مقالة منهجية

تحديد عدد خلايا الثدييات، وحجم الخلية والصحة الخلية باستخدام Z Moxi خلية الآلي البسيطة عداد

28.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/3842

⸱

يونيو 21, 2012

 ,  ,  , 
1Orflo Technologies, 2University of Utah

في هذه المقالة

ملخص

ى Moxi مصغر عداد خلية الآلي أداة الرواية التي تجمع بين مبدأ كولتر مع براءة اختراع تكنولوجيا الاستشعار الأغشية الرقيقة وخوارزمية البرمجيات الاحتكارية لأداء التحجيم والفرز من طائفة واسعة من حجم الجزيئات، وكذلك لتحديد الصحة العامة للmonodisperse الثقافات خلايا الثدييات. هذا البروتوكول ويصف استخدام هذه الأداة لحساب وتقييم الصحة للثقافات الخلية.

الملخص

يُستخدم عد الجسيمات والخلايا في مجموعة متنوعة من التطبيقات، بما في ذلك المزارع الخلوية الروتينية، والتحاليل الدموية، والضوابط الصناعية1-5. وكان تطوير تقنية كولتر (Coulter technique) على يد والاس كولتر منذ أكثر من 50 عاماً بمثابة طفرة حاسمة في تقنيات عد الخلايا والجسيمات. تتضمن هذه التقنية تطبيق مجال كهربائي عبر فتحة بحجم الميكرون وتركيز الجسيمات الفردية هيدروديناميكياً عبر هذه الفتحة. ويؤدي انسداد الفتحة الناتج عن الجسيمات إلى تغيير ملموس في المعاوقة الكهربائية يمكن ربطه بشكل مباشر ودقيق بحجم أو حجم الخلية. وينبع الاعتراف بهذا النهج كمعيار مرجعي في عد الخلايا والجسيمات من الدقة والضبط الاستثنائيين في تحديد أحجام الجسيمات وأعدادها، خاصة عند مقارنته بالتقنيات اليدوية والقائمة على التصوير (دقة تصل إلى 98% في عدادات كولتر مقابل 75-80% في الأنظمة اليدوية والقائمة على الرؤية). ويمكن إرجاع ذلك إلى حقيقة أن تقنية كولتر، على عكس مناهج عد الخلايا القائمة على التصوير، تقوم بقياس حقيقي ثلاثي الأبعاد (3-D) للخلايا والجسيمات، مما يقلل بشكل كبير من تداخل العد الناتج عن الحطام والتكتل من خلال حساب معلومات حجمية دقيقة عن الخلايا والجسيمات. وبشكل عام، يوفر هذا وسيلة لتعداد وتحديد أحجام الخلايا بطريقة أكثر دقة، وأقل رتابة، وأقل استهلاكاً للوقت، وأقل ذاتية من تقنيات العد الأخرى6.

على الرغم من بروز تقنية كولتر (Coulter) في عد الخلايا، فإن استخدامها الواسع في الدراسات البيولوجية الروتينية كان متعذراً بسبب تكلفة وحجم الأجهزة التقليدية. ومع أنه تم إنتاج جهاز يعتمد على مبدأ كولتر بتكلفة أقل، إلا أنه يعاني من قيود مقارنة بنظرائه الأكثر تكلفة في تصحيح "أحداث التطابق" (coincidence events)، والتي تمر فيها خليتان أو أكثر عبر الفتحة ويتم قياسهما في آن واحد. وثمة قيد آخر في تقنيات كولتر الحالية وهو نقص المقاييس المتعلقة بالحالة الصحية العامة لعينات الخلايا. وبناءً على ذلك، غالباً ما يجب استخدام تقنيات إضافية بالتزامن مع عد كولتر لتقييم حيوية الخلايا. وهذا يؤدي إلى إطالة وقت وتكلفة الإعداد التجريبي، نظراً لأن الطرق التقليدية لتقييم الحيوية تتطلب صبغ الخلايا و/أو استخدام معدات باهظة الثمن ومعقدة مثل مقياس التدفق الخلوي (flow cytometer).

