يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

وسم الخلايا الجذعية مع Ferumoxytol ، وهو أوكسيد الحديد وافقت عليها الهيئة الجسيمات النانوية

21K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/3482

⸱

نوفمبر 4, 2011

 ,  ,  , 
1Department of Radiology, Molecular Imaging Program at Stanford (MIPS) , 2Stanford School of Medicine, Stanford University

في هذه المقالة

ملخص

وصفنا تقنية لوضع العلامات وتعقب الخلايا الجذعية مع ادارة الاغذية والعقاقير التي وافق عليها ، superparamagnetic أكسيد الحديد (سبيو) ، ferumoxytol (Feraheme). هذه التقنية التي تستخدم الخلوية التصوير بالرنين المغناطيسي (MR) التصوير عن التصور ، ويمكن الوصول بسهولة للرصد طويل الأجل وتشخيص ناجحة أو فاشلة engraftments الخلايا الجذعية في مرضى.

الملخص

تتمتع العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية بإمكانات كبيرة في مجال الطب التجديدي. ومع ذلك، لا يزال هناك الكثير مما يجب فهمه فيما يتعلق بحركية الخلايا المزروعة in vivo. ومن شأن وجود طريقة غير جراحية لمراقبة الخلايا الجذعية المزروعة بشكل متكرر in vivo أن يسمح للباحثين بمراقبة عمليات زرع الخلايا الجذعية بشكل مباشر وتحديد نتائج الغرس الناجحة أو غير الناجحة.

لا يزال يجري استقصاء مجموعة واسعة من الخلايا الجذعية من أجل تطبيقات لا حصر لها. يركز هذا البروتوكول على 3 مجموعات مختلفة من الخلايا الجذعية: خلايا الكلى الجنينية البشرية 293 (HEK293)، والخلايا الجذعية الميزنشيمية البشرية (hMSC)، والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS). تُشتق خلايا HEK 293 من خلايا الكلى الجنينية البشرية التي نَمَت في مستنبت مع الحمض النووي للفيروس الغدي 5 (adenovirus 5) المقصوص. وتُستخدم هذه الخلايا على نطاق واسع في الأبحاث لأنها سهلة الاستزراع، وتنمو بسرعة، ويتم ترانزفيكشنها (transfection) بسهولة. وتوجد خلايا hMSCs في نخاع العظام لدى البالغين، ويمكن تكرار هذه الخلايا كخلايا غير متمايزة مع الحفاظ على تعدد القدرات، أو القدرة على التمايز إلى عدد محدود من مصائر خلوية. ويمكن لخلايا hMSCs أن تتمايز إلى سلالات من الأنسجة الميزنشيمية، بما في ذلك الخلايا المكونة للعظم، والخلايا الدهنية، والخلايا الغضروفية، والأوتار، والعضلات، وسدى النخاع. أما خلايا iPS فهي خلايا بالغة تمت إعادة برمجتها جينياً لتُعبر عن جينات وعوامل مشابهة للخصائص المحددة للخلايا الجذعية الجنينية. وهذه الخلايا متعددة القدرات، مما يعني أنها تملك القدرة على التمايز إلى جميع السلالات الخلوية 1. وقد أظهرت كل من خلايا hMSCs وخلايا iPS قدرة على تجديد الأنسجة in-vivo.

