مقالة منهجية

مضان-المجهري الفحص والجيل القادم التسلسل الجيني: أدوات مفيدة لتحديد الجينات المسؤولة عن النزاهة العضيم

DOI:

10.3791/3809

⸱

أبريل 13, 2012

 ,  , 
1DOE Plant Research Laboratory, Michigan State University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والسعي أساسية في بيولوجيا الخلية هو تحديد الآليات التي تكمن وراء هوية العضيات التي تجعل الخلايا حقيقية النواة. هنا نقترح طريقة لتحديد الجينات المسؤولة عن سلامة المورفولوجية والوظيفية من العضيات النباتية باستخدام المجهر مضان والأدوات التسلسل من الجيل التالي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول يصف مضان المجهر القائم على فحص الشتلات Arabidopsis ويصف كيفية تعيين الطفرات المتنحية التي تغير توزيع التحت خلوية من علامة محددة فلوري المفتاحية في مسار إفرازية. Arabidopsis هو نموذج قوي البيولوجية للدراسات الجينية بسبب حجم الجينوم، الوقت جيل، والمحافظة على الآليات الجزيئية بين الممالك. الصفيف التنميط الجيني كنهج لرسم خريطة للطفرة في بديل للطريقة التقليدية القائمة على المؤشرات الجزيئية هو مفيد لأنه هو أسرع نسبيا، ويمكن السماح لرسم الخرائط من المسوخ عدة في فترة زمنية قصيرة حقا. وتسمح هذه الطريقة في تحديد البروتينات التي يمكن أن تؤثر على سلامة أي عضية في النباتات. هنا، على سبيل المثال، فإننا نقترح على شاشة لخريطة الجينات مهمة لسلامة الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا). نهجنا، ومع ذلك، يمكن أن تمتد بسهولة إلى غيرها من عضيات الخلية النباتية(انظر على سبيل المثال 1،2)، وهكذا يمثل خطوة هامة نحو فهم الأسس الجزيئية التي تنظم الهياكل التحت خلوية أخرى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. EMS المعالجة

وmutagenized بذور thaliana Arabidopsis باستخدام وكيل المغير سلفونات الميثان الإيثيلي (EMS) 3،4، والتي يدفع إلى التغييرات C-إلى-T الجينوم مما أدى إلى G / C إلى T / A الطفرات 5-7.

  1. وزن البذور ز 0،8 Arabidopsis (~ 40000 البذور) التي تحمل علامة فلوري عضية (على وجه التحديد، في هذه الدراسة ssGFPHDEL (إشارة تسلسل GFP-HDEL رباعي البيبتيد) وقد استخدم بوصفه علامة ER).
  2. نقل البذور في انبو....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفها هنا لدينا متحد البؤر المجهري القائم على فحص لتحديد الطفرات endomembrane. ويمكن تمديد هذا النهج بسهولة إلى العضيات الأخرى في الخلية التي بعلامات محددة بروتين فلوري المتاحة. ويستند الشاشة على تحديد الطفرات التي تظهر توزيع الشاذة من علامة فلوري إما في العضية المستهدفة أو إلى العضيات التي لا يفترض أن تحتوي على علامة. على التوالي، وهذه المسوخ التي تمثل السكان في فيؤدى قدرة عضية إلى subcompartimentalize علامة أو المسوخ التي لا يمكن نقل من مكان لآخر بشكل صحيح علامة بين العضيات. خلا.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نعترف الدعم من جانب العلوم الكيميائية، علوم الأرض والعلوم البيولوجية شعبة، مكتب العلوم الأساسية للطاقة، ومكتب للعلوم، وزارة الطاقة الأميركية (عدد جائزة DE-FG02-91ER20021) والمؤسسة الوطنية للعلوم (MCB 0948584) (اف ب). نحن شاكرون لكارين بيرد السيدة لتحرير المخطوطة.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة فهرس العدد
Ethylmethane سلفونات سيغما M0880
هيدروكسيد الصوديوم JT بيكر 3722-05
Murashige سكوغ القاعدية المتوسطة ث gamborg الفيتامينات النباتية التكنولوجيا laboratorie M404
Phytagel سيغما P8169-1Kg
RNeasy مصغرة عدة QIAGEN 74104
سيد ورقة نبات الحمض النووي محض تنقية عدة Epicentre MPP92100
Bioprime نظام وضع العلامات الحمض النووي إينفيتروجن 18094-011
الكحول 200 دليل ديكان ابوراتوريز. 2716
NaOAc JT بيكر
ATH1 الجينات رقاقة Arabidopsisالجينوم مجموعة Affymetrix 900385
صقر أنابيب 50 مل كورنينج 430290
إيبندورف أنابيب 1.5 مل
مرشح ورقة 90mm Whatman 1001090
ميزان تحليلي Mettler توليدو AB54-S NA
Nutating (موجة) شاكر Heidolph polymax 1040 NA
نبذ إيبندورف 5417-R NA

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marti, L. A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway. The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).
  2. Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Arabidopsis SeedlingsFluorescence MicroscopyNext Generation SequencingOrganelle IntegrityEMS MutagenesisConfocal MicroscopyGene MappingSecretory PathwayEndoplasmic ReticulumArray Genotyping

مقالات ذات صلة