نحن تصف نهجا بديلا للتعداد متفطرات في المختبر ، والذي يستخدم مراسل الجينات الموسومة متفطرات بدلا من الوحدات المكونة للمستعمرة (كفو). "البقاء" من الكائنات الحية ، فضلا عن استضافة الاستجابة علامات. تقاس في وقت واحد ، وتوفير منخفضة التكلفة ، ونظام متعدد الاستعمالات والوظيفية للدراسات المضيف / الممرض التفاعلات في سياق السل
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
وظيفية فحص الدم لقياس الجامعة صلاحية مايكوباكتيريا ، وذلك باستخدام الجينات المرتبطة دلاليا مراسل بي سي جي إم أو السل (BCG لوكس / M. التربيوم لوكس)
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لقد لعبت المقايسات الفنية لفترة طويلة دورا رئيسيا في قياس استمناع لقاح معين. وأعرب عن تقليدية هذا النحو التتر جراثيم المصل. وقد مكنت الدراسات من التتر جراثيم المصل في الاستجابة لقاحات الطفولة لنا لتطوير والتحقق من وقف انتاج المواد الانشطارية لمستويات الحماية والاستجابات المناعية مثل خفض العرضية في الاستخدام الروتيني. وقد اتخذت هذه المقايسات إلى الأمام لا إلى تقييم لقاحات الروتينية التي تحفز الخلايا في المقام الأول بوساطة الحصانة في شكل المستجيب استجابات الخلايا التائية ، مثل لقاحات السل. في نموذج حيواني ، يتم تقييم أداء روتيني لمرشح معين في لقاح للجراثيم المقايسات الموحدة ، وتعرضوا جميعا الحالي رواية لقاح السل المرشحين لهذه الخطوة في تقييمها قبل مرحلة التجارب على الانسان 1. وينبغي تقييم استمناع وبالتالي احتمال فعالية اللقاحات الواقية المضادة للسل رواية الخضوع مثالي مماثل خطوة حكيمة التقييم في النماذج البشرية الآن ، بما في ذلك القياسات في المقايسات للجراثيم.
هي راسخة المقايسات للجراثيم في سياق البحوث قاح السل في النماذج الحيوانية ، حيث يتم تطبيقها على الشاشة اللقاحات المرشحة اعدة. تخفيض الحمولة الجرثومية في وظائف الأجهزة المختلفة كما الرئيسي للقراءة من استمناع. ومع ذلك ، فقد أدرجت هذه المقايسات في أي التجارب السريرية للقاحات المضادة للسل الرواية حتى الآن.
على الرغم من أنه لا يزال الغموض حول الآليات الدقيقة التي تؤدي إلى قتل متفطرات الضامة داخل الإنسان ، فهناك حاجة واضحة للتفاعل الضامة ، والخلايا التائية مع متفطرات. في مقايسة وصفها في هذه الورقة تمثل جيلا جديدا من المقايسات للجراثيم التي تمكن من الدراسات لهذه المكونات الخلوية الرئيسية مع جميع العوامل الأخرى الخلوية والخلطية موجودة في الدم كله ، من دون الادلاء افتراضات حول مساهمتهم الفردية النسبي. المقايسة التي وصفها مجموعتنا يستخدم كميات صغيرة من الدم الكامل وبالفعل استخدمت في دراسات من البالغين والأطفال في السل المتوطن الإعدادات. لقد أظهرنا استمناع من لقاح بي سي جي ، وزيادة نمو المتفطرات في المرضى المصابين بالفيروس ، فضلا عن تأثير العلاج المضاد للفيروس وفيتامين (د) على البقاء على قيد الحياة الفطرية في المختبر. نحن هنا تلخيص هذه المنهجية ، وتقديم بيانات استنساخ لنا باستخدام هذا النموذج البسيط نسبيا ، وانخفاض التكلفة ومجال الاستخدام.
ملاحظة : التعاريف / المختصرات
BCG = م لوكس BCG البقرية ، مونتريال السلالة ، حولت المكوك مع pSMT1 بلازميد يحمل جينات من luxAB harveyi الضمة ، تحت سيطرة GroEL بالمتفطرات (hsp60) المروج.
