A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
ونحن تصف إجراءات لإعداد وتسجيل الكهربية من شرائح المخ التي تحافظ على محور ظهري، بطني من القشرة المخية الأنفية الداخلية وسطي (MEC). لأن الترميز العصبية من موقع يتبع منظمة ظهري، بطني داخل مجمع الشرق الأوسط، هذه الإجراءات تسهيل التحقيق في الآليات الخلوية مهم للملاحة والذاكرة.
حساب في الدماغ تعتمد على الخلايا العصبية الاستجابة بشكل مناسب لمدخلاتها متشابك. الخلايا العصبية تختلف في تكملة وتوزيعها من القنوات الأيونية غشاء التي تحدد كيفية الرد على مدخلات متشابك. ومع ذلك، لا علاقة بين هذه الخصائص الخلوية وظيفة الخلايا العصبية في الحيوانات تتصرف مفهومة جيدا. نهج واحد لهذه المشكلة هو التحقيق في الدوائر العصبية التي نظمت الطوبوغرافي في موقف خرائط الخلايا العصبية الفردية على المعلومات التي ترميز أو الحسابات التي يقومون بها 1. التجارب باستخدام هذا النهج يقترح مبادئ للضبط ردود متشابك وراء ترميز المعلومات في الدوائر الحسي والمعرفي 2،3.
المنظمة الطبوغرافية من تمثيلات المكانية على طول محور ظهري، بطني من القشرة المخية الأنفية الداخلية وسطي (MEC) يوفر فرصة لإقامة علاقات بين الآليات الخلوية وحسابات أناmportant عن الإدراك المكاني. الخلايا العصبية في طبقة الثانية من MEC القوارض ترميز مكان باستخدام شبكة مثل اطلاق حقول 4-6. لالخلايا العصبية التي عثر عليها في مواقع ظهري في MEC المسافة بين الحقول اطلاق الفردية التي تشكل الشبكة هو بناء على امر من 30 سم، في حين لالخلايا العصبية في المواقف تدريجيا أكثر بطني هذه المسافة تزيد على أكثر من 1 م. وقد كشفت دراسات عدة خصائص الخلوية من الخلايا العصبية في طبقة الثانية من مجمع الشرق الأوسط الذي، مثل التباعد بين حقول شبكة اطلاق النار، كما تختلف وفقا لموقف ظهري، بطني بهم، مما يوحي بأن هذه الخصائص الخلوية مهمة لحساب المكانية 2،7-10.
نحن هنا وصف الإجراءات اللازمة لإعداد وتسجيل الكهربية من شرائح الدماغ التي تحافظ على مدى ظهري، بطني التحقيق MEC تمكين المنظمة من الخصائص الطبوغرافية البيوفيزيائية والتشريحي للخلايا العصبية زارة التعليم والعلوم. موقف ظهري، بطني من ن التي تم تحديدهاeurons نسبة إلى معالم تشريحية من الصعب تحديد بدقة مع البروتوكولات التي تستخدم شرائح أفقية من MEC 7،8،11،12، لأنه من الصعب تحديد نقاط مرجعية للموقع ظهري، بطني الدقيق للشريحة. إجراءات وصفنا تمكين قياس دقيق وثابت من موقع من الخلايا سجلت على طول محور ظهري، بطني من وزارة التعليم، فضلا عن التصور من التدرجات الجزيئية 2،10. وقد وضعت إجراءات للاستخدام مع الفئران (> 28 يوما)، ولقد استخدمت بنجاح على الفئران تصل إلى 1.5 سنة. ويمكن مع بعض التعديلات يمكن استخدامها مع الفئران الأصغر سنا أو أنواع القوارض الأخرى. وهناك نظام موحد لإعداد وقياس مساعدة التحقيق المنهجي من الخصائص الخلوية والدقيقة لهذه المنطقة.
1. مجاور للسهمي شريحة التحضير
1.1 تشريح خارج نصفي الكرة المخية
ينبغي لجميع التجارب على الحيوانات تتبع المراجعة الأخلاقية والأنظمة المحلية الوطنية. في حالة من التجارب وصفها هنا، عمل يتوافق مع الحيوانات المملكة المتحدة (إجراءات علمية) لعام 1986. نحن نستخدم بشكل روتيني التفكك عنق الرحم بدون مخدر إلى الموت ببطء الماوس قبل إزالة الدماغ. بدلا من ذلك يمكن أن يكون الماوس تخدير عضال، ولكن في هذه الحالة قد يكون من الضروري تحديد ما إذا كان الاختيار من مخدر يؤثر على خصائص الخلايا العصبية.