يعد جهاز Moxi Z mini الآلي لعد الخلايا، الموصوف هنا، جهازاً مكتبياً صغير الحجم للغاية يجمع بين دقة مبدأ كولتر (Coulter Principle) وتقنية مستشعر الغشاء الرقيق لتمكين القياس الدقيق لحجم الجسيمات وعدّها في نطاق يتراوح من 3-25 ميكرون، وذلك اعتماداً على كاسيت عد الخلايا المستخدم. يمكن استخدام الكاسيت من النوع M لعد الجسيمات التي يتراوح متوسط أقطارها بين 4 - 25 ميكرون (النطاق الديناميكي 2 - 34 ميكرون)، بينما يمكن استخدام الكاسيت من النوع S لعد الجسيمات التي يتراوح متوسط قطرها بين 3 - 20 ميكرون (النطاق الديناميكي 2 - 26 ميكرون). وبما أن النظام يستخدم طريقة قياس حجمية، فإن نطاق 4-25 ميكرون يقابل نطاق حجم خلوي من 34 - 8,180 fL، ونطاق 3 - 20 ميكرون يقابل نطاق حجم خلوي من 14 - 4200 fL، وهو أمر ضروري عند قياس الجسيمات غير الكروية. ولإجراء عد الخلايا الثديية باستخدام جهاز Moxi Z، يتم أولاً تخفيف الخلايا المراد عدّها باستخدام ORFLO أو مخفف مماثل. ثم يتم إدخال كاسيت عد الخلايا في الجهاز، وتحميل العينة في منفذ الكاسيت. يتم سحب آلاف الخلايا في صف واحد عبر "منطقة استشعار الخلايا" (CSZ) في غشاء الرقيق على مدار 8-15 ثانية. وعقب انتهاء التشغيل، يستخدم الجهاز تقنية ملاءمة المنحنيات الحصرية بالتزامن مع خوارزمية برمجية مملوكة لتوفير تصحيح لأحداث التزامن، إلى جانب تقييم للصحة العامة للمزرعة الخلوية من خلال تحديد نسبة عدد الخلايا في المجموعة المستهدفة إلى العدد الإجمالي للجسيمات. وتشمل إجمالي أعداد الجسيمات الخلايا الميتة المنكمشة والمتكسرة، بالإضافة إلى الحطام والملوثات الأخرى. وتُعرض النتائج في شكل مخطط مدرج (histogram) مع ملاءمة تلقائية للمنحنى، مع بوابات يمكن ضبطها يدوياً حسب الحاجة.

في نهاية المطاف، يتيح جهاز Moxi Z إجراء عمليات العد بدقة وإحكام يضاهيان جهاز Coulter Z2، الذي يعد المعيار الذهبي الحالي، مع توفير معلومات إضافية حول صحة المزرعة الخلوية. علاوة على ذلك، يحقق هذا الجهاز هذه النتائج في وقت أقل، وبمساحة تشغيل أصغر، ومع سهولة أكبر بكثير في التشغيل والصيانة، وبجزء بسيط من تكلفة التقنيات المماثلة.

البروتوكول

1. تحضير العينات

  1. تمييع تعليق خلية مع مخفف ORFLO أو المخفف المناسب حتى يتسنى للتركيز خلية ضمن نطاق التشغيل وثيقة (3000 إلى 500000 خلية / مل لكاسيت نوع M، أو 3000 إلى 2500000 خلية / مل لكاسيت نوع S).
  2. ينصح التخفيف من 1:05 حتي 01:20 (نوع M كاسيت) أو أي تخفيف لتخفيف 01:05 (كاسيت نوع S) لخطوط الخلية معظم الثدييات، ولكن التخفيف الملائمة سيعتمد على نوع من الخلايا وكثافة البذر. حجم اللازمة لحصيلة اعدتها ودقة هو ما يقرب من 75 ميكرولتر.

