تصوير ديناميكيات الكالسيوم في خلايا الشعر الجانبية لسمك الزرد اليرقي

الملخص

المصدر: Lukasz, D., et al. تصوير الكالسيوم في الجسم الحي لخلايا الشعر الجانبية في يرقات الزرد. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو التصوير الحي لتدفق الكالسيوم في خلايا الشعر الجانبية ليرقة الزرد المعدلة وراثيا مشلولة باستخدام مجهر متحد البؤر. يحفز التحفيز الميكانيكي لحزم الشعر عبر نبضات السوائل دخول الكالسيوم من خلال قنوات النقل الميكانيكي والقنوات ذات الجهد الكهربائي ، والتي يتم تصورها في الوقت الفعلي باستخدام مؤشرات التألق. تسلط الطريقة الضوء على ديناميكيات الكالسيوم القمي والقاعدي في خلايا الشعر العصبية ، وتوضح دورها في اكتشاف حركة الماء.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تثبيت اليرقة وتثبيتها على غرفة التصوير
   1. استحم يرقة Tg (myo6b: GCaMP6s-caax) في حوالي 1 مل من المخزن المؤقت للجنين (E3) الذي يحتوي على 0.04٪ MS-222 لمدة 1-2 دقيقة على سطح مغلف السيليكون لغرفة التصوير حتى تصبح اليرقة غير متحركة أو لا تستجيب للمس.
      1. تحت المجهر المجسم ، ضع اليرقة في وسط غرفة التروية بحيث تكون مسطحة على جانبها مقابل مغلف السيليكون.
         ملاحظة: من أجل الاتساق ، قم دائما بتركيب اليرقات على نفس الجانب (على سبيل المثال ، الجانب الأيمن لأسفل ، الجانب الأيسر لأعلى) (الشكل 2B1).
   2. باستخدام ملقط دقيق ، أحضر دبوس رأس 0.035 مم عموديا على اليرقة والحجرة. أدخل دبوس الرأس بين العين وحويصلة الأذن وأسفل في المغلف (الشكلان 1B1 و 1B2). استخدم مجموعة ثانية من الملقط لتثبيت اليرقة على طول جانبها الظهري أو البطني أثناء التثبيت. تأكد من أن الجزء الأفقي من الدبوس يلامس اليرقة ولا يضغط على طول الطريق في الغلاف. قم بزاوية الدبوس بطنيا (الشكل 1B1) أو مشيرا قليلا نحو الجزء الأمامي من السمكة لتجنب التدخل في حقن القلب اللاحق وتصوير خلايا الشعر.
      1. باستخدام الملقط ، أدخل دبوس ذيل 0.025 مم في الحبل الظهري في أقرب وقت ممكن من نهاية الذيل (الشكل 1B1).
         ملاحظة: احرص على تجنب تمدد اليرقة. دبوس اليرقة بشكل مسطح. يجب أن تكون العيون متراكبة (الشكل 2 ب 1). هذا مهم جدا لسهولة حقن القلب (الشكل 1B2-B2 '، الخطوة 3) ، وتسهيل مستوى التصوير المرغوب فيه (الشكل 1B1-B2 '' ، الخطوات 5) ، وتحديد شدة التحفيز النفاث السائل (الشكل 3A3 ، الخطوة 4).
2. حقن α-Bungarotoxin في تجويف القلب لشل اليرقة

ملاحظة: ارتد القفازات عند التعامل مع α-bungarotoxin.

