مقالة منهجية

الحث البصري الوراثي للاكتئاب طويل الأمد لقمع سلوك البحث عن المخدرات في الفئران

أغسطس 7, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Rich، M. T.، et al. استخدام البصريات الوراثية لعكس المرونة العصبية وتثبيط البحث عن الكوكايين في الفئران. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو استخدام علم البصريات الوراثي للحث على الاكتئاب طويل الأمد (LTD) في النواة الركبية الإنسية إلى نقاط الاشتباك العصبي اللوزة الجانبية (MGN-LA) ، مما يضعف سلوك البحث عن المخدرات الناجم عن الإشارة في نموذج الفئران. يخضع الجرذ ، الذي تم زرعه جراحيا بالألياف الضوئية ويتم نقله فيروسيا للتعبير عن القنوات الأيونية الحساسة للضوء ، لتحفيز بصري وراثي بنبضات بصرية منخفضة التردد ، مما يؤدي إلى إطلاق الناقل العصبي وإضعاف متشابك. تقلل هذه العملية من انتقال MGN-LA المشبكي من خلال استيعاب مستقبلات الناقل العصبي ، مما يؤدي في النهاية إلى تعطيل الارتباط بين الإشارات وسلوك البحث عن المخدرات.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. القسطرة الوريدية للقوارض ، وتوصيل الفيروسات ، وزرع الألياف البصرية

