توصيف الكهربية من الاستجابات العصبية مهم لفهم وظائف المخ ولتوجيه وضع الأصباغ لتتبع مسار. ومع ذلك، يتم تنفيذ العديد من الدراسات على الحيوانات تخدير. لفهم وظائف الدماغ من دون تخدير، طورنا طريقة لتسجيل العقارات استجابة الخلايا العصبية وحقن الأصباغ في الماوس مستيقظا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إعداد الفأر استيقظ لتسجيل الردود العصبية وحقن الراسمات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
فمن المعروف أن التخدير يغير خصائص استجابة العصبية في مناطق مختلفة من الدماغ. 13. في النظام السمعي، يتم تغيير الخصائص الأساسية للاستجابة الخلايا العصبية الدماغ بما في ذلك الحد الأدنى، والنوعية تردد، وsidebands المثبطة في نواح هامة تحت التخدير 1-2. دفعت هذه الملاحظات فسيولوجي للبحث عن سبل لتسجيل واحدة من الخلايا العصبية من دون آثار تلوث من التخدير. وكان نتيجة واحدة استعدادا منزوع الدماغ، حيث كان مقطوع تماما الدماغ على مستوى المخ الأوسط 4. المآخذ على هذا الإعداد هي جراحة هائلة، والقضاء على النزول التوقعات من الدماغ الأمامي، وعدم القدرة على استخدام الحواس لدراسة هياكل فوق الدماغ المتوسط. وكانت استراتيجية مختلفة لزرع قطب كهربائي صفائف مزمن لتسجيل واحدة من الخلايا العصبية والتكتلات المتعددة الوحدات في حين يكون الحيوان مستيقظا و / أو التصرف 5،6 7-9 على الماوس 10-12. باستخدام هذه الطريقة، ونحن قادرون على إجراء التسجيلات الكهربية على مدى عدة أيام في الماوس unanesthetized. في نهاية جلسات تسجيل، يمكننا بعد ذلك حقن صبغة لإعادة بناء مواقف القطب ومواقع تسجيل أو حقن التتبع بحيث يمكن تحديد المسارات من وإلى مواضع تسجيل. هذا الأسلوب يسمح للعزل جيد التسجيلات عصبون واحد أكثر من عدة أيام من دون استخدام مواد التخدير.
البروتوكول
1. وجها لضبط النفس لمحة عامة
- لتجميع المصممة خصيصا وجها آخر، اضافة الى وجود 1/16 "الفولاذ المقاوم للصدأ لفة دبوس عموديا في حفرة حفرها في 3/32" قضبان الفولاذ المقاوم للصدأ لتشكيل الصليب. يجب أن قطعة العمودي للرئيس بعد أن يكون حوالي 20 ملم، وقطعة أفقي عبر حوالي 15 ملم. الاستفادة من واحدة من نهاية قضيب عمودي على قبول المسمار # 1-72. (الشكل 1).
- خلال عملية جراحية، وتسجيل، يتم تأمين وجها آخر في النحاس مبنية خصيصا أو شريط الألمنيوم المتصاعدة مع 1-72 # المسمار (الشكل 2). يجب أن قطعة طويلة من شريط تصاعد تكون حوالي 90 ملم طويلة و5-10 مم واسعة. وجها آخر يلائم قطع الأخدود في تمديد 15 ملم قبالة شريط طويل أن الزاوية عند 45 درجة. لمنع دوران الرأس، وcrosspiece ليعشعش وجها آخر في أخدود صغير في الجزء السفلي من شريط المتزايد.