2. تشغيل العينات

  1. تحويل Z Moxi عن طريق الضغط على زر الطاقة وسيتم عرضها على الشاشة الرئيسية.
  2. اضغط على الدرج إلى أسفل واضافة الى وجود كاسيت في Z. Moxi العينة 75μL الماصة ... وسيتم عرض الشاشة.
  3. ماصة عينة 75 ميكرولتر في منفذ التعبئة من كاسيت (بيضاوية اللون الأزرقوصفت 1 أو 2، استنادا إلى أي نهاية كاسيت تم إدراجها في الصك). هذه هي أشرطة القابل للتصرف، والتي يمكن استخدامها لمدة 2 الاختبارات. ملاحظة: مكان غيض ماصة مباشرة في التحميل بشكل جيد في ~ 45 درجة زاوية بحيث يتم القبض على طرف تحت الشفة الأمامية من البئر. عندما الاستغناء، فمن المهم ان لا فراغ "المضي قدما" لصرفها من السائل كما يمكن أن يسبب جيوب الهواء لإدخال كاسيت. فمن المستحسن أن يكون لها حبة صغيرة (حجم دخول أيضا) من السوائل على شكل جيد خلال الاستغناء.
  4. عد الخلايا لمعظم الثدييات، لمس الشاشة في أي مكان للبدء. عد للجسيمات صغيرة جدا (4 إلى 8 ميكرون متوسط ​​قطرها عن نوع M و 3-8 ميكرون القطر المتوسط ​​لنوع S)، ويمكن تشغيل Z Moxi في وضع الجسيمات الصغيرة. ملاحظة: تتم الإشارة إلى نوع الكاسيت في شريط أسود في أعلى الشاشة. في هذا الوضع، Moxi Z يحدد نطاق القطر إلى 2 إلى 10 ميكرومتر كما الافتراضي ويؤدي يو العدالغناء المعلمات الأمثل للكشف عن خلايا صغيرة. اضغط على زر صغير TOUCH هنا وضع الجسيمات (أسود مربع) لبدء اختبار وتشغيل في هذا الوضع.
  5. سوف Z Moxi بدء الاختبار ونتائج تعداد الخلايا سيكون كاملا في حوالي 8 ثوان (نوع M كاسيت) أو 15 ثانية (كاسيت نوع S).
  6. ومنحنى المناسب والحسابات MVI تبدأ تلقائيا وتتطلب سوى بضع ثوان إضافية. عندما تم العثور على صالح ومناسب، ثم على نتائج تلقائيا يتم عرضها على الشاشة.
  7. لجعل المحاصرة اكتساب الافتراضي الوضع، اضغط على زر المنحنى احتواء عدد للتبديل إلى وضع المحاصرة.
  8. ويمكن في هذه المرحلة تتم إزالة كاسيت من وحدة.

3. إدارة البيانات

  1. إذا التحجيم AutoMode هو خارج، يتم عرضها في البداية نتائج منحنى العد مناسبا على نطاق القطر من 2-34 ميكرون (نوع M كاسيت) أو μ 2-26م (كاسيت نوع S). إذا التحجيم Automode على، ثم سوف Z Moxi تلقائيا تحجيم المحور الأفقي (محور س) إلى النطاق الذي هو الأقرب إلى عرض من السكان منحنى مناسبا، مع ضمان يتم عرض كافة البيانات منحنى مناسبا.
  2. إذا التحجيم AutoMode هو خارج، لعرض النتائج يدويا بدقة أعلى، المس رمز 2-26 ميكرون (نوع M) أو رمز 2-18 ميكرون (نوع S). ملاحظة: تتم الإشارة إلى نوع كاسيت في المربع الأزرق في أعلى يسار الشاشة. ويوصي هذا عندما عد أصغر الخلايا أو الجزيئات لتحسين كل من قدرات منحنى العظام، فضلا عن قدرة المستخدم على التمييز بصريا الفروق الدقيقة للبيانات.
  3. على زيادة الدقة الأفقية، فإن زر التحجيم ضبط حيوي للسماح لسباق الدراجات بين النطاقات المتاحة على نطاق محور س: 2-34، 2-26، 2-18، 2-10 ميكرون وبالنسبة للنوع كاسيت M؛ أو 2 -26، 2-18، 2-10 ميكرون وللكاسيت من نوع S. هذه الميزة عن توافر فقطبلي مباشرة في أعقاب عدد خلايا.
  4. يتم عرض معلومات إحصاء (خلية / مل) لصالح منحنى أو منطقة مسور في مربع أسود تحت الجانب الأيسر من الرسم البياني. يتم عرض المعلومات يعني حجم الخلية في مربع أسود تحت الجانب الأيمن من الرسم البياني.
  5. يتم عرض القيمة MVI مربع أزرق في الجانب الأيمن العلوي من الرسم البياني. إذا تم تشغيل في وضع اختبار الجسيمات الصغيرة، وMVI لا ينطبق وسيتم عرضها على أنها "MVI = SPM". بالإضافة إلى ذلك إذا كان تركيز خلايا هو خارج نطاق التشغيل MVI، رسالة من "= MVI خارج النطاق" يتم عرض.
  6. لحفظ الرسم البياني الحالي، المس رمز تم. هذا يحفظ البيانات مع اسم "XXX اختبار" حيث XXX هو عدد اختبار المقابلة.
  7. على بوابة يدويا الرسم البياني، تلمس لتبديل العد صالح منحنى نتائج زر. وهذا يجعل المحاصرة وضع اكتساب الافتراضي. ثم مرر كل علامة النابضة أزرق لتعيين غيتس أو الاستفادة من الالأسهم ه اليسار واليمين (وهذه تظهر عند لمس علامة النابضة الأزرق) لإجراء تعديلات بوابة غرامة يتم عد الخلايا بين العلامات. يتم تحجيم تلقائيا مقياس رسم بياني عمودي على أساس السعة سكان منحنى مناسبا. لضبط هذا المقياس العمودي، انتقد الشاشة صعودا أو هبوطا في منطقة المدرج.
  8. تلمس طريق بوابة زر عدد النتائج للعودة إلى وضع العرض مناسبا منحنى وجعل وضع منحنى تناسب طريقة اكتساب الافتراضي.
  9. ثم اضغط على رمز تم لحفظ النتائج والعودة إلى الشاشة الرئيسية. لحذف النتائج، اضغط على أيقونة الحذف في أي وقت لحذف بشكل دائم على نتائج الاختبار.