إزالة الدماغ من الماوس ومكان على الفور في البرد (4-8 درجة مئوية) خفض مصطنع السائل النخاعي (ACSF) (انظر الجدول رقم 1 للتركيبات الحل) انفجر من التشبع مع كربوجين (95٪ O 2، 5٪ CO 2).
بعد مدة أقصاها ثلاث دقائق، وإزالة بعناية الدماغ من جاوتينغ ACSF باستخدام ملعقة ووضعه برفق في وضع مستقيم (الجانب الظهري متجهة لأعلى) على ورقة التصفية التي تم ترطيبها مع ACSF القطع (الشكل 1A).
لتسهيل دقيق المتصاعدة من نصفي الكرة الأرضية، واستخدام شفرة حلاقة أو مشرط لإزالة أكبر قدر من المخيخ ممكن دون التأثير على وزارة التعليم (الموجود في أقصى الذيلية للمخ) وإزالة 3 منقاري للمخ بواسطة باجتزاء في الطائرة الاكليلية (الشكل 1B).
Hemisect الدماغ، مع الحرص على أن هذا الباب هو بالضبط على طول الطائرة العمودية من خط الوسط (الشكل 1C).
عودة نصفي الكرة الأرضية إلى ACSF فقاعات قطع لمدة دقيقة ونصف.
1.2 جبل نصفي الكرة الأرضية على vibratome
قبل تصاعد مستمر، وضمان أن يتم الزاوية طليعة النصل vibratome على 20 درجة من الأفقي (
مع الحرص على تقليل الأثر المادي، وإزالة كل من نصف الكرة ACSF القطع مع ملعقة وموقف بحيث سطحه وسطي يقوم على البسط ومداه ظهري يواجه نحو شفرة مشراح. حرك بلطف كل نصف الكرة الأرضية على الشريط من superglue، مع الحرص على التأكد من أن السطح وسطي من كل نصف الكرة موازية للقاعدة مشراح. لقد وجدنا أن للحصول على أفضل النتائج السطح الظهري من كل نصف الكرة الأرضية يجب أن تكون موازية لومواجهة شفرة vibratome (1D الشكل).
1.3 الصيانة من خلال إعداد تشريح
بعد تصاعد فورا غمر نصفي الكرة في ACSF القطع الباردة (4 - 8 درجة مئوية). المحافظة على درجة حرارةه وكربوجين التشبع في جميع أنحاء إجراء تشريح. إذا التبريد المباشر ومحتدما من الحل في دائرة القطع من غير العملي، تجديد دوريا الحل ACSF القطع في غرفة مع الطازجة والمبردة حل انفجر.
1.4 أقسام قص
باستخدام vibratome، وإزالة القشرة من نصفي الكرة الأرضية في المستوى السهمي حتى تتعرف على مدى معظم الجانبي للمجمع الشرق الأوسط (عادة ~ 1MM الأسفل من السطح الجانبي) (الشكل 1F).
بين التخفيضات رفع النصل vibratome يصل ~ 200 ميكرون لتجنب سحب نصل إلى أكثر من وإتلاف الأنسجة المكشوفة. قطع في وقت واحد 400 أقسام مجاور للسهمي ميكرون من نصفي الكرة الأرضية (إذا ان اصطف كما هو مبين في الشكل 1D انهما سوف تقطع في نفس الوقت) حتى يتم الوصول إلى حد وسطي من وزارة التعليم. ويمكن تحديد ذلك من خلال عدم وجود الفرقة بيضاء سميكة حول منحنى ventro-T من الذيليةهو قرن آمون (الكبسولة الخارجية)، وشكل غير محدب من حدودها منقاري والزاوي ظهراني الذيلية "زاوية". الشكل 1E يوضح مظهر التعميم من قرن آمون في الطائرة مجاور للسهمي الجانبي للمجمع الشرق الأوسط. أرقام 1F-G توضيح كيف الفروع داخل وزارة التعليم تظهر في مواقف الاطراف المختلفة وسطي عند تشريح. لاحظ أكثر تدريجيا على شكل حبة مظهر من قرن آمون في مواقف أكثر وسطي. كل نصف الكرة ينتج عادة اثنين أو ثلاثة من 400 ميكرون شرائح سميكة تحتوي على وزارة التعليم.