- شريط المتصاعدة في تعلق بعد ذلك إلى كتلة الألومنيوم حسب الطلب المتصاعدك (الشكل 3). كتلة تصاعد ما يقرب من 30 ملم × 30 ملم × 25 ملم. وترد هذه الكتلة المتزايدة إلى micromanipulator بحيث يمكن لموقف ما بعد رئيس وضعت بدقة على طول خط الوسط وعلى Bregma. تتكون كتلة متزايدة من قطعتين المجهزة مع البراغي. وهناك قطع التدريجي في كتلة يسمح للشريط متزايدة لتنزلق في ويمكن تأمينها مع البراغي. شريط التركيب موازية لسطح الطاولة. أثناء التسجيل، تأمين شريط في إطار التجسيمي مخصصة (الشكل 4). تم تصميم stereotax لتركيب شريط في نفس الموقف في كتلة متزايدة خلال عملية جراحية. هذا الترتيب يضمن ودائما الماوس تكون محاذاة إلى الإطار التجسيمي عبر جلسات تجريبية.
- قطع قضيب التنغستن (قطر 0.010 ") لمدة حوالي 5 ملم، مع ما يقرب من 1 ملم عازمة على 45 درجة، وهذا قضيب بمثابة دبوس الأرض (الشكل 1).
2. التجسيمي آلignment عن حج القحف
ملاحظة: جميع الإجراءات المبينة أدناه متابعة مستوى التقنيات الجراحية العقيم وتمت الموافقة من قبل لرعاية الحيوان جامعة ولاية واشنطن واللجنة الاستخدام والحيوان جنة الأخلاقيات في معهد جارفان.
- تخدير الماوس عن طريق وضع في غرفة مع تحريض 5٪ isoflurane. عدم وجود رد فعل على الذيل و / أو قرصة اصبع القدم يضمن أن الحيوان هو تخدير كامل.
- ضع الماوس في إطار القوارض التجسيمي تجهيزه مع محول الماوس (Stoelting). لتوجيه الماوس بشكل صحيح، ووضع أسنان داخل الحفرة من شريط لدغة وتشديد المشبك الأنف بحيث يتم دافئ. ضع الماوس كما مستقيم ممكن في شريط عضة ومشبك الأنف. تضع قناع الوجه المصنوع من قطعة من القفازات المطاطية فوق الأنف الماوس،، والحفاظ على isoflurane بنسبة 5٪ حتى سعر الماوس، تنفس هي حوالي 1 نسمة / ثانية. تحويل isoflurane إلى 1،5-2،0٪. تأمين رأس باستخدام تيانه الأذن الحانات والحرص على عدم ثقب في طبلة الأذن. يجب أن تكون قضبان دافئ ولكن ليس اختراق عميقا جدا في قنوات الأذن.
- وضع وسادة التدفئة تحت الماوس.
- تطبيق مرهم للعين لمنع العين من الجفاف.
- حلق فروة الرأس من بين الأذنين حتى عيون مع ماكينة حلاقة صغير أو مقص غرامة نقطة.
- تنظيف وتعقيم فروة الرأس بواسطة المسح مع الكلور وhexidine (أو betadine) فرك تليها الكحول شطف وكرر 3 مرات.
- لإزالة الجلد فوق الجزء العلوي من الجمجمة إجراء شق على طول خط الوسط من الجزء الخلفي من الرأس إلى العينين.
- كشط غشاء العظم على حواف الجرح مع مشرط. إذا اقتضى الأمر (وفقا للهدف التجريبية)، تراجع بعناية في الجهاز العضلي في الجزء الخلفي من الرقبة مع ملقط، مما يسمح للعضلة المسيل للدموع على طول كراسات للتقليل من النزيف. تطبق جلفوم تحت أنسجة فروة الرأس للحد من الرطوبة ومنع الجلد من التحرك عبر الجمجمة.
- جفاف مبلل سطح الجمجمة مع قضيب من القطن ذات الرؤوس مع ايزوبروبيل لتعزيز التصور من معالم الجمجمة.
- محاذاة الجمجمة لمعيار التجسيمي إحداثيات 13. اضافة الى وجود تحقيق غرامة نقطة في حامل قطب كهربائي، وإرفاقه micromanipulator التجسيمي. قضيب معدني شحذ يعمل بشكل جيد لهذا الغرض (شكل 5).