4. تحليل البيانات التي حصل عليها سابقا

  1. لفتح اختبار المحفوظة، اضغط على أيقونة الرسم البياني على الشاشة الرئيسية.
  2. وسيتم عرض الرموز لتصل إلى تسعة رسوم بيانية المحفوظة على الشاشة.اضغط على أيقونة مناسبة لاختبار لمصلحة أو اضغط على أعلى الصفحة أو أسفل الصفحة الرموز لعرض نتائج أكثر الاختبار.
  3. وسيفتتح كل الرسم البياني في أي الكونت وضع المنحنى صالح أو عن طريق بوابة طريقة العد، اعتمادا على كيفية تم حفظه. في وضع إحصاء عن طريق بوابة، يمكن وضع علامات تبوب على النحو المرغوب فيه عن طريق تحريك كل علامة زرقاء المعزولة بشكل مستقل. بوابة السيارات عن طريق لمس في ذروة المطلوب. لمس للتبديل بين الكونت عن طريق بوابة وسائط المنحنى الكونت صالح.
  4. اضغط على الرموز بسهولة وUnzoom لضبط المقياس العمودي من الرسم البياني. ويمكن أيضا أن المقياس العمودي يمكن تغييرها عن طريق تمرير عموديا الاصبع على متابعة العرض (زيادة) أو أسفل (لخفض).
  5. اضغط على أيقونة الحذف لحذف بشكل دائم على نتائج الاختبار.
  6. اضغط على رمز تم لإغلاق نتائج الاختبار والعودة إلى الشاشة الرئيسية. (ملاحظة: لن يتم حفظ رأي التكبير.)

5. نقل البيانات إلى جهاز كمبيوتر

  1. ويمكن نقل البيانات إلى جهاز الكمبيوتر باستخدام تطبيق Moxichart Orflo أو نقل عن طريق USB عن طريق توصيل Z Moxi كبل USB إلى جهاز كمبيوتر شخصي أو ماكنتوش. لنقل بلوتوث (MoxiChart)، أولا تحديد رقم للوحدة بلوتوث عن طريق الضغط على أيقونة Bluetooth على الشاشة الرئيسية للوحدة Z Moxi.
  2. على الكمبيوتر، فتح التطبيق MoxiChart وانقر على أيقونة Bluetooth في الزاوية اليمنى العليا. ثم، واختيار الجهاز الذي يتوافق مع معرف بلوتوث للZ Moxi وحدد مجلد وجهة للملفات التي تم تحميلها.
  3. وسوف Moxichart تلقائيا نقل جميع الملفات إلى الدليل المحدد من خلال اتصال بلوتوث.
  4. يمكن فتح الملفات المنقولة بواسطة بلوتوث (MoxiChart)، أو عن طريق وanalyزيد مباشرة مع تطبيق MoxiChart أو لأن يتم تنسيق هم. ملفات CSV، يمكن فتحوا مباشرة في Microsoft Excel أو غيرها من برامج تحليل البيانات للتحليل وبالإضافة إلى ذلك / مخصص.

