تصور وظيفة الجهاز التنفسي الميتوكوندريا باستخدام السيتوكروم C أوكسيديز / سكسينات نازعة (كوكس / SDH) مزدوجة وضع العلامات الكيمياء النسيجية

Summary

والسيتوكروم أوكسيديز ج / نازعة الصوديوم (كوكس / SDH) المزدوج الوسم الأسلوب يسمح للرؤية مباشرة من الميتوكوندريا القصور التنفسي الانزيم في أقسام الأنسجة الطازجة المجمدة. هذا هو أسلوب مباشر النسيجية ومفيد في التحقيق في أمراض الميتوكوندريا ، والشيخوخة ، والاضطرابات المتصلة بالشيخوخة.

Abstract

الميتوكوندريا الحمض النووي (و mtDNA) العيوب هي سبب هام للمرض ، وربما تكمن وراء الشيخوخة والشيخوخة ذات الصلة ^1،2 التعديلات. نظرية الميتوكوندريا الشيخوخة يشير إلى وجود دور للطفرات و mtDNA ، الذي يمكن أن يغير توازن الطاقة الحيوية والوظيفة الخلوية ، في عملية الشيخوخة ^3. وقد تم تجميع ثروة من الأدلة لدعم هذا ^1،4 الناحية النظرية ، على سبيل المثال يجري mutator ⁵ و mtDNA الماوس ، ولكن الدور الدقيق للضرر و mtDNA في الشيخوخة ليست مفهومة تماما ^6،7.

مراقبة نشاط الانزيمات التنفسية هو نهج واضحة للتحقيق في ضعف الميتوكوندريا. رابعا معقدة ، أو السيتوكروم أوكسيديز ج (كوكس) ، أمر ضروري من أجل وظيفة الميتوكوندريا. يتم ترميز مفارز الحفاز كوكس و mtDNA والتي تعتبر ضرورية لتجميع المجمع (الشكل 1). وبالتالي ، تستند إلى حد كبير التوليف الصحيح والدالة على سلامة و mtDNA ^2.رغم أن من الممكن تحقيق المجمعات التنفسية الأخرى ، المجمعات الرابع والثاني هم الأكثر قابلية للفحص النسيجية ^8،9. يتم ترميز معقدة تماما الثاني ، أو نازعة سكسينات (SDH) ، عن طريق الحمض النووي (الشكل 1) ، وعادة ما يكون نشاطها لم تتأثر و mtDNA ضعاف ، على الرغم من زيادة قد تشير إلى نشوء حيوي الميتوكوندريا ^10-12. لاحظ و mtDNA ضعف في أمراض الميتوكوندريا ، والشيخوخة ، والأمراض المرتبطة بالعمر وغالبا ما يؤدي إلى وجود خلايا للنشاط COX منخفضة أو غائبة ^2،12-14. على الرغم من أن يتم التحقيق كوكس وSDH أنشطة فردية ، أثبتت متتابعة المزدوج وسم ^15،16 طريقة ليكون من المفيد في تحديد الخلايا التي تحتوي على ضعف الميتوكوندريا ^12،17-21.

وقد تم تحديد العديد من الدساتير الأمثل للمقايسة ، مثل تركيز الركيزة ، يقبلون الإلكترون / المتبرعين والناقلين الإلكترون وسيطة ، وتأثير درجة الحموضة ، والتفاعل طنIME ^9،22،23. 3،3 '- diaminobenzidine (DAB) هو المانحة الإلكترون فعالة وموثوق بها ^22. في الخلايا التي تحتوي على سير كوكس ، فإن البوليمر الناتج البني indamine توطين في أعراف الميتوكوندريا وتشبع الخلايا ^22. وبالتالي فإن هذه الخلايا مع كوكس مختلة لا تكون مشبعة بواسطة المنتج DAB ، والسماح للتصور النشاط SDH بتخفيض tetrazolium nitroblue (NBT) ، والمتقبلة الإلكترون ، إلى منتج الأزرق نهاية formazan ^9،24. تضاف السيتوكروم ج سكسينات الصوديوم وركائز لتطبيع المستويات المحلية بين السيطرة والأنسجة المريضة / ⁹ متحولة. الكاتلاز يضاف كاجراء احترازي لتجنب ردود الفعل المحتملة من تلوث النشاط البيروكسيداز ^9،22. يستخدم Phenazine methosulfate (PMS) ، حاملة الإلكترون الوسيطة ، بالاشتراك مع أزيد الصوديوم ، مثبط السلسلة التنفسية ، وزيادة في تشكيل منتجات التفاعل النهائي ^9،25. على الرغم من ذلك إبلاغأوجه ، وبعض التفاصيل الهامة التي تؤثر على نتيجة الفحص هذه واضحة لائق ، بالإضافة إلى الضوابط المحددة والتقدم في التقنية ، لم يتم تقديمها حتى الآن.