- استخدام نقطة لتحديد Bregma (الشكل 5A)، وامدا (الشكل 5B) على الجمجمة. تحرك لجنة التحقيق ذهابا وإيابا بين هذه النقاط، والتحقق من أن تنسيق الاطراف وسطي لكل موقع يختلف بأي حال من أكثر من 50 ميكرون. إعادة الرأس حسب الحاجة من خلال تخفيف بعناية الأذن الحانات، وتحول الرأس والأذن القضبان، أفقيا، وretightening الأذن القضبان.
- تحقق من أن ارتفاع ظهري، بطني في كل موقع يختلف بأي حال من أكثر من 50 ميكرون. ضبط ارتفاع المشبك الأنف، والتي سوف تدور في الجمجمة حول محور من القضبان الأذن،إلى مستوى أرض الملعب من الجمجمة إذا لزم الأمر. قد ارتفاع شريط الأذن تحتاج أيضا إلى تعديل.
- استخدام أطلس 13 لتحديد إحداثيات الهدف من مصلحة (الشكل 5C) نسبة إلى Bregma. بمناسبة الجمجمة فوق الهدف (على سبيل المثال، علامة "X" أو استخدام حبر الهند إلى الأركان الأربعة نقطة من مربع) حيث سيتم إجراء حج القحف (الشكل 5D).
3. وجها آخر والأرضي تركيب الدبوس
- استخدام هلام حفر لتنظيف الجمجمة. استخدام قضيب لتنظيف ونشر جل حفر على سطح (10 ثانية). تغسل مع المياه وتجف تماما. تطبيق التمهيدي للأسمنت الأسنان على سطح الجمجمة باستخدام قضيب. نشر لاصق مع قضيب جديد. علاج لاصق بمسدس ضوء الأشعة فوق البنفسجية (1 دورة).
- اختيار موقع للدبوس أرض الواقع هو ان القاصي إلى موقع الهدف. حملت بعناية ثقب صغير في الجمجمة باستخدام غيض من مشرط miniblade # 65 فقط بما فيه الكفاية واسعة في نهاية قصيرة من ع الارضفي الدخول ومستمدة من السحايا. يجب أن تكون موجهة دبوس أرض الواقع بحيث يتم الإشارة بعيدا عن Bregma ومستقبل وجها آخر (الشكل 6A).
- تأمين وجها آخر للشريط ومنع تصاعد ونعلق على micromanipulator. عن طريق تحريك micromanipulator في ثلاثة أبعاد، وضع وجها لآخر على مدى Bregma، مجرد لمس الجمجمة (الشكل 6B)، وقاعدة لمرحلة ما بعد رئيس وينبغي أن شقة تقع في الجمجمة.
- باستخدام مجسات تشريح، تطبق على كمية صغيرة من الاسمنت الأسنان حول مرحلة ما بعد رأس دبوس، والأرض (الشكل 6C). اضغط على الاسمنت وصولا الى ضمان اتصالات جيدة مع الجمجمة. ملاحظة: لا تستخدم الأسمنت أكثر من اللازم أو أنها لن تتصلب بالتساوي. علاج الأسمنت بمسدس ضوء الأشعة فوق البنفسجية (3-4 دورات من زوايا متعددة).
- تطبيق المرحلة الثانية من الأسمنت، وبناء قاعدة حول مرحلة ما بعد رئيس وتغطي الأخاديد في مرحلة ما بعد رئيس (الشكل 6D).
4. حج القحف
- تحديد موقع علامة مرجعية حج القحف، والذي سيتم حجبه جزئيا التمهيدي. استخدام مشرط رقم 65 لإحياء مم 3 × 3 مم مربع حول هذا الموقع وتطبيق قطرة من يدوكائين للحد من الحساسية والحد من النزيف.
- جعل عشرات متعددة على كل جانب من مربع (ما يصل الى 10)، والحرص على عدم قطع طريق العظام وإلى الدماغ (الشكل 7A).
