$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.
1. التحضير
< نمط p = 'الهامش الأيسر: 40 بكسل ؛'>1. ندف كل عضلة في حزم ألياف صغيرة بعرض حوالي 1 مم باستخدام ملقطين مسننة دقيقة.
NOTE: من الأهمية بمكان معالجة العضلات برفق شديد باستخدام الملقط، دون قوة مفرطة، لمنع تلف الأنسجة أثناء المضايقة.
1. فصل عضلة الظنبوب الأمامية (TA) إلى 3 أو 4 حزم حسب حجمها.
2. بالنسبة للمعدة (GA) ، افصل الأجزاء الإنسية والجانبية من العضلات ثم افصل كل جزء إلى 4-5 حزم حسب حجمها.
2. Immunostaining
1. استمر في نفاذية ألياف العضلات: انقل حزم العضلات إلى ألواح ذات 24 بئرا تحتوي على 1٪ (حجم / حجم) Triton X-100 في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) واحتفظ بها تحت تحريض لطيف (50 دورة في الدقيقة) لمدة 1 ساعة عند RT أو 5 ساعات عند 4 درجات مئوية.
NOTE: قم بتقسيم حزم العضلات بين لوحين للمضي قدما في البقع المناعية المنفصلة ولتقليل خطر حدوث ارتباك في الأجسام المضادة. لا تقسمها إلى أكثر من بئرين (1 بئر / لوحة) ؛ خلاف ذلك ، قد يكون عدد (N) من الوصلات العصبية العضلية (NMJs) التي تمثل حالتها العامة في العضلات التي تم تحليلها غير كاف.
2. اغسل العينات 3x لمدة 5 دقائق باستخدام PBS في RT واحتضانها بمحلول مانع يتكون من 4٪ ألبومين مصل بقري (BSA) في PBS / Triton X-100 1٪ لمدة 4 ساعات عند 4 درجات مئوية ، تحت تحريض لطيف (50 دورة في الدقيقة).
ملاحظة: لا تستخدم مضخة الشفط أثناء خطوات الغسيل، بل استنشق المحلول يدويا باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر وأطراف صغيرة الحجم (يشار إلى المرجع في جدول المواد).
3. احتضان العينات بين عشية وضحاها (O / N) عند 4 درجات مئوية تحت تحريض لطيف (50 دورة في الدقيقة) مع محلول الحجب الموضح في الخطوة 2.2 الذي يحتوي على أجسام مضادة أولية أحادية النسيلة ضد إما الخيوط العصبية M (NF-M ، 2H3 ، التخفيف 1/200) أو البروتين السكري الحويصلة المشبكية 2 (SV2 ، التخفيف 1/200) لتسمية أطراف المحور العصبي قبل المشبكي أو المناطق النشطة ، على التوالي.
4. في اليوم التالي ، اغسل حزم العضلات 3x لمدة 5 دقائق في PBS تحت التحريض (50 دورة في الدقيقة).
1. للتصوير متحد البؤر: احتضان حزم العضلات بأجسام مضادة ثانوية مضادة للفئران مترافقة مع فلوروفور باعث أحمر (F594) (تخفيف 1/500) و α-bongarotoxin مترافق مع فلوروفور ينبعث منه اللون الأخضر (α-BTX-F488) (التخفيف 1/1000) في PBS لمدة ساعتين في RT تحت التحريض (50 دورة في الدقيقة).
2. لتصوير استنفاد الانبعاث المحفز (STED): احتضان حزم العضلات بأجسام مضادة ثانوية مضادة للفئران مقترنة بفلوروفور باعث من اللون الأخضر (F488) (التخفيف 1/500) و α-bungarotoxin مترافق مع فلوروفور انبعاث من اللون الأحمر البعيد يتميز بثبات ضوئي عال (α-BTX-F633) (التخفيف 1/1000) في PBS لمدة ساعتين في RT تحت التحريض (50 دورة في الدقيقة).
NOTE: لا تعرض العينات للضوء أثناء الحضانة لتجنب التبييض الضوئي.
