تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.
1. وضع العلامات على الخلايا السرطانية عبر بروتين الفلورسنت الأخضر الذي يعبر عن الفيروسات القهقرية
ملاحظة: يتطلب الفحص المجهري بفاصل زمني لتحليل هجرة الخلايا السرطانية وضع علامات فلورية مستقرة وطويلة الأمد للخلايا داخل ثقافة الشرائح. يقترح استخدام الفيروس القهقري لأنه يصيب الخلايا المنقسمة بشكل انتقائي ، وبالتالي إثراء الملصقات الفلورية داخل مجموعة الخلايا السرطانية بدلا من الخلايا الدبقية الصغيرة أو أنواع الخلايا الأخرى الموجودة داخل الشريحة. يشير توحيد العدوى إلى أن العيار الفيروسي البالغ 104 CFUs / ميكرولتر ينتج عنه تعبير كاف عن البروتين الفلوري الأخضر لتتبع وتحليل هجرة الخلايا. قد يؤدي ارتفاع العيار الفيروسي أو استخدام الفيروس غير الانتقائي (مثل الفيروس الغدي أو فيروس العدس) أو أي وسيلة أخرى لوضع العلامات على جميع الخلايا إلى منع تحديد حدود الخلايا الواضحة أثناء الهجرة ، مما يعقد التحليل. يمكن استخدام علامات الفلورسنت البديلة وتحسينها حسب الحاجة.
- الحصول على الفيروس القهقري لعدوى شرائح الورم إما عبر البروتوكولات القياسية 5،14 أو من مصدر متاح تجاريا. قم بتخفيف المادة الطافية الفيروسية عن طريق إضافة الحجم المناسب إلى وسط عصبي غير مكمل للوصول إلى عيار فيروسي يبلغ 104 CFUs (وحدات تشكيل المستعمرة) / ميكرولتر.
- بين 7 - 10 أيام من الثقافة تصيب مزارع شرائح الورم ذات الأهمية مع 5 - 10 ميكرولتر من الفيروس (104 CFUs / μL). ضع الفيروس برفق على سطح كل شريحة من الأنسجة. تقليل حجم المادة الطافية المضافة إذا كانت الشريحة تطفو على سطح الملحق. أعد الألواح التي تحتوي على مزارع شرائح إلى حاضنة.
- قم بتقييم شرائح الخلايا السرطانية المصنفة بدءا من 24 ساعة بعد الإصابة الفيروسية. سيختلف هذا التأخير الزمني اعتمادا على الاندماج الفيروسي وحركية التعبير الجيني الفلوري. بالنسبة للتركيبات الفيروسية المستخدمة هنا ، كانت هناك حاجة إلى 72 ساعة لمراقبة إشارة فلورية قوية باستخدام مجهر فائفلوري قياسي.
ملاحظة: نادرا ما تعرض الشرائح توزيعا محيطيا في الغالب للخلايا ذات العلامات الفيروسية ، مما قد يعقد التصوير متحد البؤر. لتجنب هذه المضاعفات ، حاول تقليل سمك الشريحة وتباين السماكة عبر الشريحة. إذا كانت ثقافة الشرائح تحتوي على منطقة أكثر سمكا بالقرب من المركز ، فقد يمنع ذلك تغلغل العناصر الغذائية بشكل كاف ، وبالتالي يحد من عدد الخلايا السرطانية المنقسمة بنشاط. الاختبار النوعي لفحص هذه المضاعفات هو إضافة كاشف صبغة التيترازوليوم (أي MTT (3- (4،5-dimethylthiazol-2-yl) -2،5-diphenyltetrazolium bromide)) إلى وسائط زراعة الشرائح. تشير مناطق الشريحة التي لا تتحول إلى اللون الأزرق بعد إضافة الكاشف إلى نقص نشاط التمثيل الغذائي وصحة الشريحة المعرضة للخطر.
2. التصوير متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر أحادي الفوتون بفاصل زمني لهجرة الخلايا السرطانية
ملاحظة: بعد تأكيد النقل الناجح وصحة الثقافة ، يمكن تصوير الخلايا في ظل ظروف التحكم ، تليها فترة متساوية من التصوير في ظل ظروف العلاج. باستخدام هذا البروتوكول ، تم تصوير الخلايا وتتبعها بنجاح لمدة 12 ساعة في كل حالة. ومع ذلك ، قد تكون فترات التصوير والتلاعب البيئي الأقصر أو الأطول مفيدة أيضا.