6. ممثل النتائج

لتقييم مدى دقة ودقة Z Moxi، تهم خلايا-293 كلوة الجنين البشري، خلايا هيلا، CHO-K1، الخميرة، Jurkat E6-1 الخلايا، PC12 الخلايا، ودقة معايرة تعليق خرزة بتركيزات تتراوح من 0-500،000 الخلايا احصي / مل (نوع M كاسيت) و 0-2-2.5e 6 خلية / مل (كاسيت نوع S) ومقارنة باستخدام Z2 كولتر وZ. Moxi تم الحصول على جميع خلايا الثدييات من مجموعة نوع الثقافة الأميركية (آي تي سي سي) ومثقف كما هو موضح سابقا 7-11. لفترة وجيزة، تم زرعها خلايا في تعليق في 75 مم 2 قوارير زراعة الأنسجة مع وسائل الإعلام الأساسية من RPMI 1640 (Jurkat E6-1، PC12)، وخلايا MEM (كلوة الجنين البشري-293، هيلا)، أو F12K (CHO-K1) الخلايا. واستكملت جميع وسائل الإعلام مع10٪ مصل بقري جنيني و 100 ميكروغرام يو الستربتوميسين penicillin/100. تمت المحافظة على القوارير في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. وpassaged خلايا كل 3 أيام. وقد تم التبرع خلايا الخميرة (X5، C. المبيضة البيضاء، فين 13) واستخدامها على الفور كما هو منصوص عليه. وأنشئت تركيزات عينة من خلايا أولية 500000 ~ / مل للبيانات نوع كاسيت M و ~ 2-2.5e 6 خلية / مل للكاسيت من نوع S باستخدام Z2 كولتر. وأعدت لاحق مستويات تركيز نظري من خلال مسلسل التخفيفات مع مخازن الفسيولوجية (Isoton الثاني أو الحل هانك في سولت المتوازن). في كل تركيز، تم قياس عينات مماثلة من قبل كل من نظم وتآمر بعضهم ضد البعض الآخر. كما رأينا في الشكل 2، وكان هناك ارتباط قوي الخطية (نوع M ص 2> 0.9886، نوع S ص 2> 0.9781) بين التهم لجميع العينات. وتمت مقارنة التركيزات أيضا إلى تركيز خلية المتوقعة / النظرية مع كلا Z Moxi وZ2 و( الشكل 3) وأظهرت مرة أخرى الارتباط الخطي قوية (نوع M ص 2> 0.9758، نوع S ص 2> 0.9774).

لتقييم الدقة، وأجريت كلوة الجنين البشري-293، وعدد خلايا هيلا باستخدام Z2 كولتر، Z Moxi، وعدادة الكريات أ. تم حساب متوسط ​​معامل الاختلاف (CV، ن = 19) من عدد الخلايا باستخدام Z Moxi (نوع M كاسيت)، Z2 كولتر وعدادة الكريات 1 مع انه يقاس السيرة الذاتية في الفترة من 5 تهم منفصلة في الخلايا 200،000-300،000 / المدى مل. الصغيرة متوسط ​​السيرة الذاتية (الشكل 4) من Z Moxi مشابه لذلك من Z2 وهو ممثل رفيع المستوى من الدقة يمكن تحقيقه فقط مع كولتر التكنولوجيات القائمة على الفرز.

وجرى تقييم دقيق التحجيم من الصك Z Moxi المقبلة من خلال قياس شراء الخرز الدقة، والبوليسترين ومعايرة. تم التخطيط متوسط ​​قياسات حجم الجسيمات (ن = 5) من Z Moxi ضد الأحجام وذكرت الشركة المصنعة. كما يمكن أن رأيتن الشكل (5)، والقياسات Z Moxi المتطابقة باستمرار القيم الصانع مع ارتباط خطي ارتفاع (ص 2 = 0.9989).

وراء حجم المعلومات والإحصاء، Moxi Z يوفر كاشف خالية، تقييم عام لخلايا الثدييات الصحة الثقافة مع مؤشر ذكرت الاستمرارية Moxi (MVI) قيمة. يتم إنشاء هذا المؤشر من نسبة عدد الخلايا في عدد السكان من المصالح فيما يتعلق بحساب مجموع الجسيمات. للتدليل على قدرات قياس MVI، وتمت مقارنة قراءات MVI (نوع M كاسيت) لدليل القياسية وتدفق cytometric تقنيات القياس الحي / الميت. تم إنشاؤها السكان من القتلى (<10٪ قابلة للحياة) كلوة الجنين البشري-293 و خلايا هيلا من خلال حضانات بين عشية وضحاها من الخلايا الحية في فلوريد الصوديوم خالية من المواد الغذائية، التي تحتوي على مادة التخفيف (Isoton الثاني، بيكمان كولتر) في 37 درجة مئوية. وأعدت للرقابة مستويات السلامة النظرية التي تركيزات خلط ratiometrically معروف من الخلايا الحية والميتة. الدقة وقد تم تحليل الحلول ulting لمستويات السلامة في تكرار مع التهم عدادة الكريات على حد سواء وقياسات تدفق عداد الكريات. أجريت قياسات عدادة الكريات باستخدام التقليدية 50/50 مزيج من 0.1٪ محلول أزرق التريبان والخلايا. أجريت قياسات التدفق الخلوي باستخدام اتفاقية الشراكة والتعاون الجوافة عداد الكريات (ميرك) باستخدام كاشف Viacount والصانع المحدد بروتوكول (ميرك). وكان معامل الارتباط بيرسون القيم (ص 2) "لصالح خطية من البيانات MVI إلى نسب مماثلة جدوى عدادة الكريات عن" خلايا كلوة الجنين البشري وخلايا هيلا كما هو مبين في الشكل 6، ص 2 = 0.9937 و 2 ر = 0.9728، على التوالي. هذه النتائج تثبت أن هذا النهج يوفر ثقافة المعلومات الصحية عبر طائفة واسعة من viabilities الخلية التي تقارن إيجابيا على مقاييس العيش / القتلى التي تم الحصول عليها باستخدام عداد الكريات تدفق أو عدادة الكريات.