  1. تحضير للجراحة.
    1. تخدير الفئران بالكامل بالتخدير المفضل بناء على المبادئ التوجيهية المؤسسية. أحد الخيارات هو هيدروكلوريد الكيتامين (87.5-100 مجم / كجم ، عضليا [i.m.]) وزيلازين هيدروكلوريد (5 مجم / كجم ، i.m.). تأكد من تخدير الجرذ بالكامل عن طريق التحقق من عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم.
      تنبيه: الكيتامين مادة خاضعة للرقابة يجب التعامل معها وفقا للإرشادات المؤسسية.
      ملاحظة: يتم استخدام الحقن العضلي للتخدير في هذه الدراسة لأنها تنتج تحريضا تخديرا أسرع وموثوقا به أكثر من الحقن داخل الصفاق. راقب باستمرار تنفس الفئران واستجابتها وقدم الدعم الحراري طوال الجراحة.
    2. احلق مساحة كبيرة من ظهر الجرذ (أعلى الظهر من فوق لوحي الكتف مباشرة إلى منتصف الظهر) وكذلك منطقة الرقبة أسفل الطرف الأمامي الأيمن وفروة الرأس.
    3. ضع الجرذ في منطقة الجراحة وقم بتطبيق البورالوب (الدموع الاصطناعية) على العينين. حقن حجم وزن الجسم من كاربروفين (مسكن) تحت الجلد (تحت الجلد [s.c.]) من خلال جلد الجزء العلوي من الظهر ، ثم حقن 5 مل من محلول Lactated Ringer s.c. من خلال جلد أسفل الظهر.
    4. قم بتعقيم جميع المواقع الجراحية عن طريق ترطيب قطعة من الشاش المعقم بالبيتادين ومسحها في المنطقة الجراحية المحلوقة بحركة دائرية. ثم كرر العملية مع 70٪ من الإيثانول. كرر هذه الدورة المتناوبة ثلاث مرات.
  2. قم بإجراء زراعة القسطرة الوريدية وفقا للبروتوكولات المنشورة مسبقا.
    ملاحظة: لا يتم استخدام الستارة الجراحية أثناء هذه الجراحة لتجنب التهيج أثناء زرع القسطرة. تعقيم جميع الأدوات والمعدات قبل الاستخدام. استخدم قفازات معقمة وقم بتغيير القفازات في حالة ملامسة أي سطح غير معقم.
  3. مباشرة بعد زرع القسطرة ، قم بتأمين الجرذ في إطار تجسيمي لإجراء حقن الفيروس المرتبط بالغدة (AAV).
    1. توصيل حقنة تحت الجلد (s.c.) من 2٪ ليدوكائين (0.2-0.3 مل) إلى فروة الرأس كمخدر موضعي.
      ملاحظة: لا يتم استخدام التخدير الموضعي أثناء زرع القسطرة الوريدية لتجنب التغيرات في النتائج الجراحية.
    2. قم بتوصيل قنية حقن الفولاذ المقاوم للصدأ عيار 26 بحقنة هاميلتون مملوءة ب 1 ميكرولتر من محلول AAV المركز: إما AAV5-hSyn-tdTomato أو AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
      ملاحظة: oChIEF هو نوع مختلف من قناة opsin الحساسة للضوء الأزرق rhodopsin (ChR2) ، والتي يمكن أن تستجيب لمجموعة واسعة من الترددات ، وبالتالي فهي مفيدة لتجارب الاكتئاب طويل المدى منخفضة التردد (LTD) التي تمت مناقشتها في هذا البروتوكول ، ولكن أيضا لتجارب التقوية طويلة الأجل عالية التردد (LTP). تم التبرع بهيكل oChIEF من قبل الدكتور روجر تسين ومعالجته للتغليف والتنقية بواسطة Duke Viral Vector Core. هناك حاجة إلى 3-4 أسابيع على الأقل بين يوم الحقن ويوم تحريض LTD للسماح بالتعبير الأمثل عن الفيروس في النواة الركبية الإنسية لأطراف محور المهاد (MGN).
      تنبيه: بشكل عام ، يعتبر AAV كائنا من مستوى السلامة البيولوجية 1 (BSL-1) ، مع انخفاض خطر الإصابة بالعدوى الذاتية ما لم يتم استخدام فيروس مساعد في إنتاجه. يتطلب استخدامه موافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) ، ويجب استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) في جميع الأوقات وفقا للإرشادات المؤسسية للحد من التعرض غير الضروري.
    3. باستخدام مشرط ، قم بعمل شق 0.5 مم من الأمام إلى مؤخرة الجمجمة ، وقم بإزالة الأنسجة العلوية لكشف سطح الجمجمة.
    4. قم بتسوية رأس الجرذ في المحور الأمامي / الخلفي وصفر إحداثيات تجسيمية إلى بريجما.
    5. قم بحفر ثلاثة ثقوب صغيرة من خلال الجمجمة باستخدام أداة Dremel المجهزة بمثقاب صغير. استخدم مفك البراغي لتثبيت مسامير الفولاذ المقاوم للصدأ بإحكام (M2x4 965-A2) في مكانها.
      ملاحظة: البراغي ضرورية للربط السليم لأسمنت الأسنان وإنشاء أغطية رأس متينة وطويلة الأمد. يجب أن ينتشر موضع البراغي عبر المحور الأمامي الخلفي للجمجمة ، وبعيدا عن موقع حقن AAV.
    6. حفر ثقوب ثنائية لحقن AAV بناء على الإحداثيات من أطلس دماغ الفئران (Watson و Paxinos) للجزء الإنسي من النواة الركبية الإنسية (MGN) ؛ في مم من bregma ، الأمامي الخلفي (AP): -5.4 ؛ الوسطي الجانبي (ML): ±3.0 ؛ الظهري البطني (DV): -6.6. قم بخفض قنيات الحقن ببطء (4 مم / دقيقة) حتى يتم وضعها في MGN. حقن محلول AAV المركز بمعدل 0.1 ميكرولتر / دقيقة.
    7. اترك قنية الحقن في مكانها لمدة 5 دقائق بعد اكتمال الحقن للسماح بالانتشار بعيدا عن القنية ثم اسحب القنية ببطء من الدماغ.
  4. مباشرة بعد حقن الفيروس ، استمر في زرع الألياف الضوئية التي تستهدف أطراف MGN-LA.
    1. استخدم أداة Dremel لحفر ثقوب ثنائية لغرسات الألياف البصرية التي تستهدف اللوزة الجانبية (بالملم من bregma ، AP: -3.0; ML ±5.1).
    2. استخدم الملقط للاستيلاء على حلقة غرسة الألياف الضوئية وتثبيتها على المحولات التجسيمية بحيث يتم تثبيتها بإحكام في مكانها.
    3. اخفض الألياف ببطء بمعدل 2 مم / دقيقة ، حتى يستقر طرف الألياف في الجزء الظهري من LA (الظهري البطني [DV]: -7.9 مم).
    4. قم بتثبيت الحلقات على الجمجمة أولا باستخدام طبقة رقيقة من مادة لاصقة فورية من Loctite ، متبوعة بأسمنت الأسنان ، وقم بتغطية الحلقات بأكمام الطويق بقطر 1.25 مم وأغطية الغبار.
      ملاحظة: يجب الموافقة على اختيار المادة اللاصقة لتثبيت الحلقات في الجمجمة من قبل لجنة رعاية واستخدامها المحلية أو المؤسسية. يستخدم Loctite في هذه الدراسة لتأمين الحلقات بشكل موثوق بالجمجمة بعد التجربة والخطأ باستخدام مواد لاصقة متعددة. ومع ذلك ، يمكن النظر في البدائل المتاحة.
  5. بعد العمليات الجراحية ، قم بإيواء الفئران بشكل فردي وتوفير الوصول المجاني إلى الطعام والماء. توفير رعاية ما بعد الجراحة بما يتفق مع الإرشادات المؤسسية. يجب غسل القسطرة يوميا بمحلول ملحي يحتوي على جنتاميسين (5 ملغ/مل) والهيبارين (30 USP/مل) للحفاظ على سالكية. بعد 5 أيام على الأقل من الجراحة و 24 ساعة قبل بدء التجارب السلوكية ، يقيد الطعام الفئران إلى ~ 90٪ من وزنها الحر.