لقد أثبت التصوير بالرنين المغناطيسي (MR) إلى جانب استخدام جزيئات أكسيد الحديد النانوية فائقة المغناطيسية (SPIO) كعلامات خلوية فعالية في تتبع الخلايا الجذعية in vivo، وذلك بفضل الدقة التشريحية القريبة من المجهرية، وعمر النصف الأطول في الدم الذي يسمح بالتصوير الطولي، والحساسية العالية للكشف عن الخلايا التي يوفرها تصوير الرنين المغناطيسي لجزيئات SPIO النانوية 2-4. بالإضافة إلى ذلك، فإن التصوير بالرنين المغناطيسي باستخدام SPIOs قابل للتطبيق سريرياً. تتكون SPIOs من نواة من أكسيد الحديد مع غلاف سطحي من الديكستران أو الكربوكسي ديكستران أو النشا يعمل على عزل نواة الحديد ذات التفاعل الحيوي عن مكونات البلازما. وتؤدي هذه العوامل إلى إحداث عدم تجانس في المجال المغناطيسي المحلي، مما يؤدي إلى انخفاض الإشارة في صور الرنين المغناطيسي الموزونة بالزمن T2 5. ولسوء الحظ، لم يعد يتم تصنيع SPIOs. ومع ذلك، توفر جزيئات SPIOs فائقة الصغر (USPIO) من الجيل الثاني بديلاً قابلاً للتطبيق. ويعد الفيروموكسيتول (FerahemeTM) أحد أنواع USPIO المكونة من نواة مغنتيت غير متكافئة محاطة بغلاف من بولي جلوكوز سوربيتول كاربوكسي ميثيل إيثر. يبلغ الحجم الغروي لجزيئات الفيروموكسيتول 17-30 nm كما تم تحديده بواسطة تشتت الضوء. ويبلغ الوزن الجزيئي 750 kDa، وثابت الاسترخاء عند مجال رنين مغناطيسي بقوة 2T هو 58.609 mM-1 sec-1 4. وقد اعتمدت إدارة الغذاء والدواء (FDA) مؤخراً الفيروموكسيتول كمكمل حديدي لعلاج نقص الحديد لدى المرضى الذين يعانون من الفشل الكلوي 6. وقد طبقت مجموعتنا هذا العامل في استخدام "خارج التسمية" لتطبيقات وسم الخلايا. وتظهر تقنيتنا وسماً فعالاً للخلايا الجذعية باستخدام الفيروموكسيتول، مما يؤدي إلى تأثيرات ملحوظة في إشارة الرنين المغناطيسي للخلايا الموّسمة على صور الرنين المغناطيسي. ويمكن تطبيق هذه التقنية للمراقبة غير الغازية لعلاجات الخلايا الجذعية في الإعدادات قبل السريرية والسريرية.

البروتوكول

1. اليوم 1

خلايا بلايت 1)

  1. hMSC وحة في قارورة T75 في confluency من 80 ٪ على الأقل 18-24 ساعة قبل وضع العلامات. الرجوع إلى الجدول رقم 1 للتعليم للسفن بديلة.

2. اليوم 2

2) إعداد حل التوسيم. وهذا إعداد تسمية واحدة (1) في دورق T75 confluency 80 ٪ مع تركيز 400 ميكروغرام الحديد / مل. الرجوع إلى الجدول رقم 1 للتعليم للسفن بديلة.

  1. ايجاد حل (الحل 1) عن طريق خلط 1 مل من مصل خالية من وسائل الإعلام و93.1 ميكرولتر من ferumoxytol (المخزون : 30 ملغ / مل) في أنبوب مخروطية 15 مل.
  2. إنشاء الحل الثاني (محلول 2) عن طريق خلط 1 مل من مصل خالية من وسائل الإعلام و 7 ميكرولتر من سلفات بروتامين (المخزون : 10 ملغ / مل) في أنبوب 15 مل المخروطية.
  3. السماح لكل حل لراحة لمدة 5 دقائق.
  4. إضافة حلول 1 و 2 معا. المزيج بلطف الحل العلامات الجديدة. يسمح الحل لراحة لمدة 5 دقائق للسماح للمحترفين USPIOالمجمعات سلفات لtamine النموذج.
  5. إضافة 5 مل من مصل خالية من وسائل الإعلام إلى 2 مل المختلطة سبيو / بروتامين حل سلفات عن الحجم النهائي من 7 مل.

3) إعداد الخلايا لوصفها

  1. نضح في وسائل الاعلام من الخلايا.
  2. يغسل مرة واحدة مع الخلايا بلطف 2-3 مل من قبل تحسنت مغ / كا خالية D - PBS أو وسائل الإعلام خالية من المصل لشطف بعيدا بروتينات مصل المتبقية وسائل الإعلام أو غيرها من المكونات التي يمكن أن تؤثر على النقيض عامل امتصاص والكفاءة التوسيم. نضح من السائل الشطف.