- مرة واحدة في رفرف العظام تصبح فضفاضة، واستخدام غيض من مشرط لابعاد عنه، وترك الأم الجافية سليمة (7B الشكل).
- تغطية بالشمع العظام.
5. بعد الجراحة
- إيقاف التخدير الغاز وإزالة الماوس من إطار التجسيمي.
- استخدم قضيب من القطن ذات الرؤوس لتطبيق يدوكائين مرهم حول الجلد تتعرض لأمات ضجة حول الجرح. استخدام آخر قضيب من القطن ذات الرؤوس لتطبيق Neosporin على الجلد عرضة للخطر. حقن كيتوبروفين (5 مغ / كغ IM أو الملكية الفكرية القائمة على تفضيل من الأطباء البيطريين IACUC الفردية) كمامسكن في مرحلة ما بعد الجراحة. وسوف يكون الفأر عموما والانتقال في غضون دقائق من وقف الغاز.
- مكان الماوس في قفص دافئ ورصد حتى انها مستعدة للعودة إلى السكن الحيوانية.
- يجب فحص الحيوان على الأقل مرة في اليوم الواحد بعد ان تعافى من عملية جراحية. مراقبة علامات الأكل الفقراء و / أو الشرب وسلوك فاتر. إذا اشتبه الألم، وتوفير كيتوبروفين كل 24 ساعة (الجرعة نفسها في نهاية مرحلة ما بعد الجراحة) حتى التخفيف. ويمكن تطبيقها محليا يدوكائين على الجرح إذا كان الحيوان المعني خدش أو تظهر علامات الانزعاج. الحيوانات استعادة عادة من عملية جراحية من دون مضاعفات أو ألم.
6. تسجيل وصبغ حقن
- انتظر على الأقل بعد يوم واحد وجها آخر لعملية جراحية قبل استخدام الماوس للتسجيلات.
- الفأر في مكان جهاز رغوة مصبوب تقييدي لجسم الفأر. وقد تم بالفعل الماوس تتكيف مع هذا الجهاز، مما يقلل من قلق لها. التكيف النموذجيةللتعامل مع الماوس كل يوم بعد الفطام ولمدة أسبوع تقريبا قبل الجراحة والتجارب، ضع الماوس في جهاز الرغوة لمدة 1-5 دقائق. تعليق الجهاز في إطار التجسيمي (الشكل 4).
- آمنة وجها آخر لشريط تصاعد مستمر، والذي هو ثابت الآن إلى الإطار التجسيمي (الشكل 4).
- الاتصال دبوس أرض الواقع مع سلك إنهاء مع كليلة 22-قياس الحقن طرف الإبرة.
- إزالة الشمع العظام خلال حج القحف. إزالة الجافية إذا لزم الأمر استخدام غيض من مشرط miniblade.
- دفع الكهربائي إلى موقع التجسيمي المناسب وبدء التسجيل (الشكل 8). للتسجيلات الكهربية فقط، ويمكن استخدام مجموعة متنوعة من الأقطاب الكهربائية. اختيار قطب كهربائي يعتمد على الموقع ونوع من التسجيلات المطلوبة. سيتم اختيار الكهربائي للتسجيلات الماوس مستيقظا يكون هو نفسه ما يستخدم الباحث في الماوس تخدير. للتسجيلات الكهربية مجتمعة معصبغ / التتبع الحقن، يتم استخدام القطب micropipette 10. يتم تعبئة micropipette مع الصبغة / التتبع من خيار بحيث يمكن أن تحقن iontophoretically في نهاية التجارب الكهربية. ويمكن أيضا أن تستخدم أقطاب Multibarrel بحيث يمكن إجراء المناورات الدوائية. هي التي شنت القطب multibarrel في الصعود إلى micropipette تسجيل واحد (الشكل 8). هذه التقنيات هي المعيار في الأدب، وهي لا تختلف عن تسجيلات تخدير مقابل مستيقظا.