1.5 شرائح احتضان
بعد كل قطع فورا بعرض شرائح في ACSF معيار كربوجين المشبعة المحافظة في حمام مائي عند 35 درجة مئوية. السماح للشرائح لاحتضان في 35 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في ACSF بعد التشريح الكامل.
إزالة حامل شريحة من الحمام المائي ويستمر محتدما مع كربوجين في درجة حرارة الغرفة لمدة لترشرق 45 دقيقة.
2. تجربة مثال مجاور للسهمي شريحة
تجربة نموذجية باستخدام هذا الإعداد هو جعل التسجيلات الكهربية من الخلايا النجمية في الثانية طبقة من مجمع الشرق الأوسط.
علم البصريات تحسين 2،1
قبل التسجيل، تأكد من أن المكثف هو في التركيز على متن الطائرة شريحة (كوهلر إضاءة)، وتتركز في ظل تضخم مرتفع (على سبيل المثال 40X) هدف.
2.2 تحديد الخلايا التي تهم
استخدام التكبير المنخفض (مثل 4X) هدف لتحديد منطقة التسجيل التقريبية داخل وزارة التعليم (الشكل 2A-B). التحول إلى هدف تضخم عالية للتعرف على خلايا قابلة للحياة في هذه المنطقة (الشكل 2C-D).
كمثال على ذلك، ويتم تحديد بصريا المفترضة طبقة الثانية الخلايا النجمية التي شكلها بيضوي الشكل أو متعدد الأضلاع والتشعبات الأولية متعددة مع ديامي مماثلةثالثا، وعدم وجود قطرها واحد كبير تغصن قمي 2،13،14. ويتم تحديد موثوق بها على حافة الحدود الاول / الثاني طبقة، حيث أنها وفيرة، وغالبا ما تظهر في مجموعات صغيرة 2،9 (الشكل 2C-D). وينبغي أن أنواع الخلايا الأخرى، مثل interneurons والخلايا الهرمية أيضا أن تكون محددة.
ويمكن في هذه المرحلة أن أجريت تجارب، على سبيل المثال باستخدام خلية كاملة التصحيح، المشبك لتسجيل محتمل أو غشاء غشاء الخلايا العصبية التي تم تحديدها من الحالية، وأساليب الكهربائية أو optogenetic لتنشيط مدخلات متشابك على الخلايا العصبية المسجلة. يمكن التحقق من هوية الخلايا العصبية من الخصائص الكهربية من الخلايا العصبية وسجلت من قبل بما في ذلك التسميات فلوري في حل داخل الخلايا.
3. قياس الموقع على طول محور ظهراني بطني
3.1 موقع صورة من الاهتمام وشريحة المحيطة
لتحديد موقف من recorالخلايا العصبية دائرة التنمية الاقتصادية على طول محور ظهري، بطني، استخدم لأول مرة هدف تضخم منخفض على صورة المنطقة MEC من شريحة والمناطق المحيطة بها. في تحديد موقع اهتمام من قبل، على سبيل المثال، بما في ذلك القطب تسجيل في صورة (الشكل 3A) أو عن طريق تنحيه الحجاب الحاجز قزحية مجال لترك دائرة مشرق في جميع أنحاء الدولة من اهتمام في صورة مكررة. لتحديد مكان تسجيل داخل الصورة ويمكن بعد ذلك مكررة يتم فرضه على الصورة الأولية للموقع تسجيل والمناطق المحيطة بها (الشكل 3B). يصل الى 3 التكبير منخفضة منفصل (4X) قد يكون مطلوبا الصور لتغطية المنطقة من موقع تسجيل بطني من الحدود ظهري من وزارة التعليم. ويمكن بعد هذه الصور يمكن مخيط معا باستخدام صورة التلاعب برنامج لتقديم صورة التي يمكن أن تؤخذ قياسات المسافة من (الشكل 3). ويمكن إجراء مزيد من التحقق من هوية ومكان الخلايا العصبية في أعقاب تسجيل من قبل بما في ذلكغير نشط علامات مثل الأصباغ biocytin أو اليكسا ضمن حل داخل الخلايا وبعد ذلك باستخدام المعالجة المناسبة من النسيج بعد تسجيل 2.
