صياغة نظام ناقل للإكسوسوم المحمل بالدوبامين

الملخص

المصدر: Yavuz, B., et al. صياغة وتوصيف نظام ناقل الدوبامين القائم على الإكسوزوم. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو صياغة الإكسوسومات المحملة بالدوبامين ، مع التركيز على نفاذية الغشاء الناجم عن الصابونين لتعزيز تغليف الدوبامين داخل الإكسوسومات.

البروتوكول

1. تحميل الدوبامين في الإكسوسومات

ملاحظة: بعد اكتمال توصيف الإكسوسومات الجذعية لللحمة المتوسطة من وارتون (WJ-MSCs) ، تم الحصول على الإكسوسومات المحملة بالدوبامين كنظام توصيل للأدوية. يتم تحميل الدواء في الإكسوسومات باستخدام طريقة الحضانة.

1. أضف 3 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) إلى معلق الإكسوزوم. قم بتعقيم المعلق المخفف عن طريق الترشيح باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر. انقل 500 ميكرولتر من معلق الإكسوسوم المعقم إلى أنبوب آخر.
2. تحضير محلول الدوبامين (0.5 مجم / مل) بالماء المقطر. أضف 500 ميكرولتر من محلول الدوبامين إلى الأنابيب التي تحتوي على الإكسوسومات.
3. أضف الصابونين إلى التعليق في الخطوة 1.2. احتضان معلق الإكسوسوم الدوبامين المحضر لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: يجب ألا يتجاوز تركيز الصابونين 0.002٪ من المحلول الكلي.
جهاز
4. الطرد المركزي الفائق التعليق عند 90,000 × غرام لمدة 70 دقيقة لإزالة الدوبامين والصابونين الحرين من الوسط. قم بتخزين الإكسوسومات المعزولة عند -20 درجة مئوية حتى استخدامها لمزيد من التحليل. ملاحظه: أضف 0.02٪ حمض الأسكوربيك لاستقرار محلول الدوبامين المحضر.

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.22 μm membrane filterAisimo يستخدم لعملية التعقيم15 مل Falcon tubeNest يستخدم في زراعة الخلايا الخطوة50 مل Falcon tubeNest المستخدم في الخلية خطوة الثقافةالطرد المركزيهيتاشيCF16RNالمستخدمة في خطوة عزل الإكسوسومهيدروكلوريد الدوبامين H8502-10GSigmaH8502-10Gالمستخدمة في تحميل الدوبامين الإكسوسومOptima XPN-100 Ultra CentrifugeBeckman Coulter المستخدمة في خطوة عزل الإكسوسومPBS اللوحيBiomatik43602في إعداد محلول PBSSaponinSigma47036-50G-Fتم استخدامه عن طريق إضافته إلى المحلول الكلي في عملية تحميل الدوبامين الخارجي.الخلايا الجذعية الوسيطة الهلامية من وارتونATCC