- ويمكن إجراء التسجيلات لمدة 4-5 ساعات على مدى أيام متتالية 3-4.
- في نهاية الدورة تسجيل، ويمكن حقن الصبغة / التتبع. لأنه لا توجد مستقبلات الألم في الدماغ، وحقن iontophoretic من الصبغة أو التتبع في الدماغ من غير المرجح أن يسبب عدم الراحة. ومع ذلك، مرة واحدة وتتميز خصائص الاستجابة الكهربية في المنطقة حيث حقن يجب أن يصدر، يمكن للحيوان أن تكون مع تخدير و isofluraneأو الحقن. وهذا من شأنه القضاء على أي الأحاسيس المحتملة غير المرغوب فيها. لأن صبغ / التتبع هو بالفعل في micropipette، يمكن أن يؤدي تشغيل نشطة والارض من تسجيل الكهربية مجموعة المتابعة لمولد الحالية لحقن الصبغة iontophoretically / التتبع. استخدام البروتوكول المناسب لصبغ / التتبع في القطب. إزالة الحيوان من ضبط النفس وضبط النفس headpost الجسم والعودة إلى قفص وطنه.
- في نهاية التجربة، اتبع البروتوكول المناسب للقتل الرحيم ومعالجة الأنسجة لاستعادة موقع الحقن ووضع العلامات.
7. ممثل النتائج
تركيب ناجحة لمرحلة ما بعد رئيس يسمح للمجرب لتسجيل استجابات واحدة والمتعددة الوحدات من الماوس، unanesthetized مستيقظا خلال أيام عدة. نظام ضبط النفس يسمح للتسجيلات الكهربية مستقر واحدة من الخلايا العصبية في الدماغ. ممتاز العزلة من وحدات واحد قوي والاستجابات تييمكن تسجيل المنبهات يا من بنية الدماغ نفسه خلال عدة أيام، على سبيل المثال في أكيمة الماوس السفلي (الشكل 9A، يوم واحد؛ الشكل 9B، لمدة يومين). مع تثبيت الرأس آخر جيد، سيتم كل فأر الانحياز باستمرار إلى جهاز التجسيمي والتجسيمي الماوس أطلس، 13 مما أدى إلى توطين موثوق بها من نوى الدماغ خاصة. هذا التعريب موثوق يسمح لحقن الأصباغ واستشفاف في هياكل محددة بعد أيام تسجيل متعددة. على سبيل المثال، لتقييم تنازلي التوقعات من الدماغ المتوسط السمعي إلى الدماغ السمعية والمعقدة البيروكسيديز ديكستران أمين (تصور diaminobenzidine باستخدام كما chromagen) يمكن حقنها في أكيمة الماوس السفلي (الشكل رقم 10A) بعد تحديد الخصائص electrophysiologically استجابة الخلايا العصبية في موقع الحقن (في الشكل. 10A، وقد سجلت إحدى الخلايا العصبية مع أفضل تردد من 51 كيلو هرتز)، وبعد معالجة الأنسجة، وهويمكن أن يتم وضع العلامات nterograde في نواة المقابل القوقعة الظهرية تصور وتآمر (الشكل رقم 10B). ويمكن أيضا Photomicrographs في دقة أعلى يمكن الحصول عليها لعرض المحاور المسمى anterogradely والمحطات (الشكل رقم 10C).
الشكل 1.
الشكل 2.
الشكل 3.
الشكل 4.
الشكل 5.
الشكل (6).
الشكل 7.
الرقم 8.
الشكل 9.
الرقم 10.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في الاستفادة من نظام ضبط النفس وجها لآخر للتجارب الكهربية وتشريحي عصبي في الفأر هو أن يمكن إجراء تجارب على الفئران، unanesthetized مستيقظا، والقضاء على احتمال تلوث استجابة بسبب أدوية التخدير. وبالإضافة إلى ذلك، مجموعة يمكن أن تستخدم حتى خلال أيام عدة للسماح للاستخدام الحيواني أكثر كفاءة.