الجداول والأشكال (من Dittami وآخرون، 2011). (15):

= "jove_content"> figure-protocol-1
الشكل 1. الأغشية الرقيقة كولتر الفرز: يتم تمرير التيار الكهربائي من خلال المنطقة خلية الاستشعار من كاسيت الأغشية الرقيقة. كما تدفق الخلايا ملف واحد من خلال CSZ، ويتم قياس الزيادات لحظة في الجهد من قبل Z. Moxi

figure-protocol-2
الشكل 2. Moxi التهم Z قابلة للمقارنة مع التهم Z2 كولتر. احصي تهم مماثلة من الايقاف الخلية وحبة باستخدام كل من Z2 كولتر وZ. Moxi متوسط ​​القيم العد (ن = 3-4) من التهم Z Moxi تم التخطيط فيما يتعلق وتم تحديد كولتر المقابلة Z2 التهم وR 2 قيم مناسبا خطي. A) كاسيت نوع M - مدى تركيز 0 - 500000 خلية / مل. B) كاسيت نوع S - مدى تركيز 0 - 2-2.5e 6 / البارات ml.Error تشير ± 1 الانحراف المعياري.

> figure-protocol-3
الشكل 3. قياسات تركيز Moxi Z نسب تملك تركيزات الخلية النظري. أعدت تركيز القيم النظرية من التخفيفات المسلسل من الخلايا الأولية 500000 / مل عينة B) نوع S كاسيت - - أ) كاسيت نوع M. أعدت قيم تركيز النظرية من التخفيفات المسلسل من 2 الأولي - 2.5e 6 خلية / مل عينة. أشرطة الخطأ تشير ± الانحراف المعياري 1.

figure-protocol-4
الشكل 4. معامل الاختلاف لZ2 كولتر، Moxi Z (نوع M كاسيت)، وعدادة الكريات. تم حساب معامل متوسط ​​تغير (السيرة الذاتية، ن = 19) من كلوة الجنين البشري-293، وعدد خلايا هيلا لكل نهج يقاس مع السيرة الذاتية في الفترة من 5 منفصلة اتهامات كلوة الجنين البشري-293 و خلايا هيلا في 200000 - 300000 خلية / مل نطاق. أشرطة الخطأ تشير ± الانحراف المعياري 1.

الحمار = "jove_content"> figure-protocol-5
الشكل 5. تقاس دقة القياسات حجم الجسيمات باستخدام Moxi Z-Z Moxi حجم حبة (نوع M كاسيت) ضد الشركة المصنعة وذكرت حجم حبة. أشرطة الخطأ تشير ± الانحراف المعياري 1.

figure-protocol-6
الشكل 6. ثقافة التقييم الصحي باستخدام MVI - مقارنة القياسات MVI (نوع M كاسيت) والجوافة جدوى Viacount PCA مقابل البصرية، التريبان الأزرق التهم جدوى الملون باستخدام عدادة الكريات.

