التصوير في الجسم الحي لنقل السائل الدماغي النخاعي في دماغ الفأر باستخدام تنظير الماكروس الفلوري

الملخص

المصدر: Sweeney, A. M., et al. التصوير في الجسم الحي لنقل السائل الدماغي النخاعي من خلال جمجمة الفأر السليمة باستخدام الفحص المجهري الفلوري. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو عملية تصور تدفق السائل الدماغي النخاعي (CSF) في دماغ الفأر باستخدام التصوير الفلوري. يتم حقن متتبع الفلورسنت في صهريج الصهريج (CM) ، مما يسمح بحركته باستخدام السائل الدماغي النخاعي ليتم تتبعه من خلال الفراغات تحت العنكبوتية وحول الأوعية الدموية. يلتقط التصوير بفاصل زمني رحلة المتتبع ، ويسلط الضوء على توزيعه في أنسجة المخ عبر الشرايين.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تحضير قنية الصهريج ولوحة الرأس وحامل الرأس

1. تعقيم جميع الأدوات الجراحية وألواح الرأس قبل الجراحة.
   ملاحظة: يتم تسليم متتبعات الفلورسنت مباشرة إلى السائل الدماغي النخاعي عبر قنية الصهريج.
2. باختصار ، باستخدام محرك إبرة ، اكسر طرف إبرة 30 جم × 12.7 مم (1/2 بوصة) ، 3/4 من الطريق لأسفل ، وضع الطرف الحاد للإبرة في أحد طرفي أنبوب البولي إيثيلين 10 (PE10) (حوالي 45 سم). تأكد من أن الشطبة فقط هي التي تبرز خارج حدود أنبوب PE10.
3. اقطع 1/4 من الطرف المشطوف لإبرة 30G أخرى وضع الطرف الحاد للإبرة المتبقية في الطرف الآخر من أنبوب PE10 ، مع استمرار تثبيت قفل Luer البلاستيكي.
4. املأ حقنة زجاجية سعة 100 ميكرولتر بالسائل الدماغي النخاعي المعقم والاصطناعي (aCSF: 126 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.5 ملي كلوريد الصوديوم ، 1.25 ملي هيدروكسيد_{الصوديوم 2}PO₄ ، 2 ملي مولار MgSO₄ ، 2 ملي CaCl₂ ، 10 ملي جلوكوز ، و 26 ملي NaHCO₃).
5. اربط المحقنة بنهاية الخط واملأها ب aCSF حتى تصل إلى طرف الإبرة المشطوفة. من المهم أن يتم ردم المحقنة ب aCSF وليس الهواء ، حيث أن عمود الهواء أكثر عرضة لأحجام التسريب المتغيرة.
6. بالنسبة للتجارب المزمنة ، اترك الخط ممتلئا ب aCSF وتخطي الخطوة 1.7.
7. بالنسبة للتجارب الحادة ، ضع المحقنة على مضخة التسريب واسحب ما يقرب من 5 مم من الهواء ، مما يمنع الاختلاط. بعد ذلك ، اسحب الحجم الإجمالي لجهاز التتبع (المقتبات) المطلوب للتجربة (يوصى ب 20٪ إضافية بسبب فقدان المساحة الميتة).
   ملاحظة: يجب أن يكون أنبوب PE10 طويلا بما يكفي بحيث لا تدخل فقاعة الهواء إلى الكفة البلاستيكية للحقنة الزجاجية عند تحميل جهاز التتبع. بالنسبة لتجربة نموذجية ، يستخدم البروتوكول 10 ميكرولتر من ألبومين مصل الأبقار المقترن ب Alexa Fluor 647 (BSA-647) المخفف في aCSF بنسبة 0.5٪.
8. تأكد من أن لوحة الرأس تتناسب مع حامل الرأس وأنها بالحجم المناسب للماوس المستخدم. العلامات التشريحية لضمان ذلك هي: يتماشى الحد العلوي للنافذة مع الخط بين العينين ويقع الحد الخلفي منقاريا إلى القمة القذالية.
   ملاحظة: يمكن تعقيم ألواح الرأس المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ وإعادة استخدامها. يمكن إزالة معظم مخاليط السيانواكريلات بمحلول الأسيتون.