معظم مكونات لمرحلة ما بعد رئيس تتوفر الجاهزة. إلا وجها آخر، وجهاز التركيب هي حسب الطلب، على حد سواء من التي هي واضحة نسبيا لبنا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا ما يكشف.
شكر وتقدير
بدعم من منحة جبهة الخلاص الوطني 0920060، المعاهد الوطنية للصحة منح DC004395، NHMRC المنحة 1009482، مكتب نيو ساوث ويلز للعلوم والبحوث الطبية، وعتيق غارنيت ورودني وليامز مؤسسة النصب التذكاري.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
| حفر جل لتنظيف الجمجمة قبل الاسمنت الأسنان | هنري شين | 101-5396 | 12/pk مع المحاقن 1.2 مل |
| التمهيدي للأسمنت الأسنان | كير Optibond | 25881 | 8 مل زجاجة |
| لاصق على الاسمنت الأسنان | كير Optibond | 25882 | 8 مل زجاجة |
| تطبيقها على الاسمنت الأسنان | كير Optibond | 24680 | 200/pk |
| طب الأسنان للأسمنت | الكاريزما، هيراوس Kulzer | 66000085 | 4gm الحقنة العبوة الجديدة |
| التنغستن رود (دبوس الأرضي) | نظم AM | 717200 | 0،010 "قطر |
| ضوء الأشعة فوق البنفسجية المعالجة اقتصاد | هنري شين | CU-80 | |
| وجها آخر | بنيت في المنزل | ||
| تصاعد شريط | بنيت في المنزل | ||
| تصاعد كتلة | بنيت في المنزل | ||
| التجسيمي الإطار | ديفيد Kopf الآلات | 902 | |
| الماوس وحديثي الولادة محول الجرذ | Stoelting | 51625 | |
| Deltaphase الوسادة متساوي الحرارة | برينتري العلمية، المؤتمر الوطني العراقي. | 39DP |
المراجع
- Evans, E. F., Nelson, P. G. The responses of single neurones in the cochlear nucleus of the cat as a function of their location and the anaesthetic state. Exp. Brain Res. 17, 402-427 (1973).
- Joris, P. X. Response classes in the dorsal cochlear nucleus and its output tract in the chloralose-anesthetized cat. J. Neurosci. 18, 3955-3966 (1998).
- Populin, L. C. Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus. J. Neurosci. 25, 5903-5914 (2005).
- Young, E. D., Brownell, W. E. Responses to tones and noise of single cells in dorsal cochlear nucleus of unanesthetized cats. J. Neurophysiol. 39, 282-300 (1976).
- Donoghue, J. P. Contrasting properties of neurons in two parts of the primary motor cortex of the awake rat. Brain Res. , 333-3173 (1985).
- Westby, G. W., Wang, H. A floating microwire technique for multichannel chronic neural recording and stimulation in the awake freely moving rat. J. Neurosci. Methods. 76, 123-133 (1997).
- Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. Cortical neurons sensitive to combinations of information-bearing elements of biosonar signals in the mustache bat. Science. 200, 778-781 (1978).
- O'Neill, W. E., Suga, N. Target range-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat. Science. 203, 69-73 (1979).
- Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. Harmonic-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat. Science. 203, 270-274 (1979).
- Portfors, C. V., Felix, R. A. 2nd Spectral integration in the inferior colliculus of the CBA/CaJ mouse. Neuroscience. , 136-1159 (2005).
- Felix, R. A. 2nd, Portfors, C. V. Excitatory, inhibitory and facilitatory frequency response areas in the inferior colliculus of hearing impaired mice. Hear Res. 228, 212-229 (2007).
- Portfors, C. V., Jonson, K. G., Roberts, P. D. Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus. Neuroscience. 162, 486-500 (2009).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 3rd edn, Academic Press. NY. (2007).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
