Electroantennographic الأحيائي كأداة فحص لمواد متطايرة النبات المضيف

ملخص

وهناك طريقة لالمتطايرة بسرعة شاشة محطة المضيفة عن طريق قياس الاستجابة الكهربية من orangeworm السرة الكبار ( Amyelois transitella) هوائيات لمكونات واحدة ويمزج عن طريق تحليل electroantennographic.

الملخص

المتطايرة مصنع تلعب دورا هاما في النبات والحشرات التفاعلات. الحشرات العاشبة استخدام المواد المتطايرة نبات، والمعروفة باسم kairomones، لتحديد موقع مصنع المضيفة. ^1،2 عند محطة المضيف مهم للتغذية السلع الزراعية ضرر الآفات الحشرية التي يمكن أن تسبب خسائر اقتصادية جسيمة للمزارعين. وفقا لذلك، يمكن استخدام kairomones كما جاذبة لإغراء أو الخلط بين هذه الحشرات، وبالتالي تقديم بديل صديقة للبيئة للمبيدات لمكافحة الحشرات. ³ لسوء الحظ، والنباتات يمكن أن تنبعث من المواد المتطايرة مع عدد كبير تركيبة مختلفة ونسب من الانبعاثات تعتمد على الفينولوجيا للسلعة أو الوقت من اليوم. هذا ما يجعل تحديد المكونات النشطة بيولوجيا، أو مزيج من المكونات المتطايرة عملية شاقة. للمساعدة في تحديد المكونات النشطة بيولوجيا من انبعاثات محطات المضيف المتقلبة التي نتبعها في مختبر فحص الأحيائي القائم على electroantennography (EAG). EAG هو أداة فعالة لتقييم وrecorد electrophysiologically ردود حاسة الشم من حشرة عبر مستقبلاتها antennal. لا يمكن للعملية الفرز EAG يساعد على التقليل من عدد من المواد المتطايرة اختبار لتحديد المكونات النشطة بيولوجيا واعدة. ومع ذلك، اختبارات بيولوجية EAG سوى تقديم المعلومات حول تنشيط المستقبلات. فإنه لا يوفر معلومات حول نوع من سلوك الحشرة مجمع مثير لل، التي يمكن أن تكون بمثابة نوع، جاذبة طارد أو غيرها من استجابة سلوكية. وتؤخذ عادة المتطايرة حصول على استجابة كبيرة من قبل EAG، نسبي للسيطرة على الإيجابية المناسبة، إلى مزيد من التجارب من الاستجابات السلوكية للآفات الحشرية. تصميم تجريبي سوف تعرض بالتفصيل المنهجية المتبعة لفحص اللوز المستندة إلى المواد المتطايرة النبات العائل ^4،5 بواسطة قياس ردود antennal الكهربية من شخص بالغ للآفات الحشرية orangeworm السرة (Amyelois transitella) لمكونات واحدة ويمزج بسيط من المكونات عبر EAG الأحيائي. ويستخدم الأسلوب 2 السابقينوضعت هوائيات cised عبر صاحب "شوكة" قطب كهربائي. بروتوكول تظاهر هنا يعرض السريع، والإنتاجية العالية لطريقة موحدة لفحص المواد المتطايرة. كل متقلب هو على المبلغ، ومجموعة ثابتة كما لتوحيد مستوى التحفيز، وبالتالي السماح للردود antennal أن تكون مؤشرا على chemoreceptivity نسبي. سيطرة سلبية تساعد على القضاء على الاستجابة الكهربية لكلا القوة المتبقية المذيبات والميكانيكية للنفخة. السيطرة الايجابية (في هذه اسيتوفينون سبيل المثال) هو مركب واحد التي كانت دافعا لاستجابة متسقة من الذكور والإناث فراشة السرة (الآن) orangeworm. معيار semiochemical الإضافية التي توفر استجابة متسقة ويستخدم للدراسات الأحيائي مع فراشة NOW الذكور (Z، Z) -11،13-hexdecadienal، مكونا الألدهيد من فرمون الإناث المنتجة. ^6-8