3.2 تحديد الحدود ظهري من MEC
الحدود ظهري من مجمع الشرق الأوسط يوفر معلما مريحة يمكن من خلالها قياس ظهري، بطني موقف. ليست الحدود بطني من وزارة التعليم كذلك تعريف.
الشكل 4 يوضح كيفية معالم MEC الخلوية المحددة في شرائح الملون نيسل في المواقف الجانبية وسطي، مختلفة تظهر تحت إضاءة مدينة دبي للإنترنت.
الشكل 4 ويبين الحصين دائري الشكل (4 (ط)) وعدم وجود نتوء في parasubicular أنا طبقة (الشكل 4 (رابعا)) المرتبطة شرائح مجاور للسهمي تحتوي على القشرة المخية الأنفية الداخلية الجانبي (LEC).
الشكل 4 قبل الميلاد تظهر شرائح النموذجية التي تحتوي على الشرق الأوسطجيم الجزء الظهري من الظلام الظهري بارز منطقة الحدود الأنفية الداخلية / Parasubicular في شرائح ضوئية في مدينة دبي للإنترنت يحتوي على مساحة من parasubiculum. وكشفت بشكل واضح في منطقة parasubiculum بواسطة تلطيخ نيسل في الصور المقابلة في العمود (الثالث). الحدود الظهري لل(الأسهم السوداء في 4B و 4C العمود (IV)) MEC هو بطني لمجموعة من الخلايا parasubicular أن يبرز من بعيد إلى أنا طبقة (السهام الحمراء في 4B و 4C العمود (IV)).
المقارنة بين الأرقام والأعمدة 4B 4C (ثانيا) و (ج) يدل على أن الحدود ظهري من وزارة التعليم في الفروع نيسل يتوافق مع الموقع الذي هو بطني إلى حافة الظهرية من المنطقة المظلمة حدود الأنفية الداخلية / Parasubicular في شريحة مدينة دبي للإنترنت ( أسود سهام). ويمكن تقدير موقع من الحدود من مدينة دبي للإنترنت، والصور بالمقارنة مع الصور المرجعية (انظر أيضا المرجع 14). وسوف تحقق في المستقبل من الحدود MEC ظهري مع المؤشرات الجزيئية تحسين دقة هذا التقدير. نلاحظ ثاملطخة تي المقاطع المرجعية، والمقاطع التي يتم تجهيزها لتحديد المورفولوجية من الخلايا العصبية المسماة، قد تكون عرضة للانكماش كبير. المقارنة بين المسافات النسبية المطلقة على المعالم في مدينة دبي للإنترنت والمقاطع مرجع ذلك يتطلب أولا قياس وتصحيح للانكماش (انظر على سبيل المثال المرجع 2).
3.3 معايرة وقياس المسافات
لتسهيل قياس المسافة من السهل في الصور، واستخدام نفس هدف تضخم منخفض على صورة شبكة إشارة إلى إنشاء بكسل: مسافة نسبة التحويل. قياس المسافة بكسل من الحدود ظهري من وزارة التعليم إلى موقع الاهتمام على طول كفاف من وزارة التعليم باستخدام برنامج الرسومات وتحويلها إلى مسافة مسافة بكسل في ميكرومتر (الشكل 5A). إذا تم ملء الخلايا العصبية مع علامة مثل biocytin، ثم يمكن بعد ذلك مكان وجود الخلايا العصبية سجلت أيضا يمكن استردادها عن طريق المعالجة المناسبة (انظر على سبيل المثال المرجع 2).
4. Representative النتائج
5A الرقم يدل على سبيل المثال تضخم منخفضة (4X) صورة مركب من شريحة مجاور للسهمي بعد التسجيل، مع المواقع المسجلة من الخلايا العصبية وأدلة قياس فرضه. وتظهر تسجيلات من الخلايا النجمية ملحوظ ظهري وبطني في الشكل 5B. هذه التسجيلات تساعد على تحديد هوية الخلايا وتوضيح كيفية الخصائص الكهربائية من طبقة الخلايا النجمية MEC الثاني تختلف في مواقع ظهري وبطني.
