تطوير شبكة عصبية مهندسة الأنسجة الدقيقة باستخدام عمود دقيق قائم على الهيدروجيل

الملخص

المصدر: Struzyna، L. A. et al. ، مستوحاة تشريحيا من الشبكات العصبية ثلاثية الأبعاد للأنسجة الدقيقة الهندسية لإعادة بناء الجهاز العصبي وتعديله ونمذجته. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو تطوير الشبكات العصبية المصممة بالأنسجة الدقيقة باستخدام عمود صغير هيدروجيل مع نواة مصفوفة خارج الخلية. تلتصق المجاميع العصبية المصنفة ، وتوسع التوقعات ، وتشكل شبكات عصبية منظمة ، مما يساهم في التقدم في النمو العصبي وأبحاث العلاج العصبي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تطوير Agarose Hydrogel (المكون اللاخلوي للشبكات العصبية الهندسية للأنسجة الدقيقة (micro-TENNs))

1. تحضير محلول الاغاروز
   1. داخل خزانة السلامة الحيوية ، قم بإعداد خزانات للأعمدة الدقيقة عن طريق نقل 20 مل من محلول Dulbecco المخزن بالفوسفات (DPBS) إلى كل من طبقين من أطباق بتري مقاس 10 سم. عقم الملقط الدقيق والمشارط الدقيقة باستخدام معقم الخرز الساخن.
   2. قم بوزن 3 جم من الاغاروز وانقله إلى دورق معقم داخل خزانة السلامة الحيوية. أضف 100 مل من DPBS للحصول على تركيز نهائي يبلغ 3٪ من الوزن / الحجم (وزن / حجم). قم بتضمين شريط مغناطيسي نظيف وقم بتغطية الدورق بورق الألمنيوم.
   3. باستخدام لوح ساخن / محرك ، قم بتسخين الدورق على حرارة 100 درجة مئوية وحركه عند 120-200 دورة في الدقيقة لإذابة الاغاروز تماما (سيتحول المحلول من غائم إلى صاف). حافظ على التسخين والتقليب بعد ذلك لمنع التبلور وتغيير درجة حرارة التسخين حسب الضرورة لتجنب حرق الاغاروز.
      ملاحظة: يتم عرض التصنيع باستخدام كل من جهاز القطع بالليزر والأنابيب الشعرية أدناه في القسمين الفرعيين 1.2 و 1.3 ، على التوالي. انتقل إلى القسم الفرعي 1.4 بعد الانتهاء من الخطوات الموضحة في أي من القسمين الفرعيين. بالنسبة لكلتا طريقتي تصنيع الأعمدة الدقيقة ، أضف الاغاروز السائل بسرعة ، حيث يتجمد الاغاروز بسرعة عندما يبرد. عند التعقيم باستخدام الأوتوكلاف في أي من الخطوات التالية ، استخدم الشروط القياسية المطبقة على الأواني الزجاجية.
2. تحضير العمود الصغير باستخدام جهاز القطع بالليزر
   ملاحظة: يتم قطع جهاز القطع بالليزر من الأكريليك الشفاف باستخدام قاطع ليزر_CO2 تجاري. يتم توثيق تصنيع الهياكل والأجهزة من خلال القطع بالليزر جيدا لمجموعة من التطبيقات الهندسية والبحثية. يتكون هذا القالب (الشكل 1) من مجموعة من خمس قنوات أسطوانية ، يبلغ قطر كل منها 398 ميكرومتر وطول 6.35 مم. تتشكل هذه المصفوفات الأسطوانية على طولها من قطعتين: النصف السفلي (الطول: 25.4 مم ، العرض: 6.35 مم ، الارتفاع: 6.0 مم) والنصف العلوي (الطول: 31.5 مم ، العرض: 6.35 مم ، الارتفاع: 12.7 مم) ، كما هو موضح في الشكلين 1A و 1B ، على التوالي. يمكن تثبيت النصفين معا بواسطة القبعات الأمامية والخلفية التي لوحظت في الشكل 1C (الطول: 31.5 مم ، العرض: 6.35 مم ، الارتفاع: 12.7 مم) ، والتي تتميز بأربعة فتحات محاذاة تتزامن مع فتحتين في كل من القطع العلوية والسفلية والتي تساعد على تأمين جميع الأجزاء معا عند تثبيتها. تشتمل هذه الأغطية أيضا على خمسة ثقوب ، متحدة المركز للقنوات الأسطوانية ، حيث يمكن إدخال إبر الوخز بالإبر لتشكيل تجويف الأعمدة الدقيقة.