البروتوكول

1. إعداد مواد متطايرة كشفه من النبات المضيف لفحص EAG

1. بعد تحديد المناسبة والمصادقة على جميع المواد المتطايرة عبر GC-MS، نفذ تحليل EAG نفخة من كل متقلبة المتاحة. يمكن أن يكون الفحص الأولي لعدد تكرار منخفض من الردود antennal (N = 3-5) لكل من الجنسين من أجل تحقيق مؤشرا chemoreceptivity نسبي في فترة قصيرة من الزمن (الجدول 1).
2. يعد حل من كل تقلب في تركيز ملغ / 5 مل في البنتان. اغلاق محكم وبردت العينة حتى جاهزة للاستخدام الفوري (على سبيل المثال، اسيتوفينون، كثافة = 1،03 جم / مل، حجم = (0.005 g/1.03 غ / مل) × 1000 = 4.85 ميكرولتر من اسيتوفينون في قارورة 1.0 مل الحجمي وتمييع لل 1.0 مل مع البنتان).
3. قبيل تحليل EAG، وإزالة قارورة تحتوي على 5 ملغ / مل تركيز المواد المتطايرة لفحصها، والسماح لتسخين إلى درجة حرارة الغرفة. وفي الوقت نفسه، تسمية عدد مناسب من الماصات باستور إلىربط مع كل تقلب لفحصها، والتفاف قطعة صغيرة من parafilm (حوالي 15 × 15 ملم) على مدى غيض من ماصة. لماصات الفحص الأولي التحفيز 10 (N = 4 لكل من الذكور والإناث) يتم تحميلها في حال وجود الإعدادية سيئة أو عقبة أخرى غير متوقعة.
4. باستخدام زوج من ملاقط، بلطف أضعاف القرص الأحيائي في نصف لتسهيل توظيف في ماصة، ثم وضع جزئيا القرص مطوية في نهاية كبير من ماصة كي كاليفورنيا. ويتعرض 2-3 مم من القرص. محاذاة الماصات وصفت وهيأهم في حامل رف.
5. باستخدام pipettor أو حقنة، وتحميل 10 ميكروليتر (50 ميكروغرام) من حل متقلبة على كل قرص، والسماح لتمرير 2 دقيقة قبل إدخال أقراص تماما في ماصة. بمجرد تحميلها، ختم على الفور نهاية ماصة مع parafilm (حوالي 15 × 30 ملم). ومبلغ التحفيز متقلبة بحيث يمكن تحميلها ومنتفخ على الأرجح تختلف باختلاف نوع الحشرات.
6. بعد نفس البروتوكول المشار إليها أعلاه إعداد ضوابط لوتشمل في كل تحليل. لميكرولتر سيطرة سلبية 10 حمولة من البنتان فقط على كل قرص، والانتظار 2 دقيقة، ويتم تحميلها في ماصة المسمى، والختم. لمراقبة إيجابية، وتحميل 10 ميكروليتر (50 ميكروغرام) على القرص، وانتظر 2 دقائق، والحمل في ماصة المسمى، وختم مع parafilm.
7. وسوف جدوى الإعدادية antennal حشرة على الأرجح تختلف باختلاف الأنواع، ولكن وجدنا أن Amyelois transitella هوائيات البقاء عادة نشطة ومتسقة لمدة 30 دقيقة> بعد الاستئصال باستخدام بروتوكول وصفها. وهذا القدر من الوقت تسمح عادة لمدة تصل إلى 4-10 عينات المضطربة التي يتم تقييمها. الجدول 2 مثالا على الأوقات ومتواليات.