2. الإدارة الذاتية لكوكايين القوارض وانقراض الرافعة الآلية

ملاحظة: يتم إجراء جميع الإجراءات السلوكية في غرف تكييف عاملة قياسية ، ومجهزة برافعتين قابلتين للسحب على جدار واحد ، وضوء تحفيز فوق كل رافعة ، ومولد نغمة ، وضوء منزلي ، ومضخة تسريب.

    تخضع
  1. الفئران لجلسات تدريبية يومية للإدارة الذاتية لمدة 1 ساعة من الكوكايين (2 ملغ/مل) وفقا لجدول التعزيز ذو النسبة الثابتة 1 (FR1).
    1. ضع الفئران في غرفة فعالة كل يوم واسمح للفئران بالضغط. يؤدي الضغط على "الرافعة النشطة" المعينة (المتوازنة عبر الرافعات اليمنى واليسرى) إلى تسريب الكوكايين (1.0 مجم / كجم / تسريب) وعرض تقديمي لمدة 10 ثوان لإشارة مركب للضوء والنغمة. الضغط على "الرافعة غير النشطة" المعينة ليس له تأثيرات مبرمجة.
    2. استمر في تجارب الإدارة الذاتية لمدة 10 أيام على الأقل وحتى تكسب الفئران بنجاح ما لا يقل عن 8 دفعات / يوم على مدار 3 أيام متتالية. يؤدي الفشل في الوصول إلى معايير الاستحواذ بحلول اليوم 20 إلى الاستبعاد من الدراسة.
  2. بعد استيفاء معايير الاستحواذ بنجاح ، تخضع الفئران لجلسات انقراض آلية لمدة 1 ساعة لمدة 6-10 d.
    1. ضع الفئران في غرف فعالة واسمح للفئران بالضغط بحرية. ومع ذلك ، فإن الاستجابات على كل من الروافع النشطة وغير النشطة ليس لها عواقب مبرمجة.
    2. اجعل الفئران تستمر في الانقراض الآلي يوميا حتى يحدث ما معدله < 25 ضغطة رافعة على مدار يومين متتاليين.