   1. قم بتعقيم الجهاز الموضح في الشكل 1 عن طريق تغطيته بورق الألمنيوم والتعقيم. قم بتجميع الجهاز كما هو موضح في الشكل 1D عن طريق محاذاة الأغطية الأمامية والخلفية مع قطعة النصف السفلي فقط وتأمين الأجزاء الثلاثة باثنين من البراغي والصواميل # 4-40 (قطر الخيط: 3.05 مم) في فتحات المحاذاة السفلية.
   2. أدخل إبرة الوخز بالإبر بالكامل (القطر: 180 ميكرومتر ، الطول: 30 مم) في فتحات الإبرة على الغطاء الأمامي أو الخلفي للجهاز (الشكل 1 د). باستخدام ماصة دقيقة ، اسكب ما يكفي من الاغاروز السائل (~ 1 مل للقنوات الخمس) على النصف السفلي من القطعة لملء كل نصفي من نصفي القناة الأسطوانية بالكامل.
   3. ضع القطعة النصف العلوي من الجهاز على الفور فوق النصف السفلي واضغط عليها حتى تصبح ثابتة في مكانها لإكمال القنوات الأسطوانية (الاحتكاك بين الأغطية والقطعة العلوية سيبقي الأخير في مكانه). انتظر ~ 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة بعد إضافة الاغاروز للسماح بالتبلور داخل قنوات الجهاز.
   4. قم باستخراج الإبرة يدويا من كل ثقوب على أغطية الجهاز. قم بإزالة البراغي وافصل الغطاءين والنصف العلوي يدويا عن قطعة النصف السفلي ، حيث ستحمل الأخيرة أعمدة الهيدروجيل الدقيقة.
   5. استخدم ملقطا دقيقا لإزالة الأعمدة الدقيقة برفق من القنوات الموجودة على القطعة السفلية ووضعها في طبق بتري المعد مسبقا الذي يحتوي على DPBS (الخطوة 1.1.1). أعد استخدام الجهاز لجولة أخرى من تصنيع الأعمدة الدقيقة. انتقل إلى القسم الفرعي 1.4.
3. تصنيع الأعمدة الدقيقة باستخدام الأنابيب الشعرية
   1. نقل الأنابيب الشعرية الزجاجية (القطر: 398.78 ميكرومتر، الطول: 32 مم) إلى داخل خزانة السلامة الحيوية. قم بتقسيم الأنابيب الطويلة يدويا إلى شظايا من 2.0 إلى 2.5 سم وأدخل إبرة واحدة للوخز بالإبر بالكامل (القطر: 180 ميكرومتر ، الطول: 30 مم) في كل جزء (الشكل 2 أ).
   2. انقل 1 مل من الاغاروز السائل من الدورق إلى سطح طبق بتري فارغ. أمسك الأنبوب الشعري والإبرة التي تم إدخالها ، ضع أحد طرفي الأنبوب على اتصال بحوض الاغاروز السائل لملئه عن طريق العمل الشعري. تحريك الأنبوب لتعزيز ارتفاع الشعيرات الدموية.
      ملاحظة: املأ الأنابيب الشعرية بأغاروز سائل بقدر ما يسمح به العمل الشعري. بعد ذلك ، يمكن تقطيع هذه الأعمدة الدقيقة إلى تركيبات أصغر اعتمادا على الطول المطلوب. عادة ما يتم استخدام مسبح الاغاروز سعة 1 مل لأنبوب واحد فقط لأن الاغاروز يبرد ويهتم بسرعة ، مما يمنع المزيد من العمل الشعري.
   3. عندما يتوقف السائل عن الارتفاع ، قم بإزالة الأنبوب الشعري من المسبح وضعه أفقيا على سطح طبق بتري. انتظر لمدة 5 دقائق للسماح لهلام الاغاروز بالاستقرار داخل الأنابيب.
   4. ضع الإبهام والسبابة على جانبي الأنبوب واضغط عليهما. استخدم اليد الأخرى لسحب الإبرة بسرعة أثناء استخدام الإبهام والسبابة لمنع العمود الصغير نفسه من الانزلاق خارج الأنبوب. أدخل إبرة قياس 30 في الأنبوب الشعري لدفع العمود الصغير ببطء إلى الخارج في طبق يحتوي على DPBS (الخطوة 1.1.1).