كفو وحدة مستعمرة = التشكيل (وهو مقياس لقابلية الفطرية).
البروتوكول
1. إعداد المخزون BCG مراسل لوكس متفطرات
- تنمو BCG لوكس (M. البقرية سلالة مونتريال BCG تحولت مع pSMT1 المكوك البلازميد) مع اهتزاز في 200rpm إلى منتصف المرحلة لوغاريتمي في Middlebrook 7H9 مرق تحتوي على 0.2 ٪ الجلسرين ، 0.05 ٪ توين 80 و 10 ٪ لتخصيب ADC.
- إعداد 1ml من تخفيف 01:10 BCG لوكس للثقافة في برنامج تلفزيوني العقيمة في أنبوب luminometer (PBS 900μl + 100μl الثقافة لوكس بي سي جي) في مكررة.
- تحميل أنبوب يحتوي على N - decyl ألدهيد (luciferase الركيزة انزيم) على الجزء الخلفي من الجهاز والتأكد من تأمين الغطاء والأنابيب في مكانها.
- رئيس luminometer حاقن مع الركيزة عبر برنامج رئيس الوزراء ، تعيين لحقن 100 × 3 دوري أبطال أوروبا في كل من 3 فتيلة أنابيب فارغة وضعت في luminometer.
- تحميل أنابيب 2 في luminometer واتخاذ قراءات من خلال برنامج وضعت في حقن 100 من دوري أبطال أوروبا الركيزة في كل أنبوب وقراءة لمدة 20 ثانية في فترات ثوانى 1.
- عندما وصلت الأسهم 1x10 RLU 8 / 8 مل إلى 2x10 RLU / مل (وهذا يستغرق حوالي 3-4 أيام من النمو) ، إضافة حجم مساو من 30 ٪ معقمة الجلسرين للثقافة في أنبوب الصقر 50ml واخلطه برفق.
- قسامة 1.5ml في مجلدات المسمى microtube المسمار الحد الأقصى 2ml وتخزينها في -80 درجة مئوية.
2. تحديد المخزون RLU / CFU الارتباط ومحتويات aliquots
- إضافة 15ml المتوسط Middlebrook الثقافة 7H9 ADC مع ملحق من 10 ٪ إلى دورق مخروطي 200ml مع قبعة تنفيس.
- إضافة 15μl من هيغروميسين و30μl توين من 20 ٪.
- إزالة قارورة لوكس BCG من الفريزر وتذويب في درجة حرارة الغرفة (RT) في مجلس الوزراء السلامة. إضافة محتويات القارورة في المتوسط وإحكام الغطاء.
- احتضان مع اهتزاز في 200rpm عند 37 درجة مئوية لمدة 4 أيام.
- في كل يوم ، ويشكلون 10 أضعاف المسلسل التخفيفات (1:10 ، 1:100 ، 1:1000 ، و1:10،000 1:100،000) من أجل تقرير CFU.
- إعداد التخفيفات نفسه بالتوازي وتكرارا لتحديد التلألؤ (انظر الجزء 1،2-1،6).
- إعداد two - 3 المقصورة لوحات من أجار 7H11 Middlebrook (1 لتر من السوائل التي تحتوي على الجلسرين المتوسط 0.5 ٪ ، الملحق OADC 10 ٪ ، 1 مل من توين 20 ٪ و 1 مل من هيغروميسين).
- لوحة من أصل 100μl التخفيف على كل جزء من كل لوحة باستخدام رش منفصلة ، وتوزيع السائل على قدم المساواة في جميع أنحاء الغرفة الفردية.
- ختم كل لوحة مع parafilm ، ضع في حقيبة بلاستيكية معقمة ، وختم الشريط مع الأوتوكلاف ، واحتضان لمدة 2 إلى 37 درجة مئوية أسابيع مع الأغطية أسفل.
- فحص بانتظام حتى تظهر CFUs (2-3 أسابيع).
- عد المستعمرات ، وإزالة لوحات من الحاضنة ومكان على عداد مستعمرة. حساب المتوسط لكل التخفيف من لوحات مكررة.
- حساب نسبة RLU / CFU باستخدام RLU تعادل وتعول CFU لكل التخفيف. وينبغي أن تكون نسبة ما بين 3 و 5 RLU / CFU.