2. الإجراء الجراحي

1. وزن الفأر وتخديره (مثل الكيتامين / الزيلازين ؛ 100 مجم / كجم من الكيتامين ، 10 مجم / كجم زيلازين ؛ الوضع).
2. بمجرد أن لا يستجيب الفأر لقرص إصبع القدم ، بلل الرقبة والرأس بالماء المعقم واحلق باستخدام المقص. بمجرد حلق المنطقة ، امسح المنطقة بقطعة كحول مرة أخرى لإزالة أي شعر متبقي.
   ملاحظة: يؤدي ترطيب الفراء قبل القص إلى تقليل كمية الشعر في نافذة التصوير بعد الشق بشكل كبير.
3. ضع الماوس في إطار تجسيمي فوق وسادة يتم التحكم في درجة حرارتها وقم بتطبيق مرهم العيون البترولي على عيون الماوس لضمان عدم جفافها.
4. نظف الجلد المكشوف بمسحة الكلورهيكسيدين. بعد 2 دقيقة ، قم بإزالة الكلورهيكسيدين بمنديل كحولي. أخيرا ، ضع محلول اليود الذي يمكن تركه حتى يجف.
5. حقن تسكين تحت الجلد (0.25٪ بوبيفاكائين حمض الهيدروكلوريد) في الجزء العلوي من الجمجمة والرقبة.
6. بدءا من جزء الرقبة الذي يغطي القمة القذالية ، قم بعمل قطع خط الوسط في الجلد المغطى واستمر بشكل مؤخر نحو الخط بين الحجاج. شق جانبي إلى الحدود حيث تدخل العضلة الصدغية في الجمجمة. قم بإزالة كل جلد الشق المغزلي لفضح كل من العظام الأمامية والجدارية على حد سواء.
   تنبيه: يقع الجيب خلف الحجاج الذيلية للعينين والفروع الكبيرة للوريد الخلفي للوجه تقع المنقارية على الصيوان. كن حذرا عند إجراء شق لتجنيب هذه الهياكل. إذا حدث هذا ، فتوقف عن النزيف عن طريق الحفاظ على الإرقاء باستخدام قطعة قطن معقمة لعدة دقائق واستمر.
قم
7. بري الجمجمة بمحلول ملحي معقم ونظف السطح باستخدام مسحات قطنية بحيث تكون خالية من الحطام والشعر لأنها ستتداخل مع جودة الصورة. من الأفضل الحفاظ على شفافية الجمجمة عن طريق ترك السمحاق واللفافة المغطى سليمة.
   ملاحظة: إذا تمت إزالة هذه الهياكل عن طريق الخطأ ، يمكن أن تصبح الجمجمة جافة وغير شفافة بمرور الوقت. أعد ترطيبها باستخدام aCSF أو استخدم مزيجا من زيت البارافين والجلسرين لتقليل انعكاس الجمجمة في التجارب الحادة.
8. انتقل إلى إدخال صهريج ماجنا قنية.
9. بعد إدخال قنية CM ، ضع مزيجا من الأسمنت السني مع غراء cyanoacrylate على الجانب البطني من لوحة الرأس حول الحدود وضعه على الجمجمة بحيث يتماشى الحد الأمامي للوحة الرأس مع الطرف الخلفي لعظم الأنف ويتماشى الحد الخلفي مع الجانب الأمامي للعظم الجداري ، التأكد من أن الخيط السهمي (خط الوسط) في المنتصف ومستقيم بالنسبة للنافذة (الشكل 1 ب).
10. قم بإصلاح موضع لوحة الرأس باستخدام بضع قطرات من مسرع الغراء. املأ أي فجوات متبقية بخليط الأسمنت وقم بمعالجتها باستخدام المسرع.
    تنبيه: تأكد من أن السيانواكريلات لا يتلامس مع عيون الماوس أو يسد نافذة التصوير.
11. قم بلصق قنية CM على لوحة الرأس للتأكد من عدم انفصالها أثناء النقل أو عند استيقاظ الفأر.
12. بالنسبة للتجارب الحادة، انتقل إلى الخطوة 2.16.
13. بالنسبة للتجارب المزمنة ، ضع طبقة رقيقة من غراء سيانواكريليت المجفف بشكل واضح على الجمجمة المكشوفة ، مع الحرص على عدم تكوين فقاعات لأنها ستتداخل مع التصوير. يوفر الغراء الحماية للجمجمة ولن يتداخل مع التصوير. تأكد من أن الغراء يغطي الجمجمة المكشوفة على طول الطريق إلى الجلد عند حدود الشق.
14. استخدم مشبك الإرقاء لتثبيت أنبوب PE10 المملوء ب aCSF على بعد 2-3 سم من CM وقطع الخط بطرف كي بدرجة حرارة عالية. بمجرد فصله ، قم بتسطيح أنبوب PE10 المذاب لإغلاق القنية.
    تنبيه: تأكد من عدم تحرير المشبك إلا بعد إغلاق القنية وتأكد من عدم وجود تسرب في الأنبوب لمنع ناسور السائل الدماغي النخاعي.
15. يجب إعطاء الكاربروفين (5 ملغ/كغ كل 24 ساعة لمدة 3 أيام؛ داخل الصفاق [IP] أو تحت الجلد [SC]) وإعادة الفأر إلى قفص واحد يتم التحكم في درجة حرارته والسماح له بالتعافي لمدة 24 ساعة على الأقل قبل التصوير. لا تترك الفأر دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الرضوخ القصي. تظل نوافذ الجمجمة السليمة مستقرة لعدة أسابيع. ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة المزمنة مؤقتا هنا.
    CAUTION: بعض مضاعفات ما بعد الجراحة هي: ورم دماغي / ورم دموي تحت المجالة ، ناسور السائل الدماغي النخاعي ، والعدوى.
16. بالنسبة للتجارب الحادة، ضع الماوس في حامل الرأس باستخدام لوحة الرأس بحيث تكون الجمجمة في وضع ثابت. تأكد من التحقق من مستوى التخدير ووضع وسادة تدفئة تحت الماوس. الماوس جاهز الآن لنقله إلى المنظار.
    تنبيه: انقل الماوس بعناية مع مضخة التسريب على عربة. إذا تم إزاحة قنية CM ، فسيؤدي ذلك إلى انخفاض في الضغط داخل الجمجمة وسيؤدي أي تسرب للقذائع الدماغية الشوكية إلى تغيير النتائج التجريبية.