4. تشذيب وتعقيم الأعمدة الدقيقة
   1. قم بنقل عمود صغير واحد بدقة من DPBS إلى طبق فارغ باستخدام ملقط ناعم. أضف 10 ميكرولتر من DBPS إلى الجزء العلوي من العمود الصغير باستخدام ماصة دقيقة لمنع الجفاف. ضع الطبق الأخير أسفل مجسم للتوجيه البصري.
      ملاحظة: في جميع أنحاء البروتوكول ، يشير تجفيف الأعمدة الدقيقة أو الجفاف إلى اكتساب هيكل مجعد يمكن تمييزه بصريا عن المظهر النموذجي الرطب لهذه البنيات. تلتصق الأعمدة الدقيقة المجففة بإحكام بسطح أطباق بتري ولا يمكن تحريكها بسهولة ، في حين أن التركيبات الرطبة تميل إلى الانزلاق عبر السطح بعد التلاعب بها بالملقط. تظهر صورة تباين الطور لعمود صغير مجفف تماما في الشكل 3 أ.
   2. قم بقص العمود الصغير بمشرط صغير لتقصيره إلى الطول المطلوب (هنا ، 2-5 مم). انقل العمود الصغير المشذب بالملقط الدقيق إلى طبق DPBS Petri الآخر المحضر في الخطوة 1.1.1.
   3. كرر الخطوتين 1.4.1 و 1.4.2 لكل عمود صغير ملفق.
   4. قم بتعقيم الأعمدة الدقيقة في أطباق بتري المحتوية على DPBS تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 1 ساعة. قم بتخزين أطباق بتري عند 4 درجات مئوية قبل إضافة المصفوفة خارج الخلية (ECM) وطلاء الخلايا.

2. ثقافة الخلايا العصبية الأولية وطريقة تجميع الخلايا القسرية

1. تحضير مجموعة البئر الصغيرة الهرمية
   ملاحظة: يستخدم هذا القسم قالبا مطبوعا ثلاثي الأبعاد يتكون من قاعدة أسطوانية (قطر: 2.2 سم ، الارتفاع: 7.0 مم) وتسعة أهرامات مربعة في الأعلى (طول الجانب: 4.0 مم ، زاوية مائلة: 60 درجة) ، منظمة في مصفوفة 3 × 3 ، كما هو موضح في الشكل 1E. عملية التصنيع المضافة باستخدام طابعات ثلاثية الأبعاد المتوفرة تجاريا موثقة جيدا. يمكن استخدام برامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر لتصميم القالب. يمكن بعد ذلك تحويل ملف التصميم الناتج رقميا إلى مسار أداة لطابعة ثلاثية الأبعاد. لكل طابعة مواصفات مختلفة ، وتختلف التعليمات الخاصة بإعداد وتشغيل طابعة ثلاثية الأبعاد وفقا لذلك.
   1. استخدم مثقاب 3/32 بوصة لثقب 16 ثقبا في مصفوفة 4 × 4 (طول الجانب: 4 سم ، فصل الثقب: 1 سم) ، متمركزة في غطاء طبق بتري مقاس 10 سم. داخل غطاء الدخان الكيميائي ، استخدم القطعة السفلية من طبق بتري لتزن 27 جم من بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) و 3 جم من عامل المعالجة (بنسبة 1:10). يقلب بملعقة صغيرة لتوزيع العامل بالتساوي.
   2. قم بتغطية PDMS / عامل المعالجة بالغطاء المثقوب. قم بتوصيل أحد طرفي الخرطوم بمنفذ التفريغ لغطاء الدخان وأدخل الطرف الآخر في جذع القمع (قطر الفم: 10 سم ، طول الساق: 3 سم ، قطر الساق: 1.5 سم).
   3. قم بعمل فتحة باستخدام لقمة ثقب مقاس 3/32 بوصة في الجزء العلوي من لمبة ماصة سعة 1 مل وأدخل طرف ماصة دقيقة سعة 1,000 ميكرولتر وقم بتثبيته في الفتحة (مع وضع الطرف المدبب لأعلى). ضع المصباح وقم بتثبيته في الخرطوم واسحب الخرطوم لأعلى حتى يغلق المصباح الخرطوم في جذع القمع.
   4. ضع القمع على غطاء الطبق المثقوب وقم بتأمين الخرطوم بدعامة قوية متاحة. افتح صمام التفريغ لمدة 5 دقائق للشفط وإحضار فقاعات الهواء إلى السطح.