المناقشة

تنفيذ الكامنة لا يمكن للنهج كولتر تكون حتمية وقابلة للدقة العامة للقياسات. وثمة مجال حاسم هو تصحيح لعدد الخلايا الخام "لأحداث من قبيل المصادفة" حيث اثنين أو أكثر من الخلايا في وقت واحد يمر من خلال فتحة ويتم قياسها كما حدث كهربائي واحد. "أحداث الصدفة" المساهمة في الخطأ والتي تختلف تبعا لعدد من العوامل بما في ذلك حجم الخلية ودرجة التجميع (ديفيس وآخرون 1967) 6. ونتيجة لذلك، لا يمكن للمصادفة المطلوبة لتصحيح أي عينة محددة يمكن التنبؤ بها، متفاوتة على نطاق واسع بين خلية / الجسيمات أنواع وحتى بين الثقافات المختلفة من أنواع الخلايا متطابقة. أنشأ نظرية، متجذرة في المنشورات الأولية التي كولتر، ينطوي على تطبيق تسوية لوغاريتمي من التهم الخام استنادا إلى عدد من الفعاليات لوحظ وتجريبيا والمحددة، عامل تصحيح الجسيمات محددة، ض. بينما يمكن تعداد دقيق يتحقق بشكل صحيح مع تيخوارزمية تصحيح له، هي محدودة في تطبيقه العملي نظرا لاختلافات كبيرة في القيم ض بين أنواع الخلايا، وصعوبة التنبؤ بدقة المقابلة في قيمته. هنا، وذلك باستخدام "الحقيقي" عدد الخلايا التي حددتها منحنى Moxi المناسب Z بالتزامن مع مصادفة خوارزمية تصحيح، وZ Moxi بتصحيح حيوي للصدفة لتحقيق تركيزات صحيح. أنتجت Z Moxi بالمقارنة مع النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام الراقية كولتر Z2، تهم مماثلة عبر مجموعة من تركيز 0 - 500000 خلية / مل (نوع M كاسيت) و 3،000 - 2-2.5e 6 خلية / مل (كاسيت نوع S) . علاوة على ذلك، Z Moxi يحقق هذا العدد مع دقة معامل منخفض مماثل من التباين في التهم والدقة في التحجيم الجسيمات التي هي سمة من معيار الذهب، كولتر، في أسلوب العد الخلية.

وعلاوة على ذلك، فإن البيانات المقدمة هنا تشير إلى أن Z Moxi يمكن أن توفر معلومات قيمةفيما يتعلق الصحة العامة للمزارع الخلايا. ى Moxi تعزز النهج منحنى المناسب مع خوارزمية البرمجيات الاحتكارية لتحديد هذا التقييم الصحة الثقافة. تغيرات شكلية المرتبطة موت الخلايا، مثل blebbing، تفكك، والتشوهات الحجمية (Kataoka وTsuruo 1996، Liegler وآخرون 1995، وشيريدان وآخرون 1981) 12-14، وجعل من الممكن للMoxi-Z لتمييز الفروق بين impedimetric ويعيش السكان والقتلى من السكان خلية / الحطام. يتم إنشاء MVI من خلال تحليل توزيع حجم ثقافة / جسيم لتحديد المساهمات النسبية للجسيمات الحطام، وخلايا نخرية منكمشة، ومنحنى المجهزة سكان الخلية من الفائدة. قيمة MVI يعكس بذلك مؤشر عدد السكان أو تدبير ratiometric من تعداد السكان monodisperse فيما يتعلق الشخصي الجسيمات إجمالي عدد السكان. هذه القيمة ثم حسابيا، تعديل الإحصاءات السكانية والملاحظات التجريبية. Becausه في MVI ينظر غيرها من المعالم من النهج تلطيخ التقليدية، وليس من المتوقع أن تعكس هذه التقنيات ولكنها توفر بدلا من وجهة نظر بديلة قيمة حول صحة ثقافة الخلية، وخاصة فيما يتعلق الحطام والملوثات الميكروبية.

وباختصار، فإن خلية مكافحة Moxi-Z هو متطرف صك الفوق الصغيرة التي توفر دقة والمقايسات استنساخه من عدد الخلايا، حجم الخلية، والصحة الخلية باستخدام مبدأ كولتر وخوارزميات البرمجيات منحنى تركيب جنبا إلى جنب مع التكنولوجيا على براءة اختراع جهاز استشعار الأغشية الرقيقة . مع نوع كاسيت M فهي قادرة على فرز جزيئات تتراوح 4-25 ميكرون في القطر (مجموعة ديناميكية من 2 - 34 ميكرون)، في 8 ثوان. مع كاسيت نوع S فهي قادرة على فرز جزيئات تتراوح بين 3 - 20 ميكرون في القطر (مجموعة ديناميكية من 2-26 ميكرون)، في 15 ثانية. علاوة على ذلك، Moxi-Z يؤدي التقييمات الصحية من دون استخدام الكواشف. انها اقل بكثير الأسواق العالمية ضغطها العملnsive والذاتية من الفرز اليدوي. بالمقارنة مع العد كولتر القياسية، وMoxi هو أسرع وأصغر بكثير، وتوفر المزيد من المعلومات، تتطلب صيانة أقل بكثير، من الأسهل للاستخدام، وجزء بسيط من التكلفة.