- تحميل المجهر
- قبل التصوير ، ضع 1 مل من وسائط الشرائح الطازجة في طبق ذو قاع زجاجي.
- اسمح للوسائط الموجودة في الطبق ذو القاع الزجاجي بالتوازن في حاضنة لمدة 15 دقيقة < br / >ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن إضافة عوامل الملصقات القابلة للذوبان ، مثل الليكتين المترافق بالفلورسنت (أي Isolectin IB4 لوضع العلامات على الخلايا الدبقية الصغيرة) أو النقاط الكمومية المترافقة بالترابط ، إلى وسائط زراعة الشرائح لتحديد المجموعات السكانية الفرعية الخلوية أثناء التصوير.
- انقل الملحق المراد تصويره إلى طبق ذو قاع زجاجي باستخدام ملقط معقم في غطاء التدفق الرقائقي. انقل الطبق إلى مرحلة المجهر.
- حافظ على مزارع الشرائح عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربونفي حاضنة مجهر محكمة الغلق. استخدم الترطيب المعقم H2O لغرفة الحضانة إذا كان متاحا لمنع التبخر المفرط للوسائط (مهم بشكل خاص لتجارب التصوير الأطول).
- استخدم مجهر متحد البؤر بمسافة عمل طويلة 10X هدف هوائي وإثارة ليزر للفوتون الفردي و / أو الفوتون المتعدد. ملاحظه: تأكد من أن العدسة الموضوعية المجهرية توفر مسافة عمل كافية. نتيجة للارتفاع الإضافي من الحاضنة العلوية ، وطبق القاع الزجاجي ، وإدراج زراعة الأنسجة ، فإن أهداف مسافة العمل الطويلة أمر بالغ الأهمية.
- قم بتأمين اللوحة السفلية الزجاجية ، وقم بإزالة غطاء طبق بتري البلاستيكي ، وقم بتغطيتها بغشاء منفذ للغاز.
- الحصول على الصورة
- استخدم المجهر لفحص الشريحة بصريا، وتحديد موقع حقل مناسب بكثافة كافية من الخلايا السرطانية المصنفة بالفلورسنت بين حافة الشريحة والمركز. تجنب حقول التصوير على حافة الشريحة ، بسبب زيادة قابلية تحولات الأنسجة أثناء التصوير. يمكن استخدام قيثارات شرائح الأنسجة للحد من هذا التحول.
- استخدم برنامج التصوير في وضع التحليل متعدد الأبعاد لتعيين حدود المكدس Z الأولى (السفلية) والأخيرة (العلوي) ، بحيث تحتوي جميع المواضع المراد تصويرها على إشارة خلوية فلورية مرئية. يوفر التصوير من خلال 150 - 200 ميكرومتر من الشريحة ، مع خطوة Z ثابتة تبلغ 10 ميكرومتر ، دقة كافية لتتبع مسارات الخلايا (يمكن تعديل ذلك لاحتياجات التصوير الفردية).
- إذا كان المجهر يحتوي على مرحلة آلية ، فتأكد من السماح بالوقت الكافي لكل عملية استحواذ على Z-stack. اضبط الفاصل الزمني بين عمليات الاستحواذ على وقت المسح المتساوي لكل موضع × عدد المواضع للصورة (أي مناطق الورم المصورة).
ملاحظة: للإثارة المتزامنة للفلوروفورات الخضراء والحمراء ، استخدم برنامج مسح الخط بالليزر ثنائي الخط ، مع إثارة متزامنة 488 نانومتر و 633 نانومتر. سيختلف الطول الموجي لإثارة الليزر المختارة وفقا لبروتينات الفلورسنت الفردية المعبر عنها. - حافظ على طاقة ليزر موحدة وإعدادات ثقب متحد البؤر بين مناطق الورم المصورة. استخدم أقل إعداد لطاقة الليزر اللازمة لترسيم أجسام الخلايا السرطانية وعملياتها بوضوح للحد من السمية الضوئية. ستختلف وحدات معلمات التصوير المحددة (أي إعدادات الطاقة والثقب متحد البؤر) وفقا لمواصفات المجهر ومصدر الليزر.
- عوض عن التبخر المحتمل للوسائط عن طريق إضافة 2-3 خطوات Z-stack "عازلة" في المستويات البؤرية التي تتقدم نحو الهدف. هذا يمنع الأنسجة بشكل فعال من مغادرة نطاق عمليات الاستحواذ Z-stack في المستوى الرأسي.