3. التحضير للثقافة لوكس BCG للتلقيح في الدم الكامل
- إضافة 15ml المتوسط Middlebrook الثقافة 7H9 ADC مع ملحق من 10 ٪ إلى دورق مخروطي 200ml مع قبعة تنفيس.
- إضافة 15μl من هيغروميسين و30μl توين من 20 ٪.
- إزالة قارورة لوكس BCG من الفريزر وتذويب في RT في مجلس الوزراء السلامة. إضافة محتويات القارورة في المتوسط وإحكام الغطاء.
- احتضان مع اهتزاز في 200rpm عند 37 درجة مئوية لمدة 2 إلى 4 أيام.
- إعداد 1ml من تخفيف 01:10 BCG لوكس للثقافة في برنامج تلفزيوني العقيمة في أنبوب luminometer (PBS 900μl + 100μl الثقافة لوكس بي سي جي) في مكررة.
- رئيس luminometer مع الركيزة (كما هو موضح أعلاه) ، دوامة بلطف الأنابيب (2) وتحميل في luminometer واتخاذ قراءات (كما هو موضح أعلاه).
- استخدام هذه القراءة لتخفيف باستمرار الثقافة في برنامج تلفزيوني لاعطاء ما يعادل 6 RLU 7x10 (وهذا سوف يعطي اللقاح من حوالي 2x10 الدم CFU / 5 مل ونسبة BCG لحيدات من حوالي 1:1 ، على افتراض أن عدد من الوحيدات حوالي 5 إلى 2x10 4x10 5 حيدات في مل من الدم).
4. إعداد الدم الكامل
- يستغرق 3 إلى 5ml من الدم الوريدي في أنبوب يحتوي على المواد الحافظة الخالية من الهيبارين.
- نقل الدم إلى أنبوب الصقر 50ml وتمييع مع حجم مساو من RPMI 1640 HEPES تحتوي على الجلوتامين و25mM (أي القلم / بكتيريا).
- 900μl قسامة من الدم المخفف في ثلاث نسخ في أنابيب بيجو معقمة في كل نقطة زمنية (6 أنابيب في المجموع : 3 و 3 ل0hrs 96hrs لإعداد أنابيب إضافية لtimepoints إضافية إذا لزم الأمر.
- 900μl قسامة المتوسطة Middlebrooks الثقافة 7H9 مع 10 ٪ ADC تكملة هيغروميسين 50μg/ml + (المتوسط تستخدم لنفس الثقافة BCG لوكس) في تكرار لعناصر النمو.
- إضافة 100μl من BCG المخفف لوكس على كل أنبوب من الدم ، وإلى السيطرة النمو 2أنابيب.
- تخلط جيدا ووضع bijous 3 ل96hr الوقت نقطة والضوابط النمو 2 في جانبهم في الحاضنة هزاز في 37 درجة مئوية ، و 20 دورة المحرك / دقيقة (CO 2 لا يلزم).
5. قياس التألق (في 0hr و96hrs)
- أجهزة الطرد المركزي في bijous 3 في 2000g لمدة 10 دقيقة.
- إزالة بعناية 300μl طاف من دون إزعاج بيليه ومكان في microtubes المسمار الحد الأقصى لتجميد 2ml في -80 درجة مئوية لمدة خلوى تحليل لاحقة.
- إضافة إلى برنامج تلفزيوني 300μl من كل بيجو ليحل محل حجم طاف إزالتها.
- نضح محتويات كل أنبوب أنيق في المقابلة الصقر 50ml وإضافة الماء المقطر 8ml لكل أنبوب. بدء الموقت لمدة 10 دقيقة.
ملحوظة : هذه هي خطوة حساسة للوقت ، وهذا الاحتضان يجب ألا يكون هناك أي أطول من 10 دقيقة ، بدءا من الخلايا عندما يأتي أولا في اتصال مع الماء. - شطف كل بيجو مع 2ml من الماء المقطر ، ودوامة لمدة 5 ثوان قبل التحول إلى أنبوب الصقر المقابلة.
- في نهاية الحضانة 10 دقيقة ، وأجهزة الطرد المركزي للأنابيب في 2000g الصقر لمدة 10 دقائق.
