تصوير الأنسجة العميقة لدماغ سمكة الزرد باستخدام مجهر مضان ثلاثي الفوتون

الملخص

المصدر: Hontani، Y.، et al. الفحص المجهري الفلوري ثلاثي الفوتونات للأنسجة العميقة في دماغ الفأر والزرد السليم. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو إعداد وتنفيذ التصوير ثلاثي الفوتون في دماغ الزرد المخدر. يتيح البروتوكول تصور الأنسجة العميقة للخلايا العصبية المصنفة بالفلورسنت ، مما يكشف عن نشاط الخلايا العصبية في الوقت الفعلي والهياكل لتطبيقات أبحاث علم الأعصاب.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. التصوير داخل الحيوية في دماغ الزرد
   ملاحظة: لتحديد موقع دماغ السمكة بشكل صحيح تحت العدسة الشيئية ، يتم استخدام كاميرا الجهاز الثانوي المقترن بالشحن (CCD) على نفس مسار ضوء الإثارة للتصوير واسع المجال.
   
   1. قم بإعداد المجهر ومعايرة الطاقة.
   2. ضع هدفا منخفضا للتكبير (عادة 4x) على المجهر.
   3. ضع طبق بتري الذي يحتوي على السمك والأنابيب تحت المجهر.
   4. استخدم مصدر ضوء الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) لإضاءة طبق بتري.
   5. افتح وضع الكاميرا لبرنامج الحصول على الصور (الشكل 1).
   6. انقر على مباشر.
   7. اختر القناة A على الجانب الأيمن من الشاشة.
   8. اضبط إعدادات الرسم البياني لرؤية الصورة بوضوح.
      NOTE: يجب تحديثها حسب الحاجة.
   9. اضبط إعداد المحرك على وحدة التحكم في المحرك على القاعدة.
   10. اخفض الهدف حتى تصبح السمكة مرئية.
       ملاحظة: تأكد من أن العدسة الموضوعية لا تقوم بأي اتصال جسدي بالرأس.
   11. ضع مركز رأس السمكة في وسط مجال الرؤية.
   12. حرك الهدف لأعلى وبعيدا عن رأس السمكة.
   13. استبدل العدسة الموضوعية ذات التكبير المنخفض بالعدسة الموضوعية ذات الفتحة العددية العالية (NA) ل 3PM (الفحص المجهري ثلاثي الفوتونات).
       ملاحظة: لا يلزم أن تكون عدسة التكبير المنخفض والعدسة الموضوعية عالية NA متوازية البؤر ولكن يجب أن تكون قريبة بما يكفي لضمان أن تكون الأسماك ضمن مجال رؤية العدسة الموضوعية عالية NA.
   14. اخفض العدسة الموضوعية ببطء ، مع التأكد من أن الهدف لا يقوم بأي اتصال جسدي بالرأس. في برنامج كاميرا CCD ، توقف عن تحريك الهدف عندما يكون الجزء العلوي من الرأس مرئيا. اضبط الموقع z على 0 ميكرومتر
       ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات هواء تحت العدسة الموضوعية عند استخدام هدف الغمر في الماء.
   15. قم بإيقاف تشغيل مصدر ضوء LED وأغلق الستارة المظلمة حول النظام.
   16. اضبط برنامج الحصول على التصوير على وضع Multiphoton GG للتصوير 3P واضبط الطاقة الموجودة أسفل العدسة الموضوعية على أقل من 1 ميجاوات (مع معدل تكرار النبض ~ 1 ميجاهرتز).
   17. قم بتغيير زر إعداد المحرك من Base إلى Objective على وحدة التحكم في المحرك.
   18. أطفئ الأنوار في الغرفة.
   19. قم بتشغيل أنابيب المضاعف الضوئي (PMTs) وافتح غالق مصدر الإثارة 3PM. تأكد من ظهور مخطط تفصيلي للعظم في قناة إشارة التألق بسبب التألق الذاتي وفي قناة إشارة الجيل التوافقي الثالث (THG) بسبب THG للعظم (الشكل 1C).
   20. قم بإجراء التصوير على أعماق مختلفة عن طريق زيادة مستويات الطاقة عند التصوير بشكل أعمق.

النتائج

فئة الشكل = 'صورة image-style-align-center image_resized' style='display: table؛ margin-left: auto؛ margin-right: auto ؛ width: 75٪ ؛ '>

الشكل 1: لقطات شاشة تمثيلية للتصوير داخل الحيوية في الأسماك (قسم البروتوكول 1). (أ) عرض وضع الكاميرا لبرنامج الحصول على الصور مع عدسة موضوعية 4x في مكانها. يتم تحديد الميزات الرئيسية للبرنامج وترقيمها على النحو التا...

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 5٪ Povidone-iodineAmazonNDC 67818-155-32التنظيف المبكر للمناطق الجراحية70٪ الإيثانولالحراري فيشر العلميCAS 64-17-5التنظيف الاستقبالي للمناطق الجراحيةAgaroseSigmaA4718-256تحضير غرفة أسماك الزردبيرغامو IIمجهر التصوير متعدد الفوتون Thorlabs بوبيفاكائينكورنيل الرعاية البيطرية GaAsP تضخيم PMTThorlabsPMT2100سخان كاشف PMT (800 واط) سخان حوض السمك Finnex لمياه الزرد) Kimwipesمناديل مختبرية Kimtech لتحضير حقنة الزردNanofil (10 ميكرومتر) بإبرة 36 جمWPINANOFIL + NF36BVحقنة وإبرة لحقن بروميد البانكورونيوممضخة التمعجElemental ScienceESI MP2لإعداد أسماك الزردأنابيب البولي إيثيلين (معرف 0.58 مم ، OD 0.965 مم)Elemental ScienceMP2 مضخةالأنابيب التي تذهب في فم الزردSR400ستانفورد أنظمة الأبحاثSR400عداد الفوتونالقياسي الصمام الثنائي الضوئي مستشعر الطاقةThorlabsS122Cكاشف الطاقةشمع الملاكمة الشريطي الرقيقCorning Rubber Co.، Inc. تثبيت الأنابيب في مكانها في غرفة أسماك الزردThorImageThorlabs برنامج الحصول على الصورTricaine (ملح ميثان سلفونات Ethyl-m-aminobenzoate) MP103106تخدير أسماك الزرد والقتل الرحيمأنابيب Tygon (معرف 1/16 بوصة ، OD 1/8 بوصة)Tygon Tubing لتدفق المياه لإعداد أسماك الزردVaporGuardVetEquip931401 لإعادة تدوير لاصق الأنسجة الأيزوفلورانVetbond3M1469SBللصق النافذة الزجاجية على جمجمة الفأر ، ولصق أنسجة المختبر عند تحضير الأسماك.XLPLN25XWMP2أوليمبوس Multiphoton الإثارة الهدف المخصص