الخلايا تسمية 4)

  1. إضافة الكامل 7 مل من حل لوضع العلامات الخلايا.
  2. خلايا المكان الى حاضنة (37 ° / C 5 ٪ CO 2) وتسمح للخلايا لاحتضان في حل وضع العلامات لمدة 4 ساعات.
  3. إضافة 700 ميكرولتر من السفح إلى حل توسيم الخلايا لتحقيق تركيز المصل نهائي قدره 10 ٪. يضاف المصل إلى إعادة تهيئة البيئة المخصب الذي اعتادوا الخلايا ، والمساعدة في ميلnimizing موت الخلايا التي يمكن أن تنجم عن تحول مفاجئ إلى 24 ساعة من التعرض لبيئة خالية من المصل.
  4. السماح للخلايا لاحتضان مع الحل التوسيم لمدة 20 ساعة إضافية.

3. اليوم 3

5) إعداد الخلايا المسمى

  1. نضح الحل وسم من الخلايا.
  2. شطف الخلايا برفق مع 2-3 مل من قبل تحسنت مغ / كا خالية D PBS. نضح بها في برنامج تلفزيوني. من المهم استخدام مغ / كا خالية من برنامج تلفزيوني مثل المغنيسيوم والكالسيوم وسوف يضعف من كفاءة التربسين في الخطوة التالية.
  3. تتناول إضافة 2 مل من قبل التربسين تحسنت 0.05 ٪ إلى الخلايا والميل القارورة ذهابا وإيابا لضمان كامل سطح القارورة بطبقة رقيقة من التربسين. مكان الخلايا في حاضنة (37 ° / C 5 ٪ CO 2) وتسمح للخلايا للراحة لمدة 5-7 دقائق أو حتى الخلايا تبدأ في فصل من لوحة. قد يكون من الضروري لتأكيد انفصال تحت المجهر. اضغط برفق على جانبي القارورة اذا لزم الامر لكرة القدمcilitate سطح الخلية المفرزة.
  4. إضافة 4 مل من قبل وسائل الإعلام تحسنت الكامل إلى القارورة لتحييد التربسين. الشطف بلطف بواسطة قارورة pipetting والتربسين / وسائل الإعلام / حل الخلية صعودا وهبوطا عدة مرات. جمع الحل بأكمله في أنبوب مخروطية 15 مل. الحل الطرد المركزي في 400 خلية التعاون الإقليمي لمدة 5 دقائق.
  5. نضح بعناية وطاف دون الإخلال بيليه الخلية. Resuspend الخلايا في 5 مل من وسائل الإعلام (التي تحتوي على مصل أو مصل الحرة). الحل الطرد المركزي في 400 خلية التعاون الإقليمي لمدة 5 دقائق.
  6. تكرار غسل الخلية هو موضح في الخطوة 5.5. في المجموع ، سيتم تشطف الخلايا ثلاث مرات لإزالة المتبقية ، عامل تباين في وسائل الاعلام الحرة والموجودة على سطح الخلايا.
  7. عدد الخلايا في هذه المرحلة لبلوغ عدد الخلايا الأكثر دقة ، كما سيتم فقدان الخلايا أثناء الغسيل السابقة. إجراء اختبار جدوى من الخلايا. الخلايا هي الآن جاهزة للتحليل أو تطبيق اللاحقة والتجريبية. لا يمكن أن يؤديها MR التصوير مع T1 - W و T2 - W المعلمات ، لأنه على الرغم ferumoxytol هو عامل تباين T2 - W ، ferumoxytol المعروضات أيضا آثار T1. ممثل T2 - W المعلمات التصوير بالرنين المغناطيسي التي يمكن استخدامها للخلايا المسمى ferumoxytol صورة ما يلي : FSE أو SE_Multislice متواليات مع TR من 2000-2500 مللي والشركة المصرية للاتصالات (أ) من 60-80 مللي. للحصول على صورة T1 - W ، وانخفاض قيمة الشركة المصرية للاتصالات على FSE أو تسلسل SE_Multislice أو استخدام تسلسل GRE مع TR TE العالية والمنخفضة. الشكل 4 يوضح المحتملة في تطبيق الجسم الحي المسمى لوقف التصوير الخلية.