- صب طاف في مطهر Surfanios.
- إضافة إلى بعض الخرز الزجاجي كل بيليه والدوامة.
- إضافة 1ml من برنامج تلفزيوني العقيمة إلى كل أنبوب والدوامة.
- في أنابيب luminometer ، وجعل لكل التخفيفات 01:10 مكررة مع عينة في برنامج تلفزيوني (نموذج + 900μl 100μl PBS) وعلى 96hr الوقت نقطة. جعل التخفيفات نفسها لكل من عناصر التحكم النمو.
- دوامة بلطف الأنابيب وتحميل في luminometer واتخاذ قراءات (كما هو موضح أعلاه)
ملحوظة : قراءات بين triplicates من نفس العينة أن يكون في حدود 15 ٪ من بعضها البعض.
6. ممثل النتائج :
من المهم استخدام البكتيريا في مرحلة النمو اللوغاريتمي للفحوصات الدم لوكس كله ، ونمت أي ما يزيد على 48-72 ساعة قبل بتلقيح العينات ، والنشاط الأيضي هو الأمثل إذا إما مباشرة من خارج الثلاجة أو في مرحلة ثابتة. يجب أن تكون موحدة النمو السابقة لسلسلة من التجارب على 48 ساعة أو 72 إما لتجنب التقلبات. الشكل 1 يبين منحنى نمو ثقافة ممثل لوكس BCG. الوقت تضاعف حوالي 24 ساعة حتى يتم التوصل إلى مرحلة ثابتة.
رقم النمو الممثل 1. منحنى BCG لوكس أكثر من 96 ساعة في المتوسط وارتباط 7H9 RLU وكفو.
على الرغم من أن القيم RLU متطابقة دائما مع CFU ، يمكن لعدد من RLU المقابلة لCFU واحد تختلف عن الأسهم ، الذي هو السبب في ذلك هو ممارسة جيدة لاستخدام نفس الرصيد المجمد طوال سلسلة من التجارب لضمان تعدد ثابت من العدوى ( وزارة الداخلية).
ويبين الجدول 1 مثالا للتاريخ الخام في وقت التلقيح (T +0) وعلى 96 ساعة. وتحسب نسب النمو باستخدام صيغة T 96 / T 0 ، ولكن يمكن بالطبع فترات زمنية أخرى تقاس أيضا. هو عليه ، ومع ذلك ، ينصح بعدم استخدام الثقافات تتجاوز 96 ساعة ، وتحدث كبير موت الخلية.
الجدول 1. مثال على البيانات الخام في وقت التلقيح (T0) وعلى 96 ساعة (T96) ونسب النمو المحسوب من 3 المانحين الكبار.
اعتمادا على ردود محددة مستضد الذاكرة المتوفرة وعدد العدلات ربما أيضا ، ونسب النمو تختلف بين الأفراد ، كما هو موضح هنا في الشكل 2 في دم الأطفال الذين يعانون من فيروس نقص المناعة البشرية ، ودون انتقال العدوى. في المتوسط ، والأطفال الصغار قد نسب نمو أعلى من الكبار ، السلين اختبار الجلد (TST) + لقد الأفراد وانخفاض معدلات النمو من تجارة الرقيق عبر الأطلسي ، لقد الأفراد ، والمرضى المصابين بفيروس الإيدز ونسب نمو مرتفعة بسبب نقص السكان CD4 خلايا تي ، أحد الوسطاء الرئيسيين من الاستجابات المناعية الخلوية إلى متفطرات.
الشكل 2 التباين بين الجهات المانحة : نسب نمو T 0 مقابل 96 ساعة لمجموعة من المرضى ، وتبعا لحالة فيروس نقص المناعة البشرية الكامنة.
ويرد استنساخ نسب النمو خلال فترة من الزمن في الشكل 3 ، والذي يلخص نتائج من 64 دولة مانحة نزف مرتين خلال فترة 12 شهرا ومن متبرع واحد مرارا وتكرارا لتجارب نزف السيطرة. يمكن أن الأسباب المحتملة لتقلب تكون التغيرات في توعية بالمتفطرات أو التباين داخل مستويات السيتوكينات المضيفة ، كما لوحظ في العديد من اختبارات بيولوجية.