   5. أغلق الصمام ، وقم بإزالة القمع ، واضرب طبق بتري على سطح غطاء الدخان ~ 3 مرات لتفجير أي فقاعات هواء متبقية.
   6. ضع قالبا مطبوعا ثلاثي الأبعاد هرميا في كل بئر في صفيحة ثقافة مكونة من 12 بئرا ، مع توجيه الأهرامات لأعلى. صب PDMS / عامل المعالجة فوق القوالب حتى تمتلئ كل بئر من اللوحة. غطي الطبق المكون من 12 بئرا بغطاءه وانقله إلى الفرن لمدة ساعة واحدة عند 60 درجة مئوية حتى يجف.
   7. قم بإزالة كل مصفوفة بئر صغيرة PDMS بعناية (الشكل 1F) من اللوحة باستخدام ملعقة صغيرة. قم بتغطية مصفوفات PDMS بورق الألمنيوم وتعقيمها عن طريق التعقيم. داخل خزانة السلامة الحيوية ، أدخل مصفوفة واحدة من الآبار الصغيرة في كل بئر من صفيحة 12 بئرا (الشكل 2 ب).
2. عزل الخلايا العصبية القشرية عن أجنة الفئران
   1. أضف ~ 20 مل من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) إلى كل من أربعة إلى ستة أطباق بتري مقاس 10 سم (واحد لكل نسيج تشريح) داخل خزانة السلامة الحيوية. انقل هذه الأطباق إلى غطاء التشريح وضعها على الثلج. قم بتعقيم أدوات التشريح ، مثل المشارط الدقيقة والمقص والملقط باستخدام معقم الخرز الساخن.
   وسيط
   2. قاعدي للخلايا العصبية الجنينية قبل التدفئة + 2٪ مكمل خال من المصل + 0.4 ملي مولار L-glutamine (يشار إليه فيما يلي باسم "وسيط الاستزراع" ) و 0.25٪ تريبسين + 1 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) عند 37 درجة مئوية. قم بإذابة ديوكسيربونوكلياز (DNase) I عن طريق وضعه في درجة حرارة الغرفة. تحضير 1.5 مل من محلول 0.15 مجم / مل DNAse I في HBSS والحفاظ على المحلول على الجليد.
   3. قتل فأر جنيني في اليوم 18 عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون وتأكيد الموت بقطع الرأس. انقل الذبيحة إلى غطاء تشريح معقم وضعها على الجانب البطني لأعلى. اشطف البطن جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول.
   4. افتح الرحم وأخرج الأجنة (عادة ~ 11) من الأكياس السلوية بالمقص وانقلها بالملقط إلى طبق بتري يحتوي على HBSS البارد ، كما هو موضح. ضع كتلة جرانيت مبردة (-20 درجة مئوية) أسفل المجسم المجسم. ضع طبق بتري على سطح هذه الكتلة الباردة للحفاظ على درجة الحرارة المنخفضة ل HBSS طوال عملية التشريح.
   5. اشطف الجراء عن طريق تحريك HBSS ثم انقلها إلى الطبق النظيف التالي الذي يحتوي على HBSS. بمساعدة المجسم وأدوات التشريح ، قم بإزالة الرؤوس ونصفي الكرة المخية وقشرة الأجنة بالتتابع ونقل كل نسيج بالملقط إلى طبق جديد مليء ب HBSS بعد كل تشريح.
   6. قم بشفط القشرة فقط باستخدام ماصة باستور وضع الأنسجة في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل. تخلص من الأنسجة الأخرى التي تم تشريحها. اشطف القشرة ثلاث مرات عن طريق إضافة وإزالة ~5 مل من HBSS بالتتابع باستخدام ماصة مصلية. ضع الأنبوب على الثلج عندما لا يكون قيد الاستخدام.
   7. انقل القشرة باستخدام ماصة باستور إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على التربسين-EDTA الدافئ مسبقا (4-6 قشريات لكل 5 مل من التربسين-EDTA). حرك الأنبوب يدويا مرة واحدة وضعه عند 37 درجة مئوية ، اقلب الأنبوب كل 3 دقائق لمنع الأنسجة من التكتل.