1. الطرد المركزي α-bungarotoxin aliquot لفترة وجيزة قبل الاستخدام لمنع انسداد إبرة حقن القلب.
   1. قم بإعادة ملء 3 ميكرولتر من محلول α-bungarotoxin في إبرة حقن القلب باستخدام طرف ماصة تحميل الجل. قم بتحميل المحلول بالتساوي على الحافة بدون فقاعات.
   2. أدخل إبرة حقن القلب في حامل ماصة متصل بمعالج دقيق يدوي. تحت المجهر المجسم ، ضع الإبرة بحيث تكون محاذاة بشكل عمودي على محور AP لليرقات المثبتة والمخدرة ، مشيرا إلى الأسفل بزاوية ~ 30 درجة.
   3. قم بتوصيل حامل الماصة بحاقن الضغط. قم بتطبيق الإعدادات المقترحة التالية: الحقن = 100 هيكتوباسكال ، الحقن = 0.5 ثانية ، والتعويض = 5 هيكتوباسكال. حقن بلعة في المحلول لاختبار ما إذا كان طرف الإبرة حاصلا على براءة اختراع أم لا.
   4. ابحث عن نفخة صغيرة من المحلول الأحمر (من الفينول الأحمر) لترك طرف الإبرة. إذا لم يظهر لون أحمر ، فقم بكشط طرف الإبرة برفق شديد على حافة الدبوس وحاول مرة أخرى حتى تحصل الإبرة على براءة اختراع. بدلا من ذلك ، اسحب إبرة بفتحة طرف أكبر.
2. ادفع الإبرة نحو القلب حتى تلامس الجلد خارج القلب (الشكل 1B2). اضغط على الإبرة في اليرقة وابحث عن مسافة بادئة للخلية الصبغية على الجلد أمام القلب للتأكد من وضع الإبرة في المستوى الصحيح بالنسبة لليرقة (الشكل 1B2 ').
   1. تقدم الإبرة إلى أبعد من ذلك حتى تخترق الجلد وتدخل تجويف القلب. اسحب الإبرة للخلف قليلا. حقن بلعة من α-bungarotoxin في تجويف القلب. ابحث عن تضخم تجويف القلب أو الصبغة الحمراء التي تدخل التجويف.
3. اشطف اليرقة برفق 3 مرات باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت العصبي (NB) لإزالة بقايا MS-222. لا تقم أبدا بإزالة كل السوائل. حافظ على اليرقة في حوالي 1 مل من NB على غرفة التروية.
   ملاحظة: تأكد من أن نبضات القلب واليرقات يظلان قويين بعد التثبيت وحقن القلب وطوال تجربة التصوير بأكملها.
4. إعداد المجهر وإعداد السوائل النفاثة
   1. قم بتجميع مجهر متحد البؤر المستقيم باستخدام المكونات الموضحة في جدول المواد: مجهر متحد البؤر مع ليزر 488 نانومتر ومرشحات مناسبة, برنامج مجهر للتحكم في التصوير والتحفيز وتنسيقه, هدف هوائي 10x, هدف مائي 60x, ماسح ضوئي موضوعي بيزو-Z (لمداخن z), كاميرا عالية السرعة, غرفة دائرية محول ، مرحلة آلية ، ومحول إدراج المرحلة.
   2. قم بتجميع نفاثة السوائل المكونة من 3 مكونات رئيسية: مضخة تفريغ وضغط ، ومشبك ضغط عالي السرعة ، ومرحلة الرأس (موصوفة أيضا في جدول المواد). استخدم مشبك الضغط عالي السرعة للتحكم في توقيت ومدة الضغط أو التفريغ الفراغي من مرحلة الرؤوس إلى ماصة السوائل النفاثة.
      1. قم بتوصيل إخراج مرحلة الرأس بحامل الماصة النفاثة السائلة عبر أنابيب سيليكون سميكة الجدران.
5. محاذاة اليرقة والسوائل النفاثة

ملاحظة: هناك 3 مستويات ذات أهمية داخل كل صاري عصبي: (1) أطراف حزم الشعر (الشكل 3A3: kinocilia ، المستخدمة لقياس شدة التحفيز) ؛ (2) مستوى النقل الميكانيكي لحزمة الشعر (MET) (الشكل 2B1-B1': قاعدة حزم الشعر القمي حيث يتم الكشف عن إشارات الكالسيوم المعتمدة على قناة MET) ؛ و (3) المستوى المشبكي (الشكل 2B2-B2': حيث يتم الكشف عن إشارات الكالسيوم قبل المشبك في قاعدة خلية الشعر). هذه الطائرات موضحة في الشكل 2 أ.