الشكل 1. إعداد شرائح مجاور للسهمي. مبلل دماغ الجامعة يستريح مع الجانب الظهري متجهة لأعلى على الورق مرشح مع قطع ACSF. B C. Hemisected جاهزة للتركيب. شنت D نصفي الكرة الأرضية على قطاع الصمغ موازية لقطع حافة شفرة vibratome قبل الغطس في قطع ACSF والتقطيع. E المظهر من خلال قسم يتضمن LEC المظهر تشريح الإجراء بعد إزالة الأنسجة الجانبي وF لم الإنسي بما فيه الكفاية للحصول على شريحة معيار MEC مجاور للسهمي. من جزء "الوحشي" للمجمع الشرق الأوسط بعد إزالة مزيد من 400 ميكرون من الأنسجة (السطح هو 400 ميكرون وسطي إلى أن يظهر في . (F)) وقد تم قطع جزء من المظهر G "وسطي" للMEC بعد شريحة ميكرون 400 مجاور للسهمي الخطط مرحبا من EF تشير على التوالي معالم التشريحية، ج: المخيخ، L: الوحشي القشرة الشمية الداخلية (LEC)، م: الإنسي القشرة الشمية الداخلية (MEC)، ح: الحصين، البرتقالي: كبسولة خارجية، الزرقاء: الجسم الثفني، سماوي: التلفيف المسنن، غرامEEN: CA3 و CA1. ظهور حدود منقاري من قرن آمون في الشرائح التي تحتوي على LEC هو مقعر (السهم الأسود في H) في حين أنه في الشرائح التي تحتوي على وزارة التعليم فقط، على الحدود يمكن أن يكون خطي (السهم الأحمر في الأول) أو مقعر (السهم الأحمر في J). وقد تم الحصول على الأشكال التقريبية للمعالم التشريحية الملونة من الشروح في أطلس الدماغ ألين ( http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html ).
الشكل 2. تحديد MEC طبقة الخلايا الثاني تحت إضاءة مدينة دبي للإنترنت. صورة مثال مركب من الفقرة سهمي شريحة الدماغ في تكبير منخفضة (4X). وقد تمت مواءمة صور منفصلة ومزجه لإزالة الحواف اشغال والتظليل. مهم ح مناطق معالم الطريق: الحصين، م: MEC B المحاصيل من تضخم أدنى مستوى الفرد (4X) الذي يحتوي على صورة طبقة الثانية من مجمع الشرق الأوسط، كما مرئية شريط العمودي مظلم بالقرب من الحافة اليمنى C II طبقة MEC في تضخم عالية (. 40X) مع إضاءة مدينة دبي للإنترنت. الصورة هو مركب الانحياز ومزج من عدة صور. وكثيفة المركزية عمود 'من الخلايا طبقة الثانية. D صورة واحدة التكبير العالية مدينة دبي للإنترنت تظهر مجموعة من الخلايا النجمية صحي المفترضة وinterneurons الثانية في طبقة. كما هو موضح هنا، نجمي الخلايا غالبا ما تحدث في مجموعات على الحدود بين طبقة أنا / الثاني. تميل الخلايا الهرمية التي يمكن العثور عليها بالقرب من الحدود الثاني / الثالث طبقة. الخطوط المنقطة في AC بيان مدى دينار بحريني على التوالي. الحانات النطاق: في ميكرومتر 500 A و B، C في والتطوير 100 ميكرون.
الشكل 3 "SRC =" / files/ftp_upload/3802/3802fig3.jpg "/>
الشكل 3. قياس موقف ظهري، بطني من المواقع ذات الأهمية. والتكبير الانحياز منخفضة (4X) الصور التي تشمل كامل ظهراني بطني مدى MEC بين موقع الفائدة (والتي تمثلت في قمة القطب تسجيل)، والظلام منطقة الحدود الأنفية الداخلية / Parasubicular المعالم (التي تستخدم لتحديد الحدود ظهري وزارة التعليم والعلوم - انظر الشكل 4) (ب) كما هو الحال في ولكن بما في ذلك صورة متراكبة مع توقف أسفل حقل قزحية الحجاب الحاجز (مضافين مع انخفاض غموض) بدلا من القطب تسجيل للاحتفال موقع الفائدة.