الإفصاحات

غريغوري M. Dittami وسعادة Ayliffe هم موظفون من تقنيات Orflo، وهي الشركة التي صممت وتصنيع وبيع وZ. Moxi ريتشارد D. Rabbitt توفر لجزء من الوقت، قام خبرة استشارية لتقنيات Orflo.

وترعى الإنتاج وحرية الوصول إلى هذه المقالة عن طريق تقنيات Orflo.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة فهرس العدد تعليقات
ORFLO مخفف ORFLO MXA006
كاسيت الصيدلي ORFLO مخازن تصل إلى 25 أشرطة عن إقامة مريحة
كبل USB ORFLO تربط أداة لماك / PC أو محول الكهرباء
محول الطاقة (الولايات المتحدة والاتحاد الأوروبي نماذج فقط) ORFLO يربط كابل USB إلى منفذ AC
محرك فلاش USB ORFLO مخازن موكسأنا Z البرمجيات ودليل المستخدم
الخرز معايرة تحقق ORFLO
الالكترونية معايرة كاسيت ORFLO الإلكترونية كاسيت للتحقق من نظام التشغيل السليم والمعايرة

المراجع

  1. Fernyhough, M. E., Helterline, D. L., Vierck, J. L., Hill, R. A., Dodson, M. V. Coulter counter use in the enumeration of muscle and fat stem cells. Methods. Cell. Sci. 25, 221-225 (2003).
  2. Blades, A. N., Flavell, H. C. Observations on the use of the Coulter model D electronic cell counter in clinical haematology. J. Clin. Pathol. 16, 158-163 (1963).
  3. Morris, T. M. Particle Size Analysis of Beer Solids using a Coulter Counter. J. Inst. Brew. 90, 162-166 (1984).
  4. Marth, E. H. Electronic Somatic Cell Counting Procedure. Standard Methods for the Examination of Dairy Products. , Amer. Publ. Health Assoc., Inc. 134-140 (1978).
  5. Parks, L. R., Jurbergs, K. A. Number and size distribution of particles in cellulosic solutions. J. Appl. Polym. Sci. 11, 193-199 (1960).
  6. Davis, R. E., Green, R. E. Automatic platelet counting with the Couler particle counter. J. Clin. Pathol. 20, 777-779 (1967).
  7. Dittami, G. D., Rabbitt, R. D. Electrically evoking and electrochemically resolving quantal release on a microchip. Lab on a Chip. 10, 30-35 (2010).
  8. Nahreini, P., Hanson, A., Prasad, K. High-yield production of recombinant antibody fragments in HEK-293 cells using sodium butyrate. BioTechiques. 34, 968-972 (2003).
  9. Escuyer, V., Collier, R. J. Anthrax Protective Antigen Interacts with a Specific Receptor on the surface of CHO-K1 Cells. Infection and Immunity. 59, 3381-3386 (1991).
  10. Isaacs, R. D. Borrelia bugdorferi bind to epithelial cell proteoglycans. J. Clin. Invest. 93, 809-819 (1994).
  11. Saito, Y., Takahashi, K. Characterization of selenoprotein P as a selenium supply protein. Eur. J. Biochem. 269, 5746-5751 (2002).
  12. Kataoka, S., Tsuruo, T. Physician Education: Apoptosis. Oncologist. 1, 399-401 (1996).
  13. Liegler, T. J., Hyun, W., Yen, T. S., Stites, D. P. Detection and quantification of live, apoptotic, and necrotic human peripheral lymphocytes by single-laser flow cytometry. Clin. Diagn. Lab Immunol. 2, 369-376 (1995).
  14. Sheridan, J. W., Bishop, C. J., Simmons, R. J. Biophysical and morphological correlates of kinetic change and death in a starved human melanoma cell line. J. Cell. Sci. 49, 119-137 (1981).
  15. Dittami, G. M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. ORFLO Moxi Z: Revolutionizing electronic cell count accuracy and cell viability estimates through curve fitting. Life Science Magazine, VWR International. , Forthcoming (2011).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تحديد عدد خلايا الثدييات، وحجم الخلية والصحة الخلية باستخدام Z Moxi خلية الآلي البسيطة عداد
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.