2. إعداد الهوائيات الحشرات لEAG الأحيائي

1. التركيز في هذه التجربة هو تحليل EAG، وبالتالي، على افتراض أن كل محقق سوف يحصلون على الحشرات تربيتها بشكل مناسب.
2. لهذه التجربة وسوف ندرس يوم 3-4 رأد، العث تزاوج الذكور والإناث. يتم نقل العث الفردية في الصغيرة، والحاويات، وبغطاء من البلاستيك في اليوم من تحليل. وذلك مباشرة قبل الأحيائي، يتم نقل فراشة لفحصها رأسه اولا في جهاز عقد (أي المصنوعة من مختلف نصائح pipettor البلاستيك) والمضمون من وراء. يمكن الاطلاع على التلاعب في حشرة تحت المجهر ستيريو الطاقة المنخفضة لتسهيل الختان.
3. ومازحت هوائيات من أصل باستخدام أداة الأسلاك ذات الرؤوس. يتم وضع حامل شوكة، مع فيلم صغير من هلام الكهربائي، على مقربة لنقل سريع للهوائيات. يتم استئصاله الهوائي الأول باستخدام مقص الصغرى وضعت على مفترق الطرق، وتأمين قاعدة هوائي يوضع على الجزء غير الأحمر في مفترق الطرق (القطب الأرض غير مبال). وبدأت مجموعة الموقت لمدة 10 دقائق ثم يتم استئصاله الهوائي الثاني وضعت بجانب الهوائي الأولى مع كل من القواعد على نفس الجانب من مفترق الطرق.
4. بدلا من ذلك، قد يكون غادر هوائيات المضمون داخل تمسكز أنبوب، رفعه، ثم إزالتها بلطف من بين الأنبوب والحشرة باستخدام أداة الأسلاك ذات الرؤوس مع لمسة من هلام في نهاية المطاف.
5. يتم التحقق من هوائيات لضمان مغمورة قاعدة وقمة في هلام الكهربائي وعدم وجود فقاعات في هلام. ويمكن خفض نهايات / نصائح لضمان التعرض الكامل للهلام الكهربائي. وينبغي أن تستخدم الحذر لضمان أن يتم تغطية الجزء المتبقي من كل هوائي مع هلام، وبالتالي ضمان أقصى قدر من المساحة السطحية antennal يتعرض للنفخة.
6. يتم بعد ذلك إدخال شوكة هيأهم إلى لجنة التحقيق قبل مكبر للصوت وأبقى تحت تيار مستمر من الهواء مرطب في 200 مل / دقيقة في الوقت المتبقي من فترة انتظار 10 دقيقة. ويلاحظ في الوقت المكوس وEAG مرات بدء (الجدول 2) و 30 ثانية قبل نفخة التحفيز الأولى، يتم كشف النقاب ماصة تحتوي على سيطرة إيجابية وضعت في حامل التي تم تعديلها لتوجيه الهواء / نفخة تدفق 2-3 مم من هيأهم للهوائيات.
7. بعد كل experiment، يصرح باستخدامها في العث اختبار في بيئة الثلج الجاف والتخلص منها بشكل صحيح.
8. يتم تشريح العث الإناث للتحقق من حالة التزاوج. ويفترض أن الذكور يرتبطن بعلاقة المساكنة أن تزاوج.

3. EAG البروتوكول لمكونات فردية

1. وتسجل ردود Antennal عبر برنامج AutoSpike المتضمنة في صك EAG Syntech. تم تعيين التكوين في التبويب خصائص AutoSpike للقناة مع التحقيق EAG بمعدل أخذ العينات من 106،7، لا للتصحيح، ومرشح من 0-42 هرتز. للعلامة التبويب تصفية، تصفية EAG قيد التشغيل ويتم تعيين قطع المنخفضة إلى 0.1 هرتز.
2. نفث التحفيز هي 1-2 في مدة ثانية. يتم تشغيل جهاز ضبط الوقت المحدد ل1 دقيقة بعد كل نفخة.
3. وتفض ماصة الاختبار التالي متقلبة وضعت في حامل. تسلسل المواد المتطايرة اختبار، والعشوائية بين يمتد إلى ضمان عدم وجود مركبات اختبار تتبع باستمرار اختبار آخر غير المستقرة، ويتبع بعد ذلك (على سبيل المثال، الجدول 2) allowi بعنايةنانوغرام 1 دقيقة بين نفث.
4. لتسهيل سهولة قراءة ردود EAG، يتم وضع أجزاء من الحكام على شاشة الكمبيوتر، ويتم قياس مستوى خط الأساس إلى ذروة إشارة انحراف النزولي في ملم وعلى ورقة تسجيل البيانات (على سبيل المثال، من أجل إعداد بالسيارات 5 و 33 ملم = 2.5 MV). برنامج لديها القدرة على تشغيل التسجيلات المحفوظة لتحليل المستقبل. يتم تنفيذ تحويل ملم إما بالسيارات أو سعة μV في تحليل البيانات في وقت لاحق.
5. بعد المباراة النهائية نفخة مراقبة إيجابية (على سبيل المثال، سجل # 12) ويدار، تتم إزالة الهوائيات، يتم تنظيف مفترق الطرق مع مسح الايثانول المشبعة وسمح لتجف قبل استخدامها لاحقا.
6. لزيادة الإنتاجية من المقايسات، يمكن أن تبدأ في استئصال للمجموعة التالية من الهوائيات من قبل العاملين في المختبرات 2 10 دقائق تقريبا قبل نهاية التجربة الحالية - بعد نفخة الرابع؛ الاختبار الثاني تقلبا من التجربة الحالية، وفقا للجدول 2. وهذا سوف يسمح FOص بداية تجربة المقبل مباشرة بعد انتهاء التجربة الحالية.
7. لا يمكن أن يؤديها عدد أكبر من تكرار (على هوائيات مختلفة) على مجمعات من اهتمام لتوفير مزيد من التحقق من صحة الإحصائية.