1. ردم 10 ميكرولتر من NB في إبرة نفاثة سائلة مكسورة بشكل صحيح باستخدام طرف تحميل الجل. قم بتحميل المحلول بالتساوي على الحافة بدون فقاعات. أدخل الإبرة في حامل الماصة المتصل بجهاز المعالجة الدقيقة الآلي.
2. ضع غرفة التروية في محول غرفة دائرية على مرحلة المجهر. ملاحظه: من أجل الاتساق ، ضع اليرقة دائما في نفس الاتجاه (على سبيل المثال ، الغرفة التي تحتوي على اليرقة مع مؤخرتها نحو نفاثة السوائل والجانب البطني المواجه نحو المجريب).
   1. حرك المرحلة الآلية بحيث تكون اليرقة في وسط مجال الرؤية. أدر محول الغرفة الدائرية بحيث يتماشى المحور الأمامي الخلفي (AP) لليرقة تقريبا مع مسار إبرة نفث السوائل.
   2. باستخدام الضوء المرسل وتباين التداخل التفاضلي (DIC) ، اجعل اليرقة في بؤرة التركيز ومركزها تحت هدف 10x. ارفع هدف 10x.
3. باستخدام الملاعب الدقيقة الآلية ، قم بإحضار إبرة السوائل النفاثة إلى وسط مجال الرؤية بحيث تضيء بالضوء المرسل وبالكاد تلمس محلول NB.
   1. خفض الهدف 10x. ركز على اليرقة لتأكيد موقعها. ركز لأعلى للعثور على إبرة السوائل النفاثة. حرك إبرة السوائل النفاثة باستخدام المعالج الدقيق في المحورين x و y حتى تصبح في وضع مواز للجانب الظهري للسمكة.
   2. ركز مرة أخرى على اليرقة. اخفض الإبرة في المحور z. ضع الإبرة على طول الجانب الظهري للأسماكة و ~ 1 مم بعيدا عن الجسم (الشكل 3 أ 1).
   3. حرك محول الغرفة الدائرية بعناية (إذا لزم الأمر) للتأكد من محاذاة إبرة السوائل النفاثة على طول خط الوسط AP لليرقة (الشكل 3A1).
   4. حرك المرحلة الآلية لوضع الصاري العصبي محل الاهتمام في وسط مجال الرؤية. احتفظ بطرف الإبرة النفاثة السائلة على طول الجانب الظهري للسمكة. لا تلمس طرف إبرة السوائل النفاثة إلى اليرقة أو سطح الغرفة.
4. قم بالتبديل إلى هدف الماء 60x. تأكد من أن الهدف منغمس في حل NB. استخدم التركيز البؤري الدقيق لتحديد موقع الصاري العصبي باستخدام الضوء المنقول وبصريات DIC.
   ملاحظة: تم تصميم هذا الإعداد لتحفيز الصواريخ العصبية على طول الخط الجانبي الخلفي الأساسي. تستجيب خلايا الشعر داخل هذه الصواريخ العصبية لتدفق السوائل الأمامي أو الخلفي.
   1. ضع إبرة السوائل النفاثة مع المعالج الدقيق بحيث تكون على بعد 100 ميكرومتر من الحافة الخارجية للصاري العصبي (الشكل 3A2).
      ملاحظة: اختر الصواري العصبية التي توفر مناظر واضحة من أعلى إلى أسفل (الأشكال 2B1 '-B2' والشكل 3A3) بدلا من المناظر ذات الزاوية الجانبية (الشكل 2C1-C2). يسمح العرض الواضح من أعلى إلى أسفل بالتصوير المتزامن لجميع حزم الشعر القمي في مستوى بصري واحد أو تصوير المناطق المشبكية في عدد أقل من المستويات البصرية (الشكل 3A3).
   2. ركز على أطراف حزم الشعر القمية (kinocilia) (الشكل 1 أ ، الشكلان 3A2 و 3A3). يجب أن يكون الجزء السفلي من إبرة السوائل النفاثة في بؤرة التركيز في هذه المستوى.