   8. توقف عن التعرض للتربسين بعد ~ 10 دقائق عن طريق إزالة الأنسجة بماصة باستور ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 15 مل. أضف محلول DNase I 0.15 ملغم/مل (1.5 مل) إلى الأنبوب باستخدام ماصة.
   9. استخدم ماصة باستور لتفتيت كتل الأنسجة يدويا ثم الدوامة (~ 30 ثانية) حتى يبدو المحلول متجانسا ولا توجد شظايا أنسجة متبقية في السائل. إذا لم يكن من الممكن تجانس المحلول تماما، فاستخرج الأجزاء غير القابلة للذوبان عن طريق سحبها إلى طرف ماصة باستور.
   10. الطرد المركزي محلول الخلية المتجانسة الذي تم الحصول عليه في الخطوة 2.2.9 عند 200 × جم لمدة 3 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة باستور ، مع الحرص على عدم إزعاج الخلايا المحببة. أضف 2 مل من وسط المزرعة باستخدام ماصة مصلية ودوامة لإعادة تعليق الخلايا.
   11. احسب عدد الخلايا في المحلول المحضر في الخطوة 2.2.10 باستخدام مقياس كثافة الدم ؛ العائد المتوقع هو 3.0-5.0 × 10⁶ خلايا / نصف الكرة القشري. قم بإعداد 1 مل أو أكثر من تعليق الخلية في وسط الاستزراع ، بكثافة 1.0-2.0 × 10⁶ خلايا / مل.
3. تكوين مجاميع الخلايا العصبية
   1. باستخدام ماصة دقيقة، أضف 12 ميكرولتر من معلق الخلية 1.0-2.0 × 10⁶ / مل في كل بئر صغير من مصفوفة PDMS (التي تم وضعها في اللوحة في الخطوة 2.1.7).
      ملاحظة: يمكن تعديل تركيز الخلية اعتمادا على القطر الداخلي للعمود الصغير وحجم ركام الخلية المطلوب، حيث أن التركيزات الأعلى تنتج مجاميع أكبر.
   قم
   2. بالطرد المركزي للوحة عند 200 × جم لمدة 5 دقائق لإجبار الخلايا على تجميع الخلايا في قاع الآبار الصغيرة (الشكل 2 ب). أضف بعناية ~ 2 مل من وسط الاستزراع إلى الجزء العلوي من كل مصفوفة PDMS لتغطية جميع الآبار الصغيرة المصنفة ، مع الحرص على عدم إزعاج الخلايا المجمعة.
   3. احتضان اللوحة لمدة 12-24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.

3. تطوير المكون الخلوي للتصنيع الأساسي ل micro-TENNs

1. ECM
   1. بعد الحضانة الإجمالية ، أضف النوع الأول من الكولاجين واللامينين إلى وسط الثقافة (بتركيز 1 مجم / مل لكل منهما) في أنبوب الطرد المركزي الدقيق لتحضير محلول ECM. قم بتنفيذ الخطوات 3.1.2-3.1.4 في درجة حرارة الغرفة ، ولكن حافظ على الأنبوب مع ECM على الجليد عندما لا يكون قيد الاستخدام لمنع التبلور المبكر.
      ملاحظة: النفقات النموذجية هي 4 ميكرولتر من محلول ECM لكل عمود صغير (الطول: 5 مم ، المعرف: 180 ميكرومتر).
   2. اضبط الرقم الهيدروجيني لمحلول ECM عن طريق نقل 1-2 ميكرولتر إلى ورق عباد الشمس للتحقق من الأس الهيدروجيني الأولي ، وإضافة 1 ميكرولتر من 1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) و / أو 1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك (HCl) إلى ECM ، حسب الحاجة ، وكرر ذلك حتى يصبح الرقم الهيدروجيني 7.2-7.4. تأكد من تجانس محلول ECM عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل مع تجنب تكوين فقاعات الهواء.
   3. انقل الأعمدة الدقيقة بالملقط المعقم من الأطباق في الخطوة 1.4.3 لتفريغ أطباق بتري مقاس 35 أو 60 مم. اعمل على 4-5 أعمدة دقيقة في المرة الواحدة لمنع الجفاف. قم بتوصيل طرف سعة 10 ميكرولتر بطرف سعة 1,000 ميكرولتر بماصة دقيقة. باستخدام المجسم للتوجيه البصري ، ضع الطرف في أحد طرفي الأعمدة الدقيقة والشفط لاستخراج DPBS المتبقية وفقاعات الهواء من التجويف.