4. ممثل النتائج :

الخلايا المسمى إثبات تأثير كبير على النقيض سواد أو سلبية على صور الرنين المغناطيسي T2 المرجحة وتأثير إيجابي أو العكس اشراق على صور الرنين المغناطيسي T1 المرجحة (الشكل 2). يقوم السيد طولية التصوير واختبارات الجدوى 5 أيام الوسم آخر أظهرت عدم وجود إشارة MR كبيرة وليس لها تأثير كبير على قابلية مقارنة مع الضوابط غير المسماة (لا تظهر البيانات).

jove_content "> يمكن بعد ذلك الخلايا الجذعية إعتبر أن تكون متباينة في مختلف أنواع الخلايا أو الحقن في الوريد من أجل التحقيق في الجسم الحي.

الشكل 1
الشكل 1. تخطيطي زمني لوضع العلامات الخلايا الجذعية مع جسيمات متناهية الصغر أكسيد الحديد ، ferumoxytol.

الشكل 2
الشكل 2. صور الرنين المغناطيسي لسهمي أنابيب عبر المقاطع إيبندورف thrrough مع الخلايا في خلية بيليه. أ) غير إعتبر الضوابط. ب) خلايا إعتبر يدل على T2 كبيرة أو تأثير سلبي على النقيض من وكيل T2 المرجحة FSE SE_Multislice أو التصوير وكيل النقيض من T1 او ايجابيا تأثير على تسلسل GRE T1 المرجحة.

الشكل 3
الشكل 3. مقاطع عرضية من سهمي أنابيب إيبندورف مع الخلايا في خلية PELيتيح. ويمكن الكشف عن أقل قدر 10000 ferumoxytol الخلايا المسماة عبر التصوير بالرنين المغناطيسي T2 - W.

الشكل 4
الشكل 4. MR تصور ferumoxytol المسمى الخلايا الجذعية حقن الفئران البطينات الدماغية. أ) صورة MR المحورية ، من barin الفئران بدون حقن USPIO المسمى الخلايا الجذعية. B) المحورية ، C) الاكليلية و D) الصور المسيئة للالسهمي MR T2 ، تأثير سلبي على النقيض من USPIO المسمى الخلايا الجذعية (السهام البيضاء) حقن الفئران في الدماغ.

الجدول 1
adaptions الجدول الكمية 1. لوصفها الخلايا في الاوعية بديل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تحسين فعالية engraftments الخلايا الجذعية هو أمر حاسم لتطوير الطب التجديدي. وهناك تقنية التصور غير الغازية للخلايا الجذعية في الجسم الحي يعزز بشكل كبير من قدرتنا على فهم الآليات التي تؤدي إلى نتائج engraftment ناجحة. وسم المغناطيسي لرؤية MR ، مثل إجراء أننا أظهرنا ، ويسمح في الجسم الحي تتبع الخلايا الجذعية مع التصوير بالرنين المغناطيسي. الخلايا الجذعية المسمى مغناطيسيا سبق زرعها في الأنسجة المستهدفة ، وقد يصل إلى تصور أسابيع مع التصوير بالرنين المغناطيسي 7.<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

جميع المساهمين في هذه الدراسة لا تقدم الافصاحات.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعهد الوطني لالتهاب المفاصل والعضلات والعظام والأمراض الجلدية : 3R01AR054458 - 02S2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم الكاشف شركة فهرس العدد تعليق (اختياري)
D - MEM الجلوكوز السامية سيغما D5648 أو متوسطة قاعدة أخرى لوقف خط الخلية المطلوب ليتم استخدامها
D - PBS (كا + + ، المغنيسيوم + + الحرة) GIBCO 14190-144
التربسين - EDTA 0.05 ٪ Invitrogen 25300-120
الجنين مصل البقر (FBS) Hyclone SH30071.03

Ferumoxytol

(Feraheme)

