مقالة منهجية

وكشف ونشر استنساخ المعدية الجزيئية لفيروس ميثة-فيزنا أن تعرب عن بروتين الفلورية الخضراء

9.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/3483

⸱

أكتوبر 9, 2011

 , 
1Institute for Experimental Pathology, University of Iceland

في هذه المقالة

ملخص

وصفنا استنساخ الجزيئية لفيروس ميثة-فيزنا التي تعبر عن GFP والمعدية بالكامل. ويمكن الكشف عن هذا الفيروس من التكرار باستخدام المجهر مضان والتدفق الخلوي.

الملخص

ميثة-فيزنا فيروس (MVV) هو الفيروسة البطيئة من الأغنام، مما تسبب الالتهاب الرئوي الخلالي والتهاب الدماغ ببطء تدريجي 1. وتعتبر الخلايا الهدف الرئيسي من MVV في الجسم الحي لتكون من 2 نسب الوحيدات. وهناك سلالات معينة من MVV تكرار في أنواع الخلايا الأخرى، ولكن 3،4. البروتين الأخضر نيون هو علامة شائعة الاستخدام لدراسة lentiviruses في الخلايا الحية. أدرجت ونحن الجين EGFP في جين dUTPase من MVV. يتم حفظها بشكل جيد الجين dUTPase في معظم سلالات الفيروسة البطيئة من الأغنام والماعز ولقد ثبت أن تكون مهمة في تكرار CAEV 5. ومع ذلك، فقد تبين أن dUTPase الاستغناء عن تكرار استنساخ الجزيئي للMVV المستخدمة في هذه الدراسة سواء في التجارب المختبرية والحية 6. ويقتصر بدقة MVV النسخ المتماثل لخلايا المنشأ الأغنام أو الماعز. نستخدم خط الخلية الأولية من الضفيرة المشيمية من الأغنام (الخلايا SCP) لترنسفكأيشن ونشر الفيروس 7 </ سوب>. وMVV الفلورسنت هو المعدية بالكامل والتعبير EGFP وهو يستقر على مدار لا يقل عن 6 مقاطع 8. هناك علاقة جيدة بين قياسات TCID 50 و EGFP. يجب أن هذا الفيروس يكون من المفيد للكشف السريع عن الخلايا المصابة في دراسات الخلايا وtropism المرضية في التجارب المختبرية والحية 8.

البروتوكول

1. ترنسفكأيشن

يرد استنساخ الجزيئية في اثنين من البلازميدات، p8XSp5-EGFP وp67r، من 12 كيلو بايت وKB 4.5 على التوالي. 9،10

  1. خفض كميات متساوي المولية من البلازميدات اثنين، أي 4،4 ميكروغرام من EGFP-p8XSp5 و 1.6 ميكروغرام من p67r مع XbaI وligate قبل ترنسفكأيشن.
  2. لربط، استخدم 1 فايس حدة يغاز في رد فعل 50 ميكرولتر واحتضان عند 16 درجة مئوية خلال الليل.
  3. عند اكتمال الربط، ربط احتضان هذا المزيج في C ° 65 لمدة 15 دقيقة لتعطيل لليغاز. قد يتم حذف هذه الخطوة.
  4. قبل يومين ترنسفكأيشن، وبذور 10 6 خلايا SCP في قارورة T25 زراعة الأنسجة، والخلايا تنمو لمدة يومين في 5 مل + DMEM مصل الضأن 10٪ والجلوتامين 2MM دون المضادات الحيوية لأحادي الطبقة من 90٪ confluency. إذا كانت الخلايا لم تصل 90٪ confluency بعد يومين، وترك الخلايا لتنمو في يوم من الأيام إضافية.

ملاحظة: يمكن أن يكون المصل الحمل الغواصاتtituted بواسطة مصل بقري جنيني (FBS). نستخدم عادة لحم الضأن المصل، حيث يتم تثبيط بعض سلالات MVV بواسطة FBS، ولا يحول دون هذه السلالة MVV بواسطة FBS، ولكن.

  1. عندما الخلايا على استعداد لترنسفكأيشن، تغيير المتوسطة لDMEM مع المصل 1٪ (خروف أو مصل FBS) بدون المضادات الحيوية.
    نستخدم Lipofectamin 2000 (إينفيتروجن) لترنسفكأيشن.
  2. يخفف من الحمض النووي في وسط OPTI-MEM 500μl.
  3. تمييع 20μl Lipofectamin 2000 في المتوسط ​​OPTI-MEM 500μl وترك في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
  4. بعد 5 دقائق الحضانة، والجمع بين الحمض النووي المخفف مع Lipofectamine المخفف 2000 (الحجم الكلي = 1000 ميكرولتر). المزيج بلطف واحتضان لمدة 20-30 دقيقة في RT.
  5. إضافة مزيج ترنسفكأيشن (1 مل) إلى قارورة T25 التي تحتوي على الخلايا SCP والمتوسطة (5 مل). مزيج من هزاز بلطف.
  6. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 ليلة وضحاها (18 - 24 ساعة).
  7. تغيير المتوسطة في اليوم التالي لDMEM مع المصل 1٪، 2mm والجلوتامين،100IU البنسلين والستربتوميسين 100IU.
  8. رصد إنتاج الخلايا GFP في SCP بواسطة المجهر الفلورسنت مقلوب. ويمكن توقع انخفاض كفاءة ترنسفكأيشن مع هذه الخلايا الأولية، 5 عادة - 15٪.
  9. احتضان عند 37 درجة مزيد C، 5٪ CO 2 لعدة أيام للسماح انتشار الفيروس في القارورة. وعادة ما يستغرق 7-14 أيام للعدوى الكامل.
  10. حصاد الفيروس عن طريق aliquoting طاف في أنابيب إيبندورف. تدور في 3000 دورة في الدقيقة في microfuge لمدة 5 دقائق لإزالة الحطام الخلية. نقل طاف يحتوي على الفيروس إلى أنابيب جديدة. المحل في -80 درجة مئوية.

