نحن لشرح كيفية تشريح والثقافة الفرخ E4 العقدة statoacoustic E6 explants والحبل الشوكي. تستزرع Explants المصل تحت ظروف الأجواء الخالية من المواد الهلامية في الكولاجين 3D لمدة 24 ساعة. يتم اختبار Neurite الاستجابة مع النمو المتوسط عامل وتستكمل مع بروتين المغلفة الخرز.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تشريح العقدة والثقافة والفرخ Statoacoustic Explants النخاع الشوكي في الهلام الكولاجين لفحوصات ثمرة Neurite
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ومعصب الأجهزة الحسية في الأذن الداخلية الدجاج من العمليات المحيطية من العقدة statoacoustic (SAG) الخلايا العصبية. تعصيب الجهاز الحسي يعتمد على مزيج من العظة التوجيه محوار 1 و 2 بقاء العوامل تقع على طول مسار المحاوير المتزايد و / أو ضمن أهدافها الجهاز الحسي. على سبيل المثال ، ولدت مع وظيفية تدخل طريقا محوار توجيه الإشارات الكلاسيكية ، semaphorin - neuropilin ، misrouting من المحاور أذني 3. أيضا ، أعرب العديد من عوامل النمو في الأهداف الحسية في الأذن الداخلية ، بما في ذلك Neurotrophin - 3 (NT - 3) وعامل التغذية العصبية الدماغي المشتقة (BDNF) ، وقد تم التلاعب في الحيوانات المعدلة وراثيا ، مما أدى مرة أخرى إلى misrouting من المحاور SAG 4. هذه الجزيئات نفسه يعزز بقاء ونمو الخلايا العصبية neurite SAG الفرخ 5،6 في المختبر.
هنا ، نحن وصف وشرح الطريقة في المختبر ونحن حاليا شالغناء لاختبار مدى استجابة neurites SAG فرخ لبروتينات قابلة للذوبان ، بما في ذلك morphogens المعروفة مثل Wnts ، فضلا عن عوامل النمو التي تعتبر مهمة لتعزيز SAG ثمرة neurite وبقاء الخلايا العصبية. باستخدام هذا النظام النموذجي ، ونأمل في استخلاص استنتاجات بشأن الآثار التي يمكن أن يفرز يغاندس تمارس على بقاء الخلايا العصبية وثمرة neurite SAG.
يتم تشريح explants SAG يوم الجنينية 4 (E4) والمثقف في المواد الهلامية الكولاجين ثلاثي الأبعاد تحت ظروف خالية من المصل لمدة 24 ساعة. أولا ، يتم اختبار الاستجابة من جانب neurite explants زراعة المتوسطة البروتين تستكمل. ثم لنتساءل عما إذا كانت مصادر نقطة يغاندس يمكن أن يفرز تأثيرات على الاتجاه ثمرة neurite ، وشارك في explants مثقف مع بروتين المغلفة الخرز ويعاير لقدرة حبة لتعزيز محليا أو تحول دون ثمرة. نحن تشمل أيضا مظاهرة للتشريح (تعديل بروتوكول 7) وثقافة E6 explants الحبل الشوكي. نحنتستخدم بشكل روتيني explants النخاع الشوكي للتأكد من النشاط الحيوي للبروتينات والخرز البروتين غارقة ، والتحقق من الأنواع عبر التفاعل مع أنسجة الفرخ ، في ظل الظروف نفس ثقافة explants SAG. هذه المقايسات في المختبر لفحص مريحة بسرعة عن الجزيئات التي تمارس التغذية (بقاء) أو مدار (الاتجاه) التأثيرات على الخلايا العصبية SAG ، وخصوصا قبل تنفيذ الدراسات في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك ، وهذه الطريقة تسمح للاختبار الجزيئات الفردية بموجب المصل خالية من الشروط ، مع بقاء الخلايا العصبية ارتفاع 8.