3. تحضير الماوس للتصوير

ملاحظة: يختلف البروتوكول اعتمادا على ما إذا كان سيتم إجراء تجربة التصوير على ماوس مخدر (ابدأ من الخطوة 3.1) أو مستيقظا (ابدأ من الخطوة 3.2).

1. الفئران المخدرة
   1. ضع حامل الرأس على مسرح المنظار الكبير، مع التأكد من عدم وجود مكامن الخلل في الخط من مضخة الحقنة إلى قنية CM وأنها ليست مشدودة لأن هذا قد يؤثر على ضخ المتتبع.
   2. راقب معدل التنفس واللون الوردي للأغشية المخاطية ، مما يشير إلى الأكسجين الجيد. حقن المحلول الملحي تحت الجلد لضمان مستوى الترطيب إذا لزم الأمر. تحقق للتأكد من تخدير بشكل كاف وأعد جرعته إذا لزم الأمر.
   3. قم بتشغيل كاميرا الماكروسكوب والصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) وابدأ وضع LIVE.
   4. تأكد من تكبير مجال التصوير بحيث يمكن تصور الخيط الأنفي الجبهي في الجزء العلوي من الحقل والخياطة اللامدوية في الأسفل بوضوح ، مع وجود خياطة سهمية موازية ومتمركزة في منتصف الصورة (الشكل 1C). بمجرد وضعه في مكانه ، قم بتثبيت حامل الرأس في مرحلة الماكرسكوب بشريط لاصق.
   5. ركز المنظار على الجمجمة المكشوفة. على الرغم من أن المرافق الكبيرة لها عمق مجال كبير نسبيا ، إلا أن انحناء جمجمة الفأر يسمح فقط بتركيز منطقة معينة. يتم الحصول على أفضل النتائج عندما يكون المستوى البؤري موجودا على الجوانب الجانبية للعظام الجداري الخلفية للخيوط الإكليلية.
      ملاحظة: هذا هو موقع الشرايين الدماغية الوسطى (MCA) ، حيث يحدث معظم تدفق CSF (الشكل 1D ، E).
2. Awake Mice
   1. قبل جلسة التصوير ، دع تتعافى لمدة 24 ساعة على الأقل من جراحة صفيحة الرأس. يوصى أيضا بفترات نقاهة أطول (5-7 أيام). خلال هذا الوقت ، قم بتدريب الماوس على أن يكون ثابتا على المسرح في أنبوب ضبط النفس لمدة 0.5-1 ساعة يوميا طوال فترة التعافي.
      ملاحظة: يسمح التعود بربط الماوس بحامل الرأس دون تخدير ويقلل من التوتر والقلق أثناء التجربة الفعلية. إذا لم يكن ذلك ممكنا ولم يتداخل التخدير مع التجربة ، فيمكن استخدام جرعة تحريضية من مخدر مستنشق (على سبيل المثال ، إيزوفلوران 2٪ بمعدل تدفق 1-2 لتر / دقيقة O2) لربط الماوس بسرعة بمرحلة الرأس.
   2. بمجرد تثبيت الماوس على حامل الرأس وفي أنبوب التقييد، اتبع الخطوات 3.1.1-3.1.5.

