تصوير هجرة الخلايا السرطانية في أنسجة الورم الأرومي الدبقي باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر بالمسح الضوئي بفاصل زمني

الملخص

المصدر: Parker، J. J.، et al. نموذج لثقافة الشرائح العضوية للورم الأرومي الدبقي البشري لدراسة هجرة الخلايا السرطانية والتأثيرات الخاصة بالمريض للأدوية المضادة للتوغل. J. Vis. Exp. (2017)

يعرض هذا الفيديو تصوير شرائح أنسجة الورم الأرومي الدبقي التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) عبر الفحص المجهري متحد البؤر. يتم التقاط صور عالية الدقة على فترات متسقة لتتبع حركة الخلايا السرطانية واتجاهها.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

1. وضع العلامات على الخلايا السرطانية عبر بروتين الفلورسنت الأخضر الذي يعبر عن الفيروسات القهقرية

ملاحظة: يتطلب الفحص المجهري بفاصل زمني لتحليل هجرة الخلايا السرطانية وضع علامات فلورية مستقرة وطويلة الأمد للخلايا داخل ثقافة الشرائح. يقترح استخدام الفيروس القهقري لأنه يصيب الخلايا المنقسمة بشكل انتقائي ، وبالتالي إثراء الملصقات الفلورية داخل مجموعة الخلايا السرطانية بدلا من الخلايا الدبقية الصغيرة أو أنواع الخلايا الأخرى الموجودة داخل الشريحة. يشير توحيد العدوى إلى أن العيار الفيروسي البالغ 10⁴ CFUs / ميكرولتر....

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DMEM High GlucoseInvitrogen (Gibco) 11960-044 Neurobasal-A متوسط ، ناقص الفينول الأحمرInvitrogen (Gibco) 12349-015 B-27 Supplement (50X) ، Invitrogen خال من المصل(Gibco)17504-044 البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)إنفيتروجين (جيبكو)15140-122 مكمل جلوتاماكسإنفيتروجين (جيبكو)35050-061 ل-جلوتامين (200 ملم)إنفيتروغين (جيبكو)25030-081 هيبس (1 م)إنفيتروجين (جيبكو)15630-080 نيستاتين تعليقSigma-AldrichN1638-20ML10,000 وحدة / مل في DPBS ، معالج معقم ، كاشف حيوي ، مناسب لزراعة الخلايانقطة انصهار منخفضة فائقة النقاء AgaroseInvitrogen (Gibco) 16520-050يذوب عند 65.5 درجة مئوية ، ويظل سائلا عند 37 درجة مئوية ، ويثبت بسرعة أقل من 25 درجة مئوية.Isolectin GS-IB4 من Griffonia simplicifolia ، Alexa Fluor 647 ConjugateThermo Fisher (المجسات الجزيئية) I32450تستخدم في الوسائط لتسمية الخلايا الدبقية الصغيرة / البلاعمpRetroX-IRES-ZsGreen1 VectorClonetech632520 Retro-X ConcentratorClonetech31455راتنج ملزم لتركيز الطرد المركزي غير الفائق للطاقات الفيروسيةpVSG-G VectorClonetech631530جزء من نظام التعبير الفيروسي القهقري العالمي Retro-XGP2-293 خلايا التعبئة والتغليف الفيروسيةClonetech631530جزء من نظام التعبير الفيروسي القهقري العالمي Retro-Xغراء سيانواكريليت (غراء فائق)Sigma-AldrichZ105899 قالب تضمين التقشير متوسط اللزوجة (مربع - S22) Polysciences، Inc.18646A-1قوالب لتضمين عينة الورمملاعق صغيرة من الفولاذ المقاوم للصدأ Fisher ScientificS50823أداة الانحناء 45 درجة عند عنق شفرة الملعقةمنحنية Fisherbrand تشريح ملقط مدبب دقيقفيشر Scientific08-875 شفرة حلاقة أحادية الحافة (شفرات حلاقة السلامة الأمريكية)فيشر ساينتفيك17-989-001حافة الشفرة بسمك 0.009 بوصة. تتم إزالة الغطاء ذو الحواف الحادة المجعد قبل التحميل على الاهتزاز.Leica VT1000 S VibratomeLeica BiosystemsVT1000 S ماء PTFE إدراج ثقافة الخلاياEMD MilliporePICM0RG5030 مم ، PTFE محب للماء ، 0.4 ميكرومتر حجم المسام35 مم أطباق القاع الزجاجيMatTekP35G-1.5-20-C كم قطر زجاجي 20 مم. سمك زجاج الغطاء 1.5LSM 510 المنظار متحد البؤرZeissLSM 51010x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) PECON Stagetop IncubatorPeCON Germany (متوقف) حاضنة PM 2000 RBT هو منتج قابل للفهم مصمم للاستخدام مع مجاهر زايس.