البروتوكول
وصفات
فرخ قارعو الأجراس
| 7.2 ز | كلوريد الصوديوم |
| ز 0.23 | CaCl 2 + 2H 2 O |
| ز 0.37 | بوكل |
| 0،115 ز | غ هبو 2 4 |
| 900 مل | المياه (الصف الأنسجة الثقافة) |
ملاحظة : ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. يصل حجم النهائي الى 1000 مل من الماء.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نقدم طريقة لتشريح والثقافة وE4 SAG E6 explants الحبل الشوكي ، من الحمص ، في ظل ظروف الأجواء الخالية من المصل. ويجري حاليا استخدام هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الآثار المترتبة على مختلف يغاندس يفرز على بقاء الخلايا العصبية وثمرة neurite SAG. الرواية جوانب من هذا البروتوكول بما في ذلك استخدام نظام المصل مجانا للexplants زراعة واستخدام الخرز غارقة في عوامل النمو لدراسة الآثار المترتبة على ثمرة neurite SAG. وقد وصفت طريقة مشابهة لحبة لنا عن الحبل الشوكي الفرخ 10. تقليديا ،.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة RO1DC002756 المنح ومؤسسة البحوث بوردو. نشكر دوريس وو وتشانغ فيسه للحصول على المشورة مع التجارب ورودني ماكفيل للمساعدة في الأرقام.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الكاشف | شركة | فهرس العدد | تعليق |
| معدات | |||
| تشريح المجهر | نستخدم M80 ايكا stereomicroscope مع brightfield قاعدة الإضاءة | ||
| الشريحة الأكثر دفئا | CS & E. | الكولاجين البلمرة | |
| بيضة دجاجة حاضنة | |||
| 37 درجة مئوية / 5 ٪ CO 2 ثقافة الخلية الحاضنة ترطيب | |||
| تشريح مواد | |||
| وSylgardنسخة ؛ المغلفة طبق بتري | |||
| 24 لوحة جيدا خلية ثقافة | كورنينج | 3526 | |
| # 5 دومون ملقط | أدوات العلوم غرامة | 11252-30 | |
| # 55 دومون ملقط | أدوات العلوم غرامة | 11295-51 | |
| الفولاذ المقاوم للصدأ المسامير تشريح | أدوات العلوم غرامة | 26002-10 | يعلق الجنين ، تشريح غرامة |
| موريا ملعقة مثقوبة | أدوات العلوم غرامة | 10370-17 | حصاد جنين / نقل |
| 200 ميكروليتر الماصة الفم واسعة نصائح | المؤتمر الوطني العراقي نقطة العلمية | 118 96R | نقل يزدرع |
| E4 وبيض الدجاج E6 | & ملاحظة :س ؛ | ||
| فرخ رينغر الحل | جنين الحصاد | ||
| HBSS | سيغما | H8264 | تشريح SAG |
| L15 المتوسطة | سيغما | L5520 | الحبل الشوكي المتوسطة تشريح |
| الجنين مصل العجل | اتلانتا البيولوجية | S11150 | الحبل الشوكي المتوسطة تشريح |
| Vannas مقص | العالم آلات دقيقة | 501778 | الحبل الشوكي تشريح |
| إعداد الكولاجين | |||
| الفئران الذيل نوع الكولاجين أنا | العلوم البيولوجية دينار بحريني | 354249 | يزدرع الثقافة |
| 10X PBS (العقيمة) | لنويtralize الكولاجين | ||
| 1N هيدروكسيد الصوديوم (العقيمة) | لتحييد الكولاجين | ||
| الماء المقطر (العقيمة) | لتحييد الكولاجين | ||
| أوراق مؤشر الرقم الهيدروجيني (6،0-8،1) | Whatman | 2629-990 | لفحص درجة الحموضة الكولاجين |
| أنابيب مخروطية 15 مل | المؤتمر الوطني العراقي نقطة العلمية | 818 - PG | |
| 500 ميكروليتر الماصة الفم واسعة نصائح | المؤتمر الوطني العراقي نقطة العلمية | 119 - R100 | لالكولاجين الماصة |
| يزدرع الثقافة | |||
| DMEM/F12 المتوسطة | سيغما | D8437 | يزدرع مستنبت |
| ITS +1 | سيغما | I2521 | تكملة المتوسطة |
| البنسلين الستربتوميسين | Invitrogen | 15140-122 | تكملة المتوسطة |
| CNTF (الجرذان) | سيغما | C3835 | تكملة المتوسطة |
| NT - 3 (الإنسان) | سيغما | N1905 | تكملة المتوسطة |
| تنقية الماوس Wnt5a | R & D أنظمة | 645 WN - 010 | |
| افى جل الخرز الأزرق هلام | بيو راد | 153-7302 | |
| المناعية | |||
| بارافورمالدهيد | سيغما | P6148 | تثبيت |
| برنامج تلفزيوني | يشطف | ||
| تريتون X - 100 | سيغما | T9284 | حظر حل |
| صوديومآزيد | سيغما | S8032 | حظر حل |
| مصل العجل | Invitrogen | 16170-078 | حظر حل |
| الفأر وحيدة النسيلة المضادة للIgG2b β تويولين الضد الثاني 1 + | سيغما | T8535 | أجسام الخلايا التسميات وneurites |
| ثر اليكسا 488 الماعز المضادة للجسم الفأر ب IgG2 | Invitrogen | A21141 | بالكشف عن الأجسام المضادة β تويولين |
| ملعقة صغيرة تفلون | VWR | 57949-033 | الإفراج عن المواد الهلامية الكولاجين بشكل جيد |
المراجع
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).
- Fritzsch, B. Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
