تجارب أداء مخصص ميكروأري MicroRNA

Summary

ووصف الإجراء بسيطة مخصصة لأداء التجارب ميكروأري microRNA. وتشمل الخطوات عزل الحمض النووي الريبي ، والحمض النووي الريبي العلامات المرجعية ، التهجين العينات الى ميكروأرس ، ميكروأرس مسح وقياس الاشارات التهجين.

Abstract

microRNAs (miRNAs) هي عائلة كبيرة من النيوكليوتيدات 22 ~ (الإقليم الشمالي) لفترة طويلة جزيئات الحمض النووي الريبي التي يتم التعبير عنها على نطاق واسع في حقيقيات النوى ^1. الجينوم المعقدة ترميز ما لا يقل عن مئات miRNAs ، التي تمنع في المقام الأول على التعبير عن عدد كبير من الجينات المستهدفة بعد transcriptionally ^{2 ، 3.} miRNAs تحكم طائفة واسعة من العمليات البيولوجية ^1. بالإضافة إلى ذلك ، ارتبط تغيير التعبير ميرنا مع الأمراض التي تصيب الإنسان مثل أمراض السرطان وmiRNAs قد تكون بمثابة المؤشرات الحيوية للأمراض والتشخيص ^{4 ، 5.} من المهم ، لذلك ، لفهم التعبير وظائف miRNAs في ظل ظروف عديدة ومختلفة.

وقد استخدمت ثلاثة أساليب رئيسية للتعبير ميرنا ل : في الوقت الحقيقي PCR ، ميكروأري ، وتسلسل عميق. تقنية ميكروأري ميرنا وتتميز بأنها عالية الإنتاجية ، وعموما أقل تكلفة ، والأكثر من الخطوات التجريبية والتحليل يمكن كارالعبوات الناسفة في مختبر البيولوجيا الجزيئية في معظم الجامعات والمدارس والمستشفيات الطبية المرتبطة بها. هنا ، نحن تصف طريقة مخصصة لأداء التجارب ميكروأري ميرنا. ستتم طباعة مجموعة التحقيق ميرنا على الشرائح الزجاجية لإنتاج ميكروأرس ميرنا. يتم عزل الحمض النووي الريبي باستخدام أسلوب أو كاشف يحافظ على الأنواع الصغيرة RNA ، وصفت بعد ذلك مع صبغة مضان. كعنصر تحكم ، وصفت أيضا الحمض النووي [أليغنوكليوتيد] إشارة المقابلة إلى مجموعة فرعية من miRNAs مع صبغة مضان مختلفة. والحمض النووي المرجعية خدمة للتدليل على نوعية الشريحة والتهجين وستستخدم أيضا للتطبيع البيانات. تختلط RNA والحمض النووي والمهجنة إلى شريحة تحتوي على ميكروأري تحقيقات لمعظم miRNAs في قاعدة البيانات. بعد الغسيل ، ويتم تفحص الشريحة للحصول على الصور ، وكميا كثافة من البقع الفردية. وسيتم تجهيز هذه الإشارات الخام وتحليلها وكذلك البيانات تعبيرا عن miRNAs المقابلة. Microaيمكن جرد الشرائح rray ومجدد للحد من تكلفة ميكروأرس وتعزيز اتساق التجارب ميكروأري. نفس المبادئ وإجراءات قابلة للتطبيق على أنواع أخرى من التجارب ميكروأري مخصص.

Protocol

1. طباعة ميكروأرس ميرنا مخصص

1. طباعة ميكروأري الشرائح باستخدام مرفق الخدمات الأساسية ميكروأري في جامعة أو شركة. جودة تصنيع ميكروأري هي واحدة من أهم العوامل الحاسمة لنجاح تجربة ميكروأري. حاول عدد قليل من الخدمات إذا كان ذلك ممكنا. من الناحية المثالية ، فإن المرء 5-10 طباعة الشرائح في وقت واحد ، وجميع الشرائح وسوف تبدو متطابقة مع البقع ، مفصولة تماما الفردية.
2. للحصول على دعم ميكروأري ، ونحن استخدام الثغرات الشرائح المغلفة الثاني.
3. تحقيقات عن ميرن....

Discussion

فعلى الرغم من التطورات الأخيرة في تقنيات التسلسل عميق ، ميكروأري يظل خيارا صالحا لتحليل إنتاجية عالية من الحمض النووي والحمض النووي الريبي. مقارنة تسلسل عميق ، والتجارب ميكروأري أرخص ، ومختبر البيولوجيا الجزيئية نموذجية يمكن تنفيذ معظم التجارب وتحليل البيانات في المنزل ، والتي تتيح المرونة وتوفير الوقت. في المستقبل ، ومن المرجح ميكروأرس مناسبة تماما لاستجواب مكثف مجموعات من الجينات ، على سبيل المثال ، يمكن استخدام جميع أو مجموعة فرعية من عوامل النسخ في الجينوم أو miRNAs ، ونفس الم.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
البنود	بائع	فهرس العدد	تعليقات
NCODE متعددة الأنواع ميرنا ميكروأري دقق تعيين V2	Invitrogen	MIRMPS201	مصممة على أساس النسخة 9.0 miRBase (أكتوبر 2006). ~ أنه يحتوي على 1140 معدلة ، 34-44 [أليغنوكليوتيد] تحقيقات دامت NT ليطير ، ودودة ، الزرد ، الفأر ، الجرذ ، وmiRNAs الإنسان ، وعدد من تحقيقات الرقابة الداخلية مثل snoRNAs. تحقيقات ميرنا وdoublets من متواليات مكملة لmiRNAs ناضجة ، وبالتالي حجم 44 ~ NT. للتحليل يمكن للمرء أن التركيز على miRNAs من جينوم معين (ق) من الفائدة.
Trizol	Invitrogen	15596018	لدينا أيضا استخدام اليورانيوم المخصب وجزء صغير الحمض النووي الريبي لوصفها ، على الرغم من مجموع عينات الحمض النووي الريبي هي أسرع وأسهل لإعداد وتقدير إلى ومناسبة لتطبيقات مثل التحليل المصب مرنا.
T4 RNA يغاز 1	نيو انغلاند بيولأبس	M0204L
Ulysis اليكسا فلور 647 الأحماض النووية وصفها كيت	Invitrogen	U21660	ويمكن استخدام هذه المجموعة أو منتجات مشابهة لعينات الحمض النووي الريبي تسمية التجريبية أو RNA التحكم (بدلا من الحمض النووي السيطرة) كذلك.
5' - PCU - DY547 - 3 '	Dharmacon	أدلى مخصص	يمكن أن تكون صغيرة الحمض النووي الريبي مماثل بواسطة الكسر المسمى الربط.
أعمدة CentriSep	فصل برينستون	CS - 901
GAPSII الشرائح المغلفة	كورنينج	40004	قد تكون أنواع أخرى من الشرائح المستخدمة أيضا.
غرف ميكروأري التهجين	كورنينج	2551 أو 40080	وينبغي أن أنواع أخرى من غرف coverslips التهجين والعمل أيضا. ويمكن استخدام آلات التهجين المتاحة تجاريا التهجين تقليل الوقت إلى حد كبير ، على سبيل المثال ، إلى ساعات 2 ~.
Lifterslips	الermo / إيري العلمية	25X60I - M5439 - 001 - LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	اجيلنت