Protocol

1. التحضير لأنسجة cryosectioning

1. التضحية الحيوانية إما خلع عنق الرحم أو قطع الرأس ، وفقا لتصريح الأخلاقية المتاحة.
2. جمع الأنسجة بسرعة من الفائدة (على سبيل المثال. الدماغ) ، وتجميد بسرعة على الثلج الجاف (الأنسجة قد تتطلب درجة التجمد في isopentane أو البروبان المبردة مع النتروجين السائل للحصول على التشكل الأمثل). تخزينها في الأنسجة رقائق الألومنيوم في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للمقطع.
3. تضمين الأنسجة المجمدة تمهيدا لcryosectioning.
....

Discussion

مجتمعة كوكس / SDH النسيجية طريقة تمكن من الخلايا التصور مع ضعف الميتوكوندريا. هذه التقنية ، مع دراسات في وقت مبكر يعود إلى عام 1968 ، لا يزال يتمتع بشعبية ، مع العديد من معتبرا انه "المعيار الذهبي" لتحديد أمراض الميتوكوندريا في المرضى ^{14،19،26،27.} الآن أنها كثيرا ما تستخدم لتحقيق طفرة و mtDNA يحركها الشيخوخة والاضطرابات المتصلة بالشيخوخة ^{12،13،18،20،21،24.} وكثيرا ما يستخدم في كوكس / SDH المزدوج الوسم الأسلوب بالتوازي مع الأساليب الأخرى لتحديد الطفرا.......

Materials

اسم الكاشف	شركة	فهرس العدد	تعليق (اختياري)
الثلج الجاف	AGA AB الغاز	كتلة النموذج
Isopentane (2 - methylbutane)	سيغما الدريخ	277258 CAS : 78-78-4
Cyrostat تضمين الحل	ساكورا Finetek	الأنسجة تك 4583
ناظم البرد	Microm	Microm النموذجي جلالة 500M
الشرائح	الحرارية العلمية	سوبر بلس فروست منزل جلاسر J1800AMWZ
تغطية النظارات البورسليكات الزجاج	VWR الدولية	16004-098	24 × 50 مم
مرشح ورقة	Munktell تصفية AB	جودة : 1350 مقالةرقم : 242 001	430 X 430 مم
3،3 '- diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)	سيغما الدريخ	سيغما النظام الركيزة السائل ، D7304
ج السيتوكروم (النوع الثالث ، من القلب الخيول)	سيغما الدريخ	C2506 CAS : 9007-43-6
الكاتلاز البقري (من الكبد)	سيغما الدريخ	C9322 CAS : 9001-05-2
زرقة النتروتترازوليوم (NBT)	سيغما الدريخ	N6876 CAS : 298-83-9
سكسينات الصوديوم	سيغما الدريخ	S2378 CAS : 6106-21-4
Phenazine methosulfate (PMS)	سيغما الدريخ	P9625 CAS : 299-11-6	PMS حساس الضوء. درع من الضوء.
أزيد الصوديوم	سيغما الدريخ	S8032 CAS : 26628-22-8
الزيلين	VWR الدولية	EM - XX0060 - 4
Entellan	VWR الدولية	100503-870
المالونات (حمض المالونيك)	سيغما الدريخ	M1296 CAS : 141-82-2