الشكل 3. (أ) واحدة من الجهات المانحة في 12 مناسبات على مدى 12 شهرا. (ب) متعددة (64) الجهات المانحة في 2 المناسبات على مدى 12 مonths.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هي راسخة المقايسات للجراثيم في سياق البحوث قاح السل في النماذج الحيوانية ، حيث يتم تطبيقها على الشاشة اللقاحات المرشحة اعدة. تخفيض الحمولة الجرثومية في وظائف الأجهزة المختلفة كما الرئيسي للقراءة من استمناع.
تم تصميم الجيل الأول من المقايسات جراثيم الضامة باستخدام الإنسان وحده ، مصابا M. السل. كما خدم CFU الرئيسي للقراءة من البقاء على قيد الحياة الفطرية بعد مرور فترة زمنية لا تقل عن 3 أسابيع. هذه المقايسا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل شخصية من الزمالات ويلكوم ترست لKampmann بياتي (056608 ، GRO77273).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الكاشف | شركة | القط لا | |
| BCG لوكس | مختلف | ن / أ | |
| Middlebrook 7H11 آغار | بيكتون ديكنسون | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 مرق | العلوم البيولوجية دينار بحريني | 271310 (500G) | |
| Middlebrook ADC تخصيب | العلوم البيولوجية دينار بحريني | 212352 | |
| Middlebrook OADC تكملة | بيكتون ديكنسون | 212240 | |
| توين 80 | سيغما الدريتش | 274364 | |
| الغليسيرول | سيغما الدريتش | G5150 | |
| هيغروميسين B | روش | 10843555001 (20ml) | |
| N - decyl ألدهيد | سيغما | D7384 - 100G | |
| الإيثانول (> 99،7 ٪) | VWR | 101077 | |
| معقمة PBS | في البيت | ن / أ | |
| RPMI - 1640 مع HEPES ، L - الجلوتامين 25mM | سيغما | R0883 | |
| ماء مقطر معقم | في البيت | ن / أ | |
| معدات | |||
| luminometer أنبوب (منفذ حقن إلزامي) | برتولد AutoLumat LB953 أو أحادية الأنبوب سيريوس luminometer | ||
| أنابيب Luminometer ، 12 × 75mm ، بيركس بدون شفة | كورنينج من VWR | 99445-12 | |
| قوارير مخروطي مع قبعات تنفيس ، معقمة البولي 250ml | كورنينج عبر فيشر العلمية | 2150329 | |
| دينار بحريني أنابيب جمع الدم Vacutainer (خالية من المواد الحافظة الهيبارين) | دينار بحريني | 367676 | |
| 50ml فالكون أنابيب مخروطية | دينار بحريني | 352077 | |
| 7ml Sterilin عينة أنابيب البولي بروبلين بيجو | VWR | 99445-12 | |
| Sterilin العالمي الحاويات (30 مل) | مختبر التحليل LTD | 128C | |
| الخرز الزجاجي 2mm وقطر | SigmaAldrich | Z143928 | |
| 10ML ماصات وصبي ماصة | أي | ||
| 1000μl 200μl وماصات ونصائح التصفية | أي | ||
| معدات المختبرات العامة : | |||
| السلامة من الدرجة الثانية لمجلس الوزراء مجلس الوزراء | |||
| وحدة التبريد (4 درجات مئوية) | |||
| الطرد المركزي | |||
| هزاز شاكر منصة (180 0) لخلط الأنابيب | |||
| مجموعة شاكر المداري الحاضنة عند درجة 37 ليشبون الثقافات البكتيرية |
المراجع
- Cheng, S. H., Walker, L. Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children. Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).
- Cheng, S. H., Walker, K. B. Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom. Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).
- Silver, R. F., Li, Q. Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions. Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).
- Hoft, D. F., Worku, S. Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity. J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).
- Worku, S., Hoft, D. F. Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth. Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).
- Kampmann, B., Gaora, P. O. Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria. J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).
- Cheon, S. H., Kampmann, B. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).
- Janulionis, E., Sofer, C. Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture. Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).
- Kampmann, B., Tena, G. N. Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines. Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).
- Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART. Aids. 20, 1011-1018 Forthcoming.
- Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria. Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