AMAG 59338-0775-01
سلفات بروتامين APP فارم. 22930

المراجع

  1. Narsinh, K. H., Plews, J., Wu, J. C. Comparison of human induced pluripotent and embryonic stem cells: fraternal or identical twins? Mol Ther. 19, 635-638 (2011).
  2. Bulte, J. W. In vivo MRI cell tracking: clinical studies. AJR. Am. J. Roentgenol. 193, 314-325 (2009).
  3. Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging. J. Vis. Exp. (13), e685-e685 (2008).
  4. Tallheden, T., Nannmark, U., Lorentzon, M. In vivo MR imaging of magnetically labeled human embryonic stem cells. Life. Sci. 79, 999-1006 (2006).
  5. Jung, C. W., Jacobs, P. Physical and chemical properties of superparamagnetic iron oxide MR contrast agents: ferumoxides, ferumoxtran, ferumoxsil. Magn. Reson. Imaging. 13, 661-674 (1995).
  6. Coyne, D. W. Ferumoxytol for treatment of iron deficiency anemia in patients with chronic kidney disease. Expert. Opin. Pharmacother. 10, 2563-2568 (2009).
  7. Li, Z., Suzuki, Y., Huang, M. Comparison of reporter gene and iron particle labeling for tracking fate of human embryonic stem cells and differentiated endothelial cells in living subjects. Stem Cells. 26, 864-873 (2008).
  8. Metz, S., Bonaterra, G., Rudelius, M. Capacity of human monocytes to phagocytose approved iron oxide MR contrast agents in vitro. Eur. Radiol. 14, 1851-1858 (2004).
  9. Nedopil, A., Klenk, C., Kim, C. MR signal characteristics of viable and apoptotic human mesenchymal stem cells in matrix-associated stem cell implants for treatment of osteoarthritis. Invest. Radiol. 45, 634-640 (2010).
  10. Kraitchman, D. L., Heldman, A. W., Atalar, E. In vivo magnetic resonance imaging of mesenchymal stem cells in myocardial infarction. Circulation. 107, 2290-2293 (2003).
  11. Stuckey, D. J., Carr, C. A., Martin-Rendon, E. Iron particles for noninvasive monitoring of bone marrow stromal cell engraftment into, and isolation of viable engrafted donor cells from, the heart. Stem Cells. 24, 1968-1975 (2006).
  12. Henning, T. D., Sutton, E. J., Kim, A. The influence of ferucarbotran on the chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Contrast. Media. Mol. Imaging. 4, 165-173 (2009).
  13. Arbab, A. S., Yocum, G. T., Kalish, H. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104, 1217-1223 (2004).
  14. Nedopil, A. J., Mandrussow, L. G., Daldrup-Link, H. E. Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects. J. Vis. Exp. (38), e1793-e1793 (2010).
  15. Arbab, A. S., Yocum, G. T., Wilson, L. B. Comparison of transfection agents in forming complexes with ferumoxides, cell labeling efficiency, and cellular viability. Mol Imaging. 3, 24-32 (2004).
  16. Babic, M., Horak, D., Trchova, M. Poly(L-lysine)-modified iron oxide nanoparticles for stem cell labeling. Bioconjug Chem. 19, 740-750 (2008).
  17. Golovko, D. M., T, H. enning, Bauer, J. S. Accelerated stem cell labeling with ferucarbotran and protamine. Eur. Radiol. 20, 640-648 (2010).
  18. Lu, M., Cohen, M. H., Rieves, D. FDA report: Ferumoxytol for intravenous iron therapy in adult patients with chronic kidney disease. Am. J. Hematol. 85, 315-319 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

وسم الفيروموكسيتولتتبع الخلايا الجذعيةالتصوير بالرنين المغناطيسيالخلايا الجذعية الميزنكيمية البشريةجسيمات أكسيد الحديد النانويةبروتوكول وسم الخلاياالتصوير بالرنين المغناطيسي الموزون T2المراقبة داخل الجسمأكسيد الحديد الفائق المغناطيسيةتكوين معقد الجسيمات النانوية
وسم الخلايا الجذعية مع Ferumoxytol ، وهو أوكسيد الحديد وافقت عليها الهيئة الجسيمات النانوية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.