5. اضبط مشبك الضغط عالي السرعة من الوضع اليدوي إلى الوضع الخارجي لتلقي المدخلات من برنامج التصوير.
   1. صفر مشبك الضغط عالي السرعة بالضغط على الزر "صفر". استخدم مقبض نقطة الضبط لضبط ضغط الراحة إيجابيا قليلا (~ 2 مم زئبق). تأكد من إخراج الراحة لمشبك الضغط عالي السرعة باستخدام مقياس ضغط رطل لكل بوصة مربعة (PSI) متصل بإخراج مرحلة الرأس.
      ملاحظة: اضبط ضغطا إيجابيا قليلا أثناء السكون لتجنب الامتصاص التدريجي للسوائل في إبرة السوائل النفاثة بمرور الوقت. إذا دخل السائل إلى الأنبوب المتصل بنفاثة السوائل ووصل إلى مرحلة الرأس ، فقد يؤدي ذلك إلى إتلاف الجهاز.
   2. تحديد الضغط اللازم لتحفيز حزم الشعر. استخدم مدخلا 0.125 و 0.25 فولت (6.25 و 12.5 مم زئبق) لمدة 200-500 مللي ثانية لتطبيق حافز اختبار (الشكل 3A3-A3 '').
      ملاحظة: يقوم مشبك الضغط عالي السرعة بتحويل إدخال الجهد (من البرامج أو الأجهزة الأخرى التي تتصل بمنفذ Bayonet Neill-Concelman (BNC) على منفذ قيادة مشبك الضغط عالي السرعة) إلى ضغط يتم تفريغه من مرحلة الرأس ، وفي النهاية ، إبرة السوائل النفاثة (1.0 فولت = 50 مم زئبق ، بينما -1.0 فولت = -50 مم زئبق). في هذا التكوين (انظر الخطوة 4.2) ، يحرف الضغط الإيجابي (الدفع) حزم الشعر نحو الأمام ، والضغط السلبي (السحب) يحرف حزم الشعر نحو الخلف.
   3. باستخدام الضوء المرسل وبصريات DIC جنبا إلى جنب مع شريط المقياس ، قم بقياس مسافة الانحراف بمحفزات 6.25 و 12.5 مم زئبق لأطراف حزم الشعر ، kinocilia (الشكل 2 أ والشكل 3A3-3 بوصة). اختر ضغطا يحرك الحزم (كوحدة متماسكة واحدة) لمسافة 5 ميكرومتر تقريبا (الشكل 3A3 ''). تأكد من أن أطراف kinocilia تظل في بؤرة التركيز طوال الوقت.
   4. حرك ± النفاثة السائلة 25 ميكرومتر على طول محور AP لليرقة للعثور على مسافة وضغط يحرف أطراف kinocilia 5 ميكرومتر.
      ملاحظة: باستخدام GCaMP6s في اليرقات بعد 3-7 أيام من الإخصاب (dpf) ، يجب أن يحقق انحراف 5 ميكرومتر إشارات كالسيوم GCaMP6s شبه مشبعة ويجب ألا يتلف هياكل حزمة الشعر القمية (الشكل 3A3 ''). يمكن استخدام مسافات إزاحة أصغر لتقديم محفزات غير مشبعة (الشكل 3A3 '). يصعب تقدير مسافات الإزاحة >10 ميكرومتر (الشكل 3A3 ''') ويمكن أن تكون ضارة بمرور الوقت. يعتمد تشبع الإشارة على عمر الصاري العصبي (والارتفاع الحركي) بالإضافة إلى المؤشر المستخدم. تحقق من سالكية إبرة السوائل النفاثة في كل اتجاه (الضغط / الدفع والفراغ / السحب) بشكل دوري أثناء التصوير. تسد الإبر النفاثة السائلة بسهولة وتفقد سالكية الفراغ ، لكنها تحافظ على سالكية الضغط المتبقي. استخدم بصريات DIC وحافز اختبار قصير في كل اتجاه للتحقق من سالكية النفاثة السائلة.
   5. ركز العينة في مستوى الاهتمام (على سبيل المثال ، قاعدة حزم الشعر القمي أو قاعدة خلية الشعر في المستوى المشبكي ؛ الشكل 2B1-B2 ').
6. إجراء الحصول على التصوير: الاستحواذ على مستوى واحد