4. ضخ متتبعات السائل الدماغي النخاعي الفلورية

1. Acute CM Cannulation
   1. نظرا لأن جهاز التتبع قد تم تحميله بالفعل في القنية قبل وضعه في صهريج الصهريج في الخطوة 1.6 ، اضبط مضخة التسريب على المعدل والحجم المطلوبين. نماذج التسريب المستخدمة بشكل روتيني هي 5-10 ميكرولتر عند 1-2 ميكرولتر / دقيقة ، ولكن يمكن تعديل هذه المعلمات اعتمادا على تجربة معينة ، أو حجم وعمره.
2. قنية CM المزمنة
   1. قبل بدء جلسة التصوير، اتبع الخطوات 1.2-1.7 للتجارب الحادة لإعداد خط التسريب لتوصيل أجهزة التتبع.
   2. بمجرد تحضير الخط ، باستخدام مشبك الإرقاء ، قم بقطع الطرف المغلق لقنية CM المزمنة. خذ الإبرة من الخط المعد في الخطوة 4.2.1 وأدخلها برفق في القنية. حرر المشبك وباستخدام مضخة الحقنة ، قم بتقديم متتبع السائل الدماغي النخاعي بمعدل التسريب المطلوب (على سبيل المثال ، 2 ميكرولتر / دقيقة) للتجربة حتى يصل المتتبع إلى الإبرة المزروعة في CM.
      تنبيه: إذا اخترقت الإبرة الأنبوب عند توصيل الخط ، فقم بإزالة الإبرة ، وقطع الجزء المثقوب وكرر هذه الخطوة. أي تمزق في أنبوب PE10 سيسبب تسربا ويؤثر على نتائج التجربة.

5. إعداد جلسة التصوير

1. بناء على متتبع الفلورسنت الذي يتم حقه ، حدد الطول الموجي للإثارة ووقت التعرض لكل قناة. اختر أقصر وقت تعريض ضروري لتصور جهاز التتبع من أجل زيادة الدقة الزمنية للتصوير بفاصل زمني. سيتم استخدام وقت التعرض هذا لجميع التجارب اللاحقة التي تهدف إلى مقارنة نقل السائل الدماغي النخاعي بين المختلفة.
   ملاحظة: نصيحة واحدة هي استخدام أداة التتبع في خط CM لضبط وقت التعرض. على الرغم من أن هذا نهج أول مفيد ، إلا أنه يجب تحسينه بمرور الوقت.
2. اختر مدة التجربة والفترات الزمنية التي سيتم فيها الحصول على الصور. تستمر التجارب عادة ما بين 30-60 دقيقة اعتمادا على مرحلة النقل الغليمفاوي ذات الأهمية. معدلات الإطارات البالغة 1 إطار/دقيقة وأسرع كافية لمعظم التجارب.
3. قم بتعيين اسم الملف ودليل الحفظ.
4. إذا تم جمع التصوير بالإضافة إلى الاستحواذ المتزامن على متغيرات أخرى (على سبيل المثال ، مخطط كهربية القلب ، وضغط الدم الشرياني ، والفيزيولوجيا الكهربية) ، فيمكن برمجة المنظار الكبير والمضخة ليتم تشغيلهما باستخدام برنامج الحصول على البيانات. تحقق من صحة وظيفة التشغيل على المنظار قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.