2. المعايرة من الفيروسات

  1. البذور 3x10 4 خلايا SCP في 100 ميكرولتر المتوسطة DMEM تستكمل مع 10٪ مصل، الجلوتامين 2MM، 100IU/ml البنسلين والستربتوميسين 100IU/ml، لكل بئر في لوحة 96 أيضا. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
  2. إذا كانت الخلايا متموجة في اليوم التالي، لتغيير المتوسطة DMEM مع المصل 1٪، 2mm والجلوتامين، البنسلين والستربتوميسين 100IU/ml 100IU/ml، 100 ميكرولتر في كل بئر.
  3. تمييع الفيروس على النحو التالي:
    1. اضافة 180 ميكرولتر مع المصل DMEM 1٪، 2mm والجلوتامين، البنسلين والستربتوميسين 100IU/ml 100IU/ml لكل بئر إلى 4 آبار في 10 × 96 لوحة جيدا أو أسفل الجولة V أسفل.
    2. لالتخفيفات مسلسل عشرة أضعاف في quadruplicate، إضافة 20 ميكرولتر من الفيروس إلى كل من 4wells في العمود الأول من لوحة، واستخدام ماصة أربع قنوات، ماصة صعودا وهبوطا لضمان خلطها بشكل تام العينات. تغيير نصائح ماصة ونقل 20 ميكرولتر إلى آبار 4 التالي وهكذا. ترك الآبار دون مشاركة الفيروس لعنصر تحكم سلبية.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من التخفيفات الفيروس إلى الخلايا SCP والمتوسطة.
  5. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. مراقبة لمضان GFP وآثار الاعتلال الخلوي لمدة أسبوعين.
    آثار الاعتلال الخلوي تتكون من خلايا تصبح مدورة وأقل شفافية من الخلايا الطبيعية ثإيث العمليات تمتد، وتنتهي مع خلايا متعدد النوى الظهور وموت الخلايا.
  6. حساب فيروس عيار (TCID50) باستخدام طريقة مونش ريد 11.

3. FACS تحليل الخلايا المصابة

ملاحظة: للحصول على الرصد السريع للتكرار الفيروس، يمكن فحص الخلايا المصابة بواسطة التدفق الخلوي.

  1. يعرض للتريبسين الخلايا المصابة (CA 10 5)، وغسل 1X PBS و resuspend مع PBS في 500μl.
  2. إضافة 500 ميكرولتر حل بارافورمالدهيد 4٪ (تركيز النهائي 2٪)، في احتضان RT لمدة 30 دقيقة.
  3. بيليه الخلايا في microfuge في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
  4. يغسل مع PBS 2X5 دقيقة وتحليل على تحليل FACScan. عد 10000 الأحداث.

4. ممثل النتائج:

يجب أن يكون هذا الفيروس المعدية بالكامل وتكرار لعيار من 10 يونيو - 10 يوليو TCID 50 / مل. الخلايا المصابة هي الفلورسنت ويمكن أن تكون ديتected بواسطة التدفق الخلوي والمجهري مضان. عادة، يمكن أن يتم الكشف عن GFP في أكثر من 60٪ من الخلايا في مزارع الخلايا المصابة باستخدام التدفق الخلوي (الشكل 1). وبالمثل، عندما تصور بواسطة المجهر مضان، فإن غالبية الخلايا هي الفلورسنت (الشكل 2A وB).

الشكل 1
الشكل 1. FACScan تحليل الخلايا SCP-المصابين KV1772 EGFP الفيروس بعد 7 أيام من العدوى.

الشكل 2
الرقم المقابل المرحلة 2. المجهري للخلايا SCP-المصابين KV1772 EGFP بعد 7 أيام من التحضين (A). تصور نفس الخلايا بواسطة المجهر مضان (B).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ينبغي أن GFP التعبير عن استنساخ الجزيئي للMVV المقدمة هنا تكون مفيدة لتحليل التفاعلات المضيف الخلية وتسببها MVV سواء في التجارب المختبرية والحية. اكتسب الفيروس تم الحصول عليها بعد 7-14 أيام من تكرار بعض الطفرات دون شك نظرا لعدم دقة الناسخ العكسي. ومع ذلك، هناك قيود على استخدام هذا استنساخ كناقل دورة واحدة. واحد هو أن يقتصر استخدام استنساخ لخلايا المنشأ الأغنام والماعز. كفاءة ترنسفكأيشن من هذه الخلايا باستخدام بناء لدينا هو فقط 5-15٪، واستخدام ناقلات pEGFP-N3 كفاءة ترنسفكأيشن هو 15...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق البحث الأيسلندية وجامعة أيسلندا صندوق البحث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة كتالوج رقم
DMEM Gibco 10938025
OPTI-MEM Gibco 51985018
Lipofectamine 2000 إينفيتروجن 11668019

المراجع

  1. Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).
  2. Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes. J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).
  3. Andresdottir, V. Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus. Virus Genes. 16, 281-293 (1998).
  4. Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence. Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).
  5. Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions. J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).
  6. Petursson, G. Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity. J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).
  7. Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. Cultivation of visna virus in tissue culture. Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).
  8. Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein. J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).
  9. Andresson, O. S. Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus. Virology. 193, 89-105 (1993).
  10. Skraban, R. Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype. J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).
  11. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
  12. Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity. Virology. 279, 116-129 (2001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

50

مقالات ذات صلة