z أو صورا مفردة مع هدف مائي مصحح بالأشعة تحت الحمراء 60X و 1.2 فتحة عددية (NA) ، والذي يعمل على جمع إشارة CARS في اتجاه epi ومن خلال مكثف 0.55 NA في الاتجاه الأمامي لتصوير مناطق الدماغ مثل النواة الإنسية للجسم شبه المنحرف (MNTB).
   1. التقط صور CARS بحوالي 600 ميجاوات مضخة / مسبار و 300 ميجاوات ستوكس ، باستخدام واجهة المستخدم الرسومية بالليزر CARS. يتم قياس قيم طاقة الليزر هذه داخليا بواسطة النظام. تبلغ قوة كلا الليزران في موقع العينة أقل من 25 ميجاوات وآمنة لعينة الأنسجة.
   2. تداخل المضخة وحزم ستوكس مكانيا وزمانيا. اضبط OPO على 797.2 نانومتر. ينتج عن هذا طول موجة CARS يبلغ 650 نانومتر. بسبب مستوى الطاقة الأعلى ، فإن العودة الناتجة إلى الحالة الأرضية هي مضادة لستوك (تحول الأزرق) إلى الإثارة.
   3. التقط إشارة CARS في أجهزة الكشف الموسع أو الأمامية غير الممسوحة ضوئيا باستخدام مرشحات ممر النطاق (640-680 نانومتر) متبوعة بالكشف المتسلسل عن ملصق التألق المناعي (في هذه الحالة المسمى Nissl بالفلورسنت). ملاحظه: لا يتم التقاط علامة سوما العصبية Nissl في مرشح ممر النطاق CARS 640-680 نانومتر ، مما يسمح بالجمع بين التصوير الفلوري والتصوير CARS في الصور المعروضة أدناه.
   4. لا تشترك CARS والتألق في PMTs. استخدم هذه الإعدادات للحصول على إشارة دهنية مثالية لتصوير النخاع بشكل انتقائي في منطقة الدماغ. أنذر: حماية المستخدم من شعاع الليزر
5. احفظ الصور كملفات .oib ، والتي يمكن استيرادها إلى برنامج تحليل الصور لمزيد من القياس الكمي (الشكل 3).

النتائج

فئة الشكل = 'image image-style-align-center image_resized' style='display: table؛ margin-left: auto؛ margin-right: auto ؛ width: 75٪ ؛ '>

الشكل 1: يمكن دمج تصوير CARS مع التصوير المناعي الفلوري. تظهر الرسوم البيانية أن تصوير CARS يحدث عند طيف إشارة حمراء 660/640 نانومتر. هذا الطول الموجي بعيد بما فيه الكفاية عن النطاق الأخضر أو الأزرق أو الأشعة فوق البنفسجية ، مما ي...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Staining: AB Media: 1n 1,000 مل من Millipore H2OPhosphate Buffered (PB): فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةسيجماP5655 فوسوهات الصوديوم ثنائي القاعدةسيجماS7907 BSA (ألبومين مصل الأبقار) سيجما لايف ساينسA2153-100g كلوريد الصوديومفيشر كيميكالs271-1 تريتون X-100سيجما - ألدريتشx100-500 مل نيسل 435/455InvitrogenN21479 CARS: APE picoemerald laserAngewandte Physik & Elektronik GmbH مرشح ممر النطاق الترددي (420-520 نانومتر)Chroma TechnologyHQ470 / 100m-2P مرشح ممر النطاق الترددي (500-530 نانومتر)Chroma TechnologyHQ515 / 30m-2P المرشحات (640-680 نانومتر) تقنية ChromaHQ660 / 40m-2P مجهر متحد البؤرأوليمبوسFV1000 قطع ماصة نقلفيشر13-711-7M ممر طويل اللون ثنائي اللون 565 نانومترتقنية كروما565dcxr ثنائي اللون Longpass 585 نانومترتقنية Chroma585dcxr ممر ثنائي اللون 750 نانومترChroma TechnologyT750spxrxt طبق ثقافة قاع زجاجيMatTekP35G-0-10-C وزن الزجاج (10 مم × 10 مم قضيب بورو)Allen Scientific Glass Inc متعدد الفوتون مرشح انبعاث ممر قصير 680 نانومترChroma TechnologyET680sp-2p8 PBS