ملاحظة: يتم إجراء جميع الصور الموضحة في هذا البروتوكول في درجة حرارة الغرفة (RT).

1. اضبط برنامج التصوير للحصول على دفق أو استحواذ مستمر على 80 إطارا مع التقاط كل 100 مللي ثانية لتحقيق معدل إطارات يبلغ 10 هرتز.
2. اضبط الكسب وفتحة العدسة وطاقة الليزر لتحسين اكتشاف الإشارة ، ولكن تجنب التشبع والتبييض الضوئي والضوضاء. أمثلة على الإعدادات ل Opterra / SFC هي كما يلي: 488 نانومتر طاقة الليزر: 50 (طائرة MET حزمة الشعر) ، 75 (مستوى متشابك) ؛ شق 35 ميكرومتر ؛ الربح = 2.7 ؛ كسب EM = 3900.
   ملاحظة: قم بتطبيق 2 X binning إذا كانت الإشارات ضعيفة جدا أو صاخبة أو تحتوي على تبييض ضوئي مفرط. سيعزز 2 × binning اكتشاف الإشارة على حساب الدقة المكانية.
3. حدد حافزا لتقديمه أثناء الاستحواذ على 80 إطارا (8 ثوان) بعد الإطار 30 ، عند 3 ثانية
   ملاحظة: بعض الأمثلة على المحفزات هي كما يلي: 200 مللي ثانية (+ أو - 0.25 فولت) حتى 2 ثانية (+ أو - 0.25 فولت) خطوة في الاتجاه الأمامي أو الخلفي لتحديد الحساسية الاتجاهية لكل خلية شعرية ؛ 2 ثانية ، موجة مربعة 5 هرتز (0.25 فولت لمدة 200 مللي ثانية ، -0.25 فولت لمدة 200 مللي ثانية ، تتكرر 5 مرات) لتحفيز جميع خلايا الشعر في وقت واحد. الضغط الإيجابي (المنبه الأمامي) سينشط نصف خلايا الشعر. الضغط السلبي (المنبه الخلفي) سينشط النصف الآخر من خلايا الشعر. تأكد من أن برنامج أو جهاز التحفيز يعيد مشبك الضغط إلى 0 فولت بعد انتهاء التحفيز.
4. قياس استجابات الكالسيوم الحساسة للميكانيكا. ركز على قاعدة حزم الشعر القمي (الشكلان 2A و 2B1-B1 ') وابدأ في الحصول على الصورة.
   ملاحظة: إذا تم عرض الصاري العصبي بوضوح من أعلى إلى أسفل (الشكل 2B1-B1') ، فيمكن تصوير جميع حزم الشعر القمي في وقت واحد في مستوى واحد.
5. قياس استجابات الكالسيوم قبل المشبكي. ركز على قاعدة خلايا الشعر (الشكلان 2A و 2B2-B2 ') وابدأ في الحصول على الصورة.
   ملاحظة: إذا تم عرض الصاري العصبي بوضوح من أعلى إلى أسفل (الشكل 2B2-B2 ') ، فيمكن الحصول على مستويات التصوير قبل المشبكي لجميع خلايا الشعر في 2-3 طائرات متباعدة بمقدار 2 ميكرومتر. يمكن استخدام الأسماك المعدلة وراثيا Tg [myo6b: ribeye-mcherry] لتحديد وتحديد شرائط ما قبل المشبكي ومواقع دخول الكالسيوم.

النتائج

فئة الشكل = 'image image-style-align-center image_resized' style = 'display: table ؛ margin-left: auto ؛ margin-right: auto ؛ width: 75٪ ؛ '>