الشكل 4. تقدير الحدود الظهري للMEC من صور مدينة دبي للإنترنت من شرائح مجاور للسهمي. AC أقسام مجاور للسهمي (الأفقي إلى وسطي) من القشرة المخية الأنفية الداخلية. أبواب مدينة دبي للإنترنت ونيسل هي هيئة التصنيع العسكري من مختلفه AC العمود (ط):.. شرائح مجاور للسهمي الجامع (400 ميكرون سميكة) (الانحياز والمركبات المخلوطة من تضخم منخفضة (4X) وصور) AC العمود (الثاني): عن قرب من القشرة المخية الأنفية الداخلية مع خاصية الظلام منطقة الحدود الأنفية الداخلية / Parasubicular في منطقة رأس كل صورة. AC العمود (ج) شرائح نيسل الملون (40 ميكرون سميكة) من ماوس مختلفة تتماشى مع الصور في ميلان (الثاني). أكثر قتامة، وطبقة كثيفة من الخلايا طبقة الثانية. المقارنة بين الأعمدة (الثاني) و (ج) يبين كيف أن الخلايا الملون نيسل تظهر في صور مدينة دبي للإنترنت AC العمود (الرابع): تفصيل من شرائح نيسل الملون. باء وجيم العمود (الرابع) وتشمل الخلايا من parasubiculum (الجزء الظهري من المنطقة المظلمة حدود الأنفية الداخلية / Parasubicular في الصور DIC) وخلايا من MEC ظهري. في B (الرابع) و (ج) (رابعا) التصحيح كبير ظهري من الخلايا parasubicular الذي يمتد في عمق طبقة أنا مرئيا بسهولة (الأسهم الحمراء). على حافة بطني من هذه البقع يتوافق مع بو ظهريrder من MEC (الأسهم السوداء). في A (الرابع) التصحيح parasubicular غائبة، مشيرا إلى أن شريحة غير الوحشي للغاية بالنسبة لمعيار مجاور للسهمي إعداد شريحة زارة التعليم والعلوم. في كل اللوحات، والسهام السوداء تشير إلى الحدود ظهري من وزارة التعليم. سهام رمادي تبين الحدود التقريبية بطني من وزارة التعليم.
الشكل 5. نتائج ممثل. جزء المخلوطة واقتصاص من الصورة في 3A الشكل. يشار إلى مواقف خلية ظهري وبطني خلية من الأزرق والأخضر الدوائر تملأ على التوالي. السهم الأسود يمثل الحدود المقدرة ظهري من وزارة التعليم بل وتمتد إلى الطبقات العميقة من قبل خط منقط أبيض. خط أبيض متين هو دليل يبين مسار كفاف على طول التي تم أخذ قياس بكسل من المسافة التي تفصلها عن الحدود الظهري للMEC إلى الخلية الموجودة البطني. مقياس شريط: 500 ميكرون B Electrop.وأشارت آثار hysiological من الخلايا في ألف من اليسار إلى اليمين - ردود دون العتبي إلى الخطوات الحالية المستخدمة لحساب مقاومة المدخلات، وارتفاعه ردا على خطوة كبيرة الايجابية الحالية، مسمار من التفصيل.
لا شيء للكشف.
ونحن تصف إجراءات لإعداد وتسجيل الكهربية من شرائح المخ التي تحافظ على محور ظهري، بطني من القشرة المخية الأنفية الداخلية وسطي (MEC). لأن الترميز العصبية من موقع يتبع منظمة ظهري، بطني داخل مجمع الشرق الأوسط، هذه الإجراءات تسهيل التحقيق في الآليات الخلوية مهم للملاحة والذاكرة.
ونحن نشكر التالية لدعمهم: الكومنولث للمنح الدراسية في المملكة المتحدة لجنة التمويل (HP)، EPSRC (HP)، BBSRC (الدولة الأولى بالرعاية)، والاتحاد الأوروبي ماري كوري عمليات (الدولة الأولى بالرعاية).
