تصوير الكالسيوم التلقائي للديناميكيات الخاصة بالمقصورة في الخلايا النجمية

الملخص

المصدر: Bannai، H.، et. al.، تشريح إشارات Ca2+ المحلية في الخلايا المستزرعة بواسطة مؤشرات Ca2+ المستهدفة بالغشاء. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح الفيديو التصوير الفلوري لمراقبة ديناميكيات الكالسيوم العفوية الخاصة بالمقصورة في الخلايا النجمية من خلال المراقبة المتتابعة للبروتينات الحساسة للكالسيوم الموضعية على غشاء البلازما والشبكة الإندوبلازمية.

البروتوكول

1. تصوير Ca²⁺

1. تسجيل الأنشطة التلقائية للخلايا النجمية التي تعبر عن Lck-RCaMP2 و OER-GCaMP6f /
   ملاحظة: بدون بصريات تقسيم الصور ، يمكن مراقبة إشارات Ca²⁺ في غشاء البلازما وتلك المحيطة بالشبكة الإندوبلازمية (ER) في نفس الخلية. هنا ، يتم وصف التسجيل المتسلسل ل Lck-RCaMP2 (مؤشر Ca²⁺ المشفر وراثيا المستهدف بغشاء البلازما) و OER-GCaMP6f (مؤشر Ca²⁺ المشفر وراثيا المستهدف من غشاء الشبكة الإندوبلازمية الخارجية) في نفس الخلايا النجمية. يوصى بشدة باستخدام هدف الغمر بالزيت بفتحة عددية أكبر من 1.3 لنشاط Ca²⁺ التلقائي.
   1. قم بتشغيل المجهر والكاميرا ومصدر الضوء وغرفة تسخين المجهر لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التسجيل.
   2. قم بتركيب الغطاء الذي يحتوي على الخلايا المنقولة باستخدام Lck-RCaMP2 و OER-GCaMP6f في غرفة التسجيل وأضف 400 ميكرولتر من وسط التصوير. ضع غطاء فوق الغرفة.
   3. اختر مجموعة المرشح ل GCaMP6f ومصدر الضوء (ضوء الإثارة الأزرق ، على سبيل المثال ، 470-490 نانومتر ؛ انظر جدول المواد). حدد موقع الخلايا النجمية التي تعبر عن OER-GCaMP6f.
   4. اختر مجموعة مرشحات ومصدر الضوء ل RCaMP2 (ضوء الإثارة الأخضر ، على سبيل المثال ، 510-560 نانومتر ؛ انظر جدول المواد) وتأكد مما إذا كان Lck-RCaMP2 يتم التعبير عنه في نفس الخلايا النجمية. تجنب التعرض الطويل لمصدر الضوء لمنع التبييض الضوئي.
   5. سجل صور اللقطات المتتابعة ل Lck-RCaMP2 بتردد 2 هرتز لمدة دقيقتين. احفظ بيانات التصوير على محرك الأقراص الثابتة.
   6. قم بتغيير مجموعة الفلتر إلى GCaMP6f. سجل صور اللقطات المتتابعة ل OER-GCaMP6f في نفس مجال الرؤية بمعدل 2 هرتز لمدة دقيقتين. احفظ البيانات على محرك الأقراص الصلبة.
   7. تحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل الصور.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
18 mm diameter coverslips	Karl Hecht "Assistent"	# 41001118	Thickness 1 ، أغطية دائرية قطرها 18 مم ؛ يمكن استخدام أغطية بديلة.
كاميرا لتسجيل			كانت الكاميرات التالية متاحة للاستخدام: كاميرا CCD المبردة (على سبيل المثال ، Hamamatsu Photonics ، OECA-ER) ، EM-CCD CAMERA (على سبيل المثال ، Hamamatsu Photonics ، ImagEM ؛ Andor ، iXon) أو كاميرا CMOS (على سبيل المثال ، Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
برامج			مثل Metamorph (الأجهزة الجزيئية) والصورة J (المعاهد الوطنية للصحة) و TI Workbench14 (حسب الطلب)
وسيط التصوير والمخزن			استخدم الوسيط الأمثل أو المخزن المؤقت للتجربة. عند استخدام الوسيط ، من المستحسن أن يكون الوسط بدون الفينول الأحمر لتقليل مضان الخلفية. أضف 20 ملي مولار HEPES للحفاظ على درجة الحموضة خارج حاضنة ثاني أكسيد الكربون.
		الفلوري المقلوب	مثل IX73 (أوليمبوس) أو Eclipse TI (نيكون Instech)
مجموعة مرشح المجهر لتصوير			مرشح مناسب ل GFP (الإثارة ، 480 ± 10 نانومتر ؛ انبعاث ، 530 ± 20 نانومتر)
مجموعة مرشح المجهر للتصوير			مرشح مناسب لطلب تقديم العروض (الإثارة ، 535 ± 50 نانومتر ؛ انبعاث ، تمرير طويل 590 نانومتر)
		تسخين المجهر	نظام تسخين للحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية أثناء التصوير. لتجنب الانجراف الناجم عن التمدد الحراري ، يوصى باستخدام أنظمة التدفئة التي تغطي المجهر نفسه بالكامل (على سبيل المثال ، Tokai Hit و Thermobox).
مصدر ضوء المجهر للإثارة			مصباح الزئبق (100 واط) ، مصباح زينون (75 واط) ، نظام إضاءة الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) (على سبيل المثال ، CoolLED Ltd. ، precisExcite ؛ شركة Thorlabs Inc. ، مصدر LED ذو 4 أطوال موجية ؛ Lumencor ، محرك خفيف SPECTRA X). في حالة وجود كتلة زئبقية ومصباح زينون ، استخدم مرشح الكثافة المحايدة لتقليل شدة الإثارة.
باستخدام هدف غمر الزيت بالمجهر			Plan-Apochromat مع فتحة عددية أعلى من 1.3 لتسجيل نشاط Ca²⁺ التلقائي في الخلايا العصبية والخلايا النجمية.
غرفة التسجيل	Elveflow	Ludin Chamber	غرفة التسجيل هذه مخصصة لأغطية مستديرة قطرها 18 مم.
المجهر			يستخدم لتشريح الحصين. تتوفر Olympus SZ60 أو المجاهر المجسمة المكافئة.