6. تجربة التصوير البصري عبر الجمجمة

1. ابدأ ضخ التتبع والتصوير في نفس الوقت.
2. افحص بشكل روتيني قنية CM وأنبوب PE10 بحثا عن أي علامات على التسرب. إذا كان هناك أي متتبع يتسرب في CM ، فيجب استبعاد نتائج هذه التجربة.
   ملاحظة: إذا بدأ المتتبع في التراكم في المخيخ ولم ينتقل في المسار الليمفاوي للشرايين الدماغية الوسطى (MCA) ، فمن المحتمل أن قنية CM قد تم حقنها في المخيخ. لا ينبغي تضمين هذه البيانات.
3. بالنسبة للتجارب الحادة ، بعد الانتهاء من التجربة ، قم بإزالة الفأر من المجهر وتأكد من أنه لا يزال مخدرا بشكل كاف. قطع رأس الفأر بسرعة وحصاد أنسجة المخ. قم بالغمر - إصلاح الدماغ في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
   1. بالنسبة للتجارب المزمنة ، بمجرد اكتمال التصوير ، قم بإزالة خط CM من القنية ، واشطفها باستخدام aCSF المعقم وأعد إغلاق قنية CM بطرف كي بدرجة حرارة عالية. قم بإزالة الماوس من حامل الرأس وأعده إلى قفصه. كرر هذه العملية حتى لا تكون هناك حاجة إلى مزيد من التصوير ثم اتبع الخطوة 6.3.

النتائج

فئة الشكل = 'صورة image_resized image-style-align-center' style='display:table;margin-left:auto;margin-right:auto;width:75٪;'>

الشكل 1. التصوير العياني عبر الجمجمة. (أ) تخطيطي لإعداد التصوير العياني . (ب) منظر ظهري لموضع صفيحة الرأس على الجمجمة. العظم بين الجداريات وعظام الأنف والجبهة والجدارية كلها مرئية. (ج) جمجمة ف...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.25٪ Bupivacaine HCl جامعة روتشستر فيفاريوم100 ميكرولتر حقنة محكمة للغاز موديل 1710 TLL ، PTFE Luer LockHamilton Company81020 A-M Systems مسحوق أسمنت الأسنانفيشر NC9991371 العلمي كاربروفين جامعة روتشستر فيفاريومالكلورهيكسيدينبريفانتكسB10800 CMOS كاميراHammamatsuORCA Flash 4.0 Head Plateجامعة روتشسترلا يوجد كتالوج # مخصص في متجر الماكينات بجامعة روتشستر درجة حرارة عالية من CauteryBovie Medical CorporationAA01 مسرع مجموعة InstaBob Smith IndustriesBSI-151 Isoflurane - FlurisoVet One502017جامعة روتشستر فيفاريومالكيتامين مستشفى سترونج ميموريال صيدليةKrazy GlueElmer's Products، Incلا يوجد كتالوج # ، انظر الرابط في التعليقاتhttps://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DGالشريط الجراحي MicroporeFisher Scientific19-027-761 ParaformaldehydeSigma-aldrichP6148 PE10 - البولي إيثيلين .011 "× .024" لكل قدم ، 100 قدم مستمرBraintree ScientificPE10 100 قدم مضخة 11 النخبة التسريب فقط حقنة مزدوجةهارفارد جهاز70-4501 PURALUBE VET OINTMENTDechra Puritan PurSwab عصي تنظيف قطنية مائلةفيشر ساينتفيك22-029-553 مجهر الماكرو الكبيرالبحثي أوليمبوسMVX10 لوحة حامل رأس بسيطة (للفئران)Narishige الإبر ذات الاستخدام الواحد من شركة International USAInc MAG-1 ، وسادات إعداد الكحول المعقمة BD MedicalVWRBD305106 فيشر Scientific22-363-750 LED قابل للضبطPREVIOUS Lumen 1600-LED Xylazine University of Rochester Vivarium