   4. ارسم بسرعة 4-5 ميكرولتر من ECM في ماصة دقيقة. عند المراقبة تحت منظار مجسم، ضع طرف الماصة الدقيقة عند أحد طرفي الأعمدة الدقيقة وقم بتفريغ ما يكفي من ECM لملء التجويف. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في التجويف ، لأنها قد تمنع النمو المحوري من خلال ECM. في حالة وجود فقاعات هواء، قم بإزالة وحدة التحكم في المحرك (ECM)، كما هو موضح في الخطوة 3.1.3، وأضف وحدة التحكم في المحرك (ECM) مرة أخرى.
   5. لمنع الجفاف ، أضف ~ 2 ميكرولتر من ECM حول كل عمود صغير. احتضان الأعمدة الدقيقة للهيدروجيل / ECM في أطباق بتري عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 25 دقيقة. انتقل إلى بذر الخلايا مباشرة بعد الحضانة.
      ملاحظة: تهدف فترة الحضانة في الخطوة 3.1.5 إلى إتاحة الوقت لبلمرة الكولاجين واللامينين داخل الأعمدة الدقيقة.
2. بذر الخلايا العصبية في الأعمدة الدقيقة
   ملاحظة: لتغيير وسط استزراع الركام المنقول ، قم بإمالة اللوحة ، واستخدم ماصة دقيقة لإزالة الوسط الذي يتجمع على جدار البئر ، ثم أضف ببطء ~ 1 مل على الحائط (لتجنب إزعاج الركام في الآبار الصغيرة الهرمية). كرر هذا التغيير المتوسط مرة ثانية.
   1. بعد فترة الحضانة في الخطوة 3.1.5، انقل ما يقرب من 10-20 ميكرولتر من وسط الاستزراع إلى منطقتين حرتين في أطباق بتري التي تحمل الأعمدة الدقيقة. استخدم ماصة دقيقة لنقل الركام بشكل فردي إلى طبق بتري الذي يحتوي على التركيبات ونقلها بالملقط إلى أحد المجموعات الصغيرة لوسط الاستزراع للحفاظ على صحة الخلية.
   2. أثناء المراقبة تحت منظار مجسم ، أدخل ركاما في كل طرف من الأعمدة الدقيقة ل micro-TENNs ثنائية الاتجاه أو في أحد طرفيها لبنية أحادية الاتجاه (حسب الرغبة) باستخدام الملقط. تأكد من وضع الركام داخل الأعمدة الدقيقة باستخدام المجسم المجسم. استخدم الملقط لنقل الأعمدة الدقيقة المصنفة إلى مجموعة صغيرة أخرى من وسط الاستزراع لتجنب الجفاف والحفاظ على الصحة الإجمالية.
   3. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 45 دقيقة للسماح للركام بالالتصاق ب ECM. تحقق من بقاء المجاميع في نهايات الأعمدة الدقيقة باستخدام المجسم ؛ أعد إدخال مجاميع الخلايا وكرر خطوة الحضانة حسب الضرورة.
   4. قم بإغراق أطباق بتري التي تحتوي على micro-TENNs بعناية بوسط الاستزراع (3 أو 6 مل لطبق بتري 35 أو 60 مم ، على التوالي) باستخدام ماصة مصلية. ضع الأطباق في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ للاستزراع طويل الأمد.
   5. قم بإجراء تغييرات نصف الوسائط كل يومين باستخدام وسيط الثقافة. قم بإزالة نصف الوسط القديم بعناية باستخدام ماصة واستخدم المجسم للتوجيه البصري لتجنب شفط micro-TENNs. استبدلها بإضافة وسط طازج ودافئ مسبقا ببطء باستخدام ماصة.