3. في الجسم الحي الحث البصري الوراثي المحدودة

ملاحظة: تجري تجارب تثبيط البصريات الوراثية بعد 24 ساعة من اليوم الأخير من الانقراض الآلي.

  1. قم بتوصيل أسلاك التصحيح بصمام ثنائي ليزر أزرق 473 نانومتر عبر مفصل دوار معلق فوق قفص مبيت قياسي نظيف للقوارض مع إزالة الغطاء. يسمح هذا الإعداد للقوارض بالتحرك بحرية حول القفص أثناء التحفيز البصري الوراثي.
  2. قم بتشغيل الصمام الثنائي بالليزر وفقا لتعليمات التشغيل وقم بتوصيله بمولد النبض. اضبط الإعدادات بحيث يتلقى الجرذ عند تشغيله 900 نبضة ضوئية تبلغ 2 مللي ثانية عند 1 هرتز.
    تنبيه: يجب استخدام الحماية المناسبة للعين في جميع الأوقات أثناء تشغيل الليزر.
  3. قم بقياس شدة الضوء من خلال سلك التصحيح باستخدام مستشعر الضوء. اضبط شدة الليزر بحيث يكون ناتج الضوء عبر كابل التصحيح ~ 5-7 ميجاوات.
  4. ضع الفئران في قفص سكني نظيف. قم بإزالة أغطية الغبار وأكمام الطويق ، مما يؤدي إلى تعريض الحلقات قم بتوصيل أسلاك التصحيح بشكل ثنائي بغرسات الألياف البصرية. اسمح للفئران باستكشاف البيئة لمدة 3 دقائق قبل الحث المحدود.
  5. قم بتشغيل مولد النبض لبدء التحفيز البصري الوراثي.
    ملاحظة: على الرغم من أنه من غير المحتمل ، إذا واجهت الفئران أي ردود فعل سلبية على التحفيز ، يتم إنهاء التجربة على الفور ، ويتم قتل الفئران بشكل صحيح بناء على المبادئ التوجيهية المؤسسية.
  6. بعد الحث المحدود ، احتفظ بالفئران في القفص لمدة 3 دقائق ، ثم ضعها مرة أخرى في أقفاص منزلها.
  7. لتجارب المكافحة ، استخدم نفس إجراء التحفيز على الفئران التي تعبر عن فيروس التحكم AAV5-tdTomato . بالنسبة للتجارب الوهمية ، قم بتوصيل سلك التصحيح بالألياف البصرية للفئران التي تعبر عن فيروس AAV5-oChIEF ، ولكن لا يتم تقديم أي تحفيز خلال جلسة مدتها 15 دقيقة.

4. اختبر تأثير التحفيز البصري الوراثي على البحث عن الكوكايين الناجم عن جديلة

< ol style = 'list-style-type: decimal ؛ >
  • 24 ساعة بعد التحفيز البصري الوراثي في الجسم الحي ، ضع الفئران مرة أخرى في غرف التكييف الفعالة. تخضع الفئران لجلسة إعادة قياسية مدتها 1 ساعة مستحثة عن جديلة لتقييم سلوك البحث عن الكوكايين.
    ملاحظة: أثناء الاستعادة المستحثة عن الإشارة ، تؤدي الاستجابة على الرافعة النشطة إلى عرض تقديمي لمدة 10 ثوان للإشارة المرتبطة بالكوكايين ، ولكن لا توجد حقن للكوكايين.
  • قم بإجراء اختبار إعادة ثان بعد أسبوع واحد على الأقل من الاختبار الأول لتحديد ما إذا كان تحريض البصريات الوراثية المحدودة يؤدي إلى قمع طويل الأمد لطلب الكوكايين

    • الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    <فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.9٪ SalineFisher ScientificNC0291799 A.M.P.I. عازل التحفيزIso-Flex AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomatoDuke Viral Vector Core (عبر Roger Tsien) # 268 AAV5.hSyn.tdطماطم (مراقبة)ديوك الفيروسي ناقل التحكم الأساسي الدموع الاصطناعية (مرهم البصريات)Covetrus70349 BetadineButler Schein38250 Cocaine HClNIDA Drug Supply Center9041-001 جهاز التحكم في درجة الحرارة ثنائي القناةWarner InstrumentsTC-344C الإيثانولجامعة بيتسبرغ كيمياء Stockroom200C5000 أغطية غبار الطويقThor LabsCAPLأغطية غبار بلاستيكية بيضاء ل 1.25 مم الحلقاتالطويق التزاوج الأكمامعدسات دوريكF210-3011Sleeve_BR_1.25 ، برونز ، 1.25 مم معرفالحلقاتمنتجات الألياف الدقيقةMM-FER2007C-2300Ø1.25 مم Multimode LC / PC الطويق السيراميك ، Ø230 ميكرومتر حجم ثقبالألياف البصريةThorLabs FP200URT200 ميكرومتر ألياف أساسية متعددة الأوضاع (0.5 NA) الألياف البصرية الدوارة المشتركةPrizmatix (مطلوبة من أمازون) قطر 18 مم ، موصل FC-FCلأداة تجريد الأليافThor LabsT12S21 GentamicinHenry Schein6913 حقنة هاميلتونهاميلتون80085حجم 10 ميكرولتر ، مقياس 26 ، 2 بوصة ، نمط نقطة 3مسدس حراريمتحالف للإلكترونيات972-6966250 فولت ، 750-800 درجة فهرنهايتمنتجات أليافالايبوكسي الدقيقة القابلة للشفاء بالحرارةPFP-353ND-8OZ الهيبارينهنري شاين55737 حمض الهيدروكلوريكفيشر العلمي219405490 الكيتامين هيدروكلوريكهنري شاين55853الكيتامين مادة خاضعة للرقابة ويجب التعامل معها وفقا للإرشاداتالمؤسسية Lactated Ringer'sHenry Schein9846 Laser ، سائق ، ومقرنة ليزر إلى أليافOEM أنظمة ليزرBL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0100 ميجاوات ، 473 نانومتر ، ليزر الحالة الصلبة بضخ الصمام الثنائي (خيار واحد)ليدوكائينبتلر شين14583 مستشعر الضوء ThorLabsPM100Dوحدة تحكم مقياس الطاقة المدمجة مع شاشة رقميةلاصق فوري LoctiteGrainger5.00E + 207 مضخم كهربائي دقيق / أجهزة جزيئية للحصول على البياناتMULTICLAMP700B / مضخة حاقن دقيق Digidata 1440A هارفارد جهاز70-4501حقنةمزدوجة Micromanipulatorأدوات SutterMPC-200 / ROE-200 أسمنت أسنان أورثوجيت ، سائللانغ دانتال1504BLKأسمنت أسنان أسودأورثوجيت ، مسحوقلانج أدانتل1530BLKمسحوق معاصر ، كابلات تصحيح سوداءThor LabsFP200ERTMultimode ، FT030 أنابيبRimadyl (Carprofen)Henry Schein24751 غرف الإدارة الذاتية / البرمجياتMed AssociatesMED-NP5L-D1 مسامير آلة الفولاذ المقاوم للصدأ WW Grainger6GB25M2-0.40mm آلة برغي ، مقلاة ، فيليبس ، A2 الفولاذ المقاوم للصدأ ، عادي ، 3 مم طولمحول تجسيمي للحلقاتThor LabsXCL الإطار التجسيميStoelting51603 خياطة خيوطأدوات العلوم الدقيقة18020-50خيط حريري ؛ الحجم: 5/0 ، القطر: 0.12 ممVetbond لاصق الأنسجةCovetrus1505

    إعادة الطباعة والأذونات

    طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

    طلب إذن

    الوسوم

    مقالات ذات صلة