5. اغسل حزم العضلات المسماة 3x لمدة 5 دقائق باستخدام PBS تحت التحريك (50 دورة في الدقيقة) وضعها على شريحة بوسيط تثبيت.
ملاحظة: ضع 4 إلى 5 حزم عضلية كحد أقصى لكل شريحة للسماح بالختم.
6. أضف غطاء زجاجي من الدرجة # 1.5 (أو # 1.5H) (سمك 0.17 مم) في الأعلى ، وضع مغناطيسات أسطوانية على جانبي الشريحة للضغط وتسطيح العضلات.
7. حافظ على الشرائح محمية من O / N الخفيف عند 4 درجات مئوية.
3. الحصول على الصورة
1. عمليات الاستحواذ بواسطة المجهر متحد البؤر
ملاحظة: تم جمع الصور باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر المقلوب باستخدام هدف غمر الزيت بحجم 63x (HCX Plan Apo CS، 1.4 فتحة عددية (NA)).
1. للتحليل الأعمى، دع الشخص غير المشارك في التحليل يقوم بترميز كل شريحة برقم معين. ابق أعمى عن المجموعات التجريبية حتى يكتمل القياس الكمي لمعلمات NMJ لجميع العينات.
2. قم بتشغيل برنامج المجهر في وضع التكوين > >machine.xlhw.
3. ضع الشريحة على مرحلة المجهر وابحث عن مستوى المراقبة داخل العينة من خلال النظر تحت إضاءة التألق واسعة المجال DAPI باستخدام مجموعة مرشح DAPI.
4.انقر فوق فتح مشروع > مشاريع> جديدة وأنشئ مجلدا لتخزين عمليات الحصول على الصور.
ملاحظة: قم بإنشاء مشروع جديد لكل NMJ للحد من حجم المجلد ومنع مشكلات ذاكرة الكمبيوتر.
5. لإدارة معلمات الاستحواذ، انقر فوق نافذة علامة التبويب Acquisition واضبط الثقب متحد البؤر على وحدة Airy 1.0 وطاقة الليزر لتحسين مستويات الكسب والإزاحة للتألق الأخضر/F488 (α-BTX) باستخدام ليزر 488 نانومتر في اللوحة النهائية التي يجب تصويرها (الوضع المباشر ON).
6. بعد ذلك، قم بتحسين اكتساب التألق الأحمر / F594 (NF-M أو SV2) باستخدام ليزر يتكيف مع الملاحظة F594. في هذه الدراسة ، تم استخدام ليزر 552 نانومتر (الوضع المباشر ON). اضبط طيف انبعاث الصبغة بالنطاقات التالية لكل ليزر: الليزر 405 (DAPI) من 414 إلى 483 نانومتر ، والليزر 488 (F488-α-BTX) من 506-531 نانومتر ، والليزر 552 (NFM / SV2) من 622-650 نانومتر.
7. اجمع مجموعات الصور من التقاطعات العصبية العضلية في كل مجموعة تجريبية بنفس الإعدادات: حجم الصورة 1024 × 1024 بكسل (73.7 × 73.7 ميكرومتر) بمعدل أخذ عينات 400 هرتز، ثنائي الاتجاه X ON، عامل التكبير/التصغير 2.5، حجم الخطوة Z 0.5 ميكرومتر في الوضع Z-Wide.
NOTE: لكل NMJ ، يتم تعيين عدد الشرائح للحصول على التقاطع بالكامل. تفي إعدادات الاستحواذ الموضحة أعلاه بنظرية أخذ العينات Nyquist-Shanon. ومع ذلك ، يمكن للمستخدم النقر فوق الزر "تحسين التنسيق" ، الموجود في جميع برامج التشغيل البؤرية الحديثة ، لضمان أن حجم البكسل وخطوة Z يلبيان معدل أخذ العينات المثالي ل Nyquist. سيؤدي هذا الإجراء إلى تجنب الصور التي تم أخذ عينات منها أكثر من اللازم أو ناقصا، مما يؤدي إلى فقدان الدقة في قياسات الحجم.