النتائج

فئة الشكل = 'صورة image-style-align-center image_resized' style='display: table؛ margin-left: auto؛ margin-right: auto ؛ width: 75٪ ؛ '>

الشكل 1: مخططات لجهاز تصنيع العمود الصغير المقطوع بالليزر وقالب البئر الصغير الهرمي المطبوع ثلاثي الأبعاد لتجميع الخلايا. (أ) - (ب) مخطط وصورة للنصفين السفلي والعلوي من مصفوفة القنوات الأسطوانية ، على التوالي ، المستخدمة لتصنيع أعمدة الهيدروجيل ...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Laser Cutter Universal Laserأنظمة الليزر PLS4.75تستخدم لتصنيع قالب القناة الدقيقة المقطوع بالليزر.جهاز تصنيع العمود الصغير المقطوع بالليزرحسب الطلب -------------- اتصل بمجموعة البحث لدينا إذا كنت مهتما. الأبعاد والمخططات الواردة في المخطوطة.مسامير -------------- -------------- # 4-40 بقطر خيط 3.05 ممالصواميل -------------- -------------- # 4-40 بقطر خيط 3.05 ممإبرة الوخز بالإبر (قطر 180 ميكرومتر) Lhasa الطبيةsj.16X40قد يختلف القطر وفقا للحجم المطلوب لتجويف العمود الصغير.طبق بتريفيشر08772B محلول ملحي مخزن بالفوسفات من دولبكو (DPBS)Invitrogen14200075 البوليسترين الماصة المصلية التي يمكن التخلصمنها فيشر13-678-11D AgaroseSigmaA9539-50G أنبوب شعري (قطر 398 ميكرومتر)فيشر21170Dقد يختلف القطر وفقا للحجم المطلوب لغلاف العمود الصغير.صفيحة ساخنةفيشرSP88857200 شريط مغناطيسيفيشر1451352 ماصة دقيقةسيجماZ683884-1EA 25 مم مقياس إبرةفيشر14-826-49 مشرطميكرو روبوز جراحيRS-6270 مقصأدوات العلوم الدقيقة14081-09 ملقطأدوات الدقة العالمية501985 معقم الخرز الساخنSigmaZ378550-1EA StereoscopeNikonSMZ800Nتستخدم لجميع خطوات التشريح وتصنيع micro-TNN.ذيل الفئران من النوع الأول من الكولاجينCorning354236يحفظ عند 4 درجات مئوية وقم بإزالته فقط عند الحاجة. استخدم الثلج للحفاظ على درجة حرارته عند الاستخدام.أنبوب الطرد المركزيالدقيق فيشر02-681-256 الفأر لامينينكورنينج354232الحفاظ على درجة حرارة 4 درجات مئوية وإزالته فقط عند الحاجة. استخدم الثلج للحفاظ على درجة حرارته عند الاستخدام.الوسط العصبي القاعدي Invitrogen21103049الوسط القاعدي لثقافة الخلايا العصبية قبل الولادة والجنينية. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية ويسخن في 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)فيشرSS2661 حمض الهيدروكلوريك (HCl)فيشر SA48-1 ورق عباد الشمس فيشر09-876-18 محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS)Invitrogen14170112يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.0.25٪ Trypsin-EDTAInvitrogen25200056يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية ويسخن في 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.ديوكسيربونوكلياز البنكرياس البقري (DNase) ISigma10104159001يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية ويسخن في 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.مكمل B-27المكمل 12587010 Invitrogenيضاف إلى الوسط العصبي لثقافة الخلايا العصبية الحصينية والقشرية. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية ويسخن في 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.35050061 L-glutamineInvitrogenيحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية ويسخن في 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.سبراج دولي اليوم الجنيني 18 جرذا سلالةنهر تشارلز001 ماصة باستورفيشر22-042816 15 مل أنبوب الطرد المركزيEMESCO1194-352099 دوامةفيشر02-215-414 جهاز طرد مركزيفيشر05-413-115 مقياس الدمفيشر02-671-6 Objet30 طابعة ثلاثية الأبعادستراتاسيس -------------- تستخدم لتصنيع قوالب الآبار الصغيرة الهرمية.قالب البئر الهرمي المطبوع ثلاثي الأبعادحسب الطلب -------------- اتصل بمجموعتنا البحثية إذا كنت مهتما. الأبعاد والمخططات الواردة في المخطوطة.Polydimethylsiloxane (PDMS) وعامل المعالجةFisherNC9285739يأتي كمجموعة مع المطاط الصناعي وعامل المعالجة. استخدمه داخل غطاء الدخان الكيميائي.قمعفيشر10-348C 1 مل لمبة ماصةسيجماZ509035 ملعقة صغيرةفيشرS50821 لوحة ثقافة 12 بئرEMESCO1194-353043 فرنفيشر11-475-154 حاضنةفيشر13 998 076 Eclipse Ti-S MicroscopeNikon-------------- يستخدم لالتقاط صور تباين الطور. من خلال الحصول على الصور الرقمية باستخدام كاميرا QiClick المتصلة ببرنامج البحث الأساسي لعناصر نيكون (4.10.01).