الشكل 1: غرفة التصوير ، وتركيب سمك الزرد وإجراءات حقن القلب ، والإبر. (أ) تظهر غرفة تصوير بها يرقة (محددة بمستطيل متقطع) مثبتة في المنتصف فوق مغلف السيليكون. (ب 1) يظهر يرقة 5 dpf تجميد بواسطة دبابيس. يتم وض...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات α-BungarotoxinR&D Systems 2133لشل اليرقات قبل التصويرغرفة التصويرSiskiyouPC-RPlatform لتركيب اليرقات للتصويررقم 1.5 مربع Coverslips ، 22 * 22 ممVWR48366-227لختم غرفة التصويرشحم سيليكون عالي الفراغفيشر ساينتيك14-635-5Dلتثبيت غطاء على غرفة التصويرمغلف سيليكون شفاف 0.5 جرام مجموعةEllsworth المواد اللاصقةداو كورنينج سيلجارد ، 184 SIL ELAST KIT 0.5 كجململء غرفة التصوير لإنشاء سطح لتثبيت الأسماكمجهر مجسمكارل زايس المجهر المجهريStemi 2000 مع إضاءة الضوء المنقولةلإضاءة الأسلاك والملقط والمقص لصنع المساميرملقط دقيقأدوات العلومالدقيقة Dumont # 5 (0.05 × 0.02 مم) رقم الصنف 11295-10لصنع دبابيسمقص ناعمCole-Palmer5.5 "، EW-10818-00لقطع سلك tunsgten لصنع دبابيسسلك التنغستن ، 0.035 ممGoodfellowW005131لدبابيس الرأس لتثبيت اليرقاتسلك التنغستن ، 0.025 ممThermoFischer ScientificAA10405-H4لدبابيس الذيل لشل حركة اليرقاتالشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات بدون خيوطSutter Instrument CompanyB 150-86-10الزجاج ليتم سحبه إلى إبر نفاثة سائلة لتحفيز خلايا الشعرملقط ناعمأدوات العلومالدقيقة Dumont # 5 (0.05 × 0.02 مم) رقم الصنف 11295-10لتثبيتيرقات جل نصائح التحميلEppendorf5242956003لردم إبر حقن القلبالمجهريCarl ZeissStemi 2000 مع إضاءة الضوء المنقولةلإضاءة اليرقات أثناء التثبيت وحقن القلب حامل الشعيرات الدموية / الإبرة الزجاجيةWPIMPH315لعقد الإبر النفاثةالسائلة مناور دقيق يدويNarishigeM-152لعقد ووضع حامل الإبرة لحقن حامل مغناطيسي α-bungarotoxinNarishigeGJ-1لعقد المشغل الدقيق اليدوي لحقن α-bungarotoxinحاقن الضغطEppendorfFemtojet 4xلتوصيل مجهر متحد البؤر α-bungarotoxinBrukerمجهر متحد البؤر / Opterra مجهر متحد البؤرمجهر ثابت ومستقيم مع بصريات DIC وليزر 488 نانومتر مع مرشحات مناسبةبرنامج مجهرBrukerPrairieview 5.3لتنسيق والتحكم في المجهر والليزر والمرحلة و piezo-z والكاميرات والسوائلالنفاثة الهدف الجوي 10xنيكونMRH00101تكبير منخفض لتحديد مواقع اليرقات والسوائل النفاثة60x الهدف المائينيكونMRF07620هدف الغمر في الماء مع NA مرتفع (1.0) ومسافة عمل كافية (2.0 مم)ماسح ضوئي موضوعي Piezo-Z مع وحدة تحكم / سائقأدوات Physik Intruments / Bruker01144210 / UM-Z-PZاقتناء Z-stack عالي السرعة بدقة 0.025umكاميرا EMCCDكاميرا كاميرا QimagingRolera EM-C2 EMCCDبحجم بكسل صغير يمكنه الحصول على ما يصل إلى 100 إطار لكلثانية محول غرفة دائريةSiskiyouPC-Aلعقد وتدوير غرفة التصوير على مرحلة المجهرمرحلة Z-deck الآلية مرحلة المجهر ZDN12MP العلمية السابقةالتي يمكنها حمل وتحريك العينة والمناوير الدقيق بإبرة نفاثة سائلة معامحول إدراج مرحلة Z-deck متجر آلةNIH مخصصلتناسب محول الغرفة الدائرية على مرحلة z-deckجهاز السوائل النفاثةALA الأدوات العلميةHSPC-1 مشبك الضغط عالي السرعة مع PV-PUMPللتحكم في وتوصيل التحفيز النفاث للسوائل أنابيب السيليكون المعالجة بالبيروكسيد Masterflex (1 قدم) Cole-PalmerMasterflex L / S 13 ، 96400-13لتوصيل حامل الإبرة النفاثة السائلة بمضخة الضغطمناور دقيق بمحركاتSutter Instrument CompanyMP-225لتثبيت ووضع حامل الإبرة للسوائل النفاثةMicromanipulator تحكمSutter Instrument CompanyMPC-200للتحكم في مناور إبرة السوائل النفاثةنصائح تحميل الجلEppendorf5242956003لردم الإبر النفاثة السائلة حامل الشعيرات الدموية / الإبرة الزجاجيةWPIMPH315لعقد الإبر النفاثةالسائلة PSI مقياس ضغطSper Scientific840081 للقياس إخراج مشبك الضغطPrism7GraphpadPrism7Software لرسم تغييرات شدة GCaMP6FIJISchindelin, et., al.34https://fiji.sc/ برنامج لمعالجة الصور وإنشاء خرائط إشارة مكانية وزمانيةTurboreg PluginThévenaz et., al.29http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ البرنامج المساعد لتسجيل تسلسلات صور GCaMP6 في FIJIStackReg PluginThévenaz et., al.29http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ Plugin لتسجيل تسلسلات صور GCaMP6 في FIJITimes Series Analyzer V3 PluginBalaji J 2007 ، قسم علم الأعصاب ، جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.htmlالبرنامج المساعد لإنشاء عائد استثمار متعدد لقياس تغيرات شدة GCaMP6