8. احفظ الملف الأصلي (.lif) أو صور Z-stack (.tif) في مجلد باسم يتضمن الاسم الرمزي للشريحة ونوع التلوين ورقم اللوحة الطرفية.
ملاحظة: اجمع عمليات المسح بالتتابع (وليس في وقت واحد) باستخدام ليزر 488 نانومتر و 552 نانومتر (F488 و F594) لتجنب الحديث المتبادل بين تألق F488 في قناة F594 والعكس صحيح (النزيف). يمكن تكوين مسار الشعاع باستخدام مساعد الصبغ في برنامج المجهر.
9. قم بالتغيير إلى الشريحة المشفرة التالية وكرر الخطوات 3.1.3-3.1.8 لكل NMJ.
10. في نهاية الجلسة، انقر فوق فتح في 3D Viewer واختر ممثل NMJ لمجموعة تجريبية لتصور التسمية ثلاثية الأبعاد.
ملاحظة: سيساعد وضع العرض هذا في التحقق من صحة معلمات الاكتساب.
11. أغلق برنامج المجهر، ونظف الأهداف بمناديل العدسة، ثم قم بإيقاف تشغيل النظام.
2. عمليات الاستحواذ بواسطة الفحص المجهري STED
ملاحظة: تم جمع الصور باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر المقلوب المجهز بنظام STED المسور عند 775 نانومتر باستخدام هدف غمر الزيت 100x (HC PL APO CS2 1.4 NA).
1. للتحليل الأعمى، دع الشخص غير المشارك في التحليل يقوم بترميز كل شريحة برقم معين. ابق أعمى عن المجموعات التجريبية حتى يكتمل القياس الكمي لمعلمات NMJ لجميع العينات.
2. قم بتشغيل برنامج المجهر في وضع التكوين > machine.xlhw و STED ON.
3. انقر فوق فتح المشروع > مشاريع جديدة لإنشاء مجلد لتخزين عمليات الحصول على الصور.
>NOTE: قم بإنشاء مجلد جديد لكل شريحة للحد من حجم المجلد ومنع مشكلات ذاكرة الكمبيوتر.
4. ضع الشريحة على مرحلة المجهر واعرضها تحت إضاءة مضان واسعة المجال باستخدام ليزر 488 نانومتر للعثور على مستوى المراقبة داخل العينة.
5. ابحث عن NMJ المسمى بتلطيخ الخيوط العصبية M (NFM) أو SV2 باستخدام ليزر 488 نانومتر مع اكتشاف طيفي من 506-531 نانومتر.
6. عندما يتم تحديد NMJ ، انقر فوق تنشيط STED وابدأ في الحصول على الصور في منطقة تحتوي على عدة طيات وصلية باستخدام ليزر 635 نانومتر مع اكتشاف طيفي من 640-750 نانومتر.
>ملاحظة: كن حذرا لجدول البحث عن التشبع أثناء الحصول على الصورة وانقر فوق جدول البحث السريع زر لتجنب التعرض المفرط (القيم الرمادية >255 ؛ لمدة 8 بت).
7. اجمع صور كل مجموعة تجريبية بنفس الإعدادات: حجم الصورة 2048 × 2048 بكسل (38.75 × 38.75 ميكرومتر) بمعدل أخذ عينات 400 هرتز.
ملاحظة: تم ضبط طاقة ليزر النضوب (STED) على 65٪.
8. احفظ الصور باسم ملف يتضمن رمز الشريحة.
ملاحظة: من الممكن النقر فوق تنسيق XY الأمثل: تعيين التنسيق للحصول على أفضل إعداد اكتساب باستخدام تصوير STED.
9. قم بالتغيير إلى الشريحة المشفرة التالية وكرر الخطوات 3.2.3-3.2.8. كرر هذا الإجراء لجميع الشرائح.
10. في نهاية جلسة الفحص المجهري STED، انقل ملفات الصور إلى كمبيوتر آخر واحفظ الملفات الأصلية (.lif) في محرك أقراص أو خادم خارجي.
11. قم بإيقاف تشغيل برنامج المجهر، وتنظيف الأهداف بأنسجة العدسة، ثم قم بإيقاف تشغيل النظام.