4. مثال على تحليل EAG من الأخلاط أو المصفوفات الأخرى (الجدول 3)

1. المقبل، وتحسب النسب والأحجام لمدة يمزج التعليم العالي (3-مكون مخاليط) لتقديم مثال على الجمع بين المواد المتطايرة مثيرة لاستجابات EAG عالية (الجدول 4). العمليات الحسابية هي لبعض النسب الأساسية، وهي نسبة 01:01:01 ضرس α-humulene: 2-undecanone: 2 فينيل، ومن ثم مقارنة مع نسبة مزيج الثاني من 1:02:04.
2. باستخدام بروتوكولات مماثلة سبق وصفها، وإعداد الخلائط وصفت يتم تحميل باستور ماصات جنبا إلى جنب مع الضوابط اللازمة الإيجابية والسلبية.
3. ومنتفخ العينات المضطربة عبر الهوائيات من الذكور والإناث، ويتم قياس ردود الفعل والدخول فيإلى ورقة بيانات (الجدول 3).

5. ممثل النتائج

لorangeworm السرة الإناث يتم استخدام الإعدادات التالية: 2 نفث الثانية، 10 مرات تسجيل 2، 10 إطار الثاني، و 5 من جدول بالسيارات. انحراف سلبي هو الرد المعتاد، ولكن يتم تسجيل قيمة مطلقة (على سبيل المثال، يتم تسجيل -3400 μV انحراف كما μV 3400). يتم تجاهل استجابة ضعيفة نسبيا من الإعدادية للسيطرة الإيجابية. ويقدم الشكل 1 رسم بياني لضعف الاستجابة للسيطرة الإيجابية التي orangeworm السرة.

على سبيل المثال من جراء سيطرة الفقراء، ومتوسط ​​استجابة antennal الإناث إلى اسيتوفينون عادة كاليفورنيا. μV 2600 (الشكل 2)، إذا كان الإعدادية أعطى فقط استجابة من كاليفورنيا. وسيتم التخلص من 1300 μV عليه وهيأهم زوج آخر من الهوائيات. وبالمثل، فإن استجابة معدل الذكور إلى (Z، Z) وكان -11،13-hexadecadienal typicallص 3000 μV، وبالتالي فإن أي استجابة أقل من 1،500 تم تجاهل عادة μV.

سيطرة إيجابية في بداية ونهاية كل تجربة ويوفر أيضا معلومات عن حالة من الهوائيات. وبحكم التجربة التي نتبعها للفحص السريع وإذا كانت الاستجابة antennal إلى نفخة من ضبط آخر (سجل رقم 12، الجدول 2) إما أن يكون أقل من 75٪ من نفخة ^ش 1 من الرقابة المسبقة (رقم قياسي # 1 ، الجدول رقم 2) أو أقل من نفخة ^{الثانية} 2 من الرقابة المسبقة (محضر رقم 2، الجدول رقم 2) ثم لا يتم استخدام هذه التجربة في تحليل البيانات نتيجة لتدهور محتمل للالإعدادية (الشكل 3). ومثال على القاعدة الأولى من الإبهام يكون سجل رقم 1 = 2730 μV وسجل رقم 12 = 1680 μV، والقاعدة الثانية من الإبهام إذا سجل # 2 = 2350 μV وسجل رقم 12 = 1680 μV، وفي كل حالة من هذه الحالات ، سيتم تجاهل نتائج الإعدادية وللتجربة.

Aومثال ممثل تصحيح القيم استجابة EAG مقاسا لسيطرة إيجابية على النحو التالي.

تشغيل #	EAG (μV)	تشغيل # 2	EAG (μV)	تشغيل # 3	EAG (μV)
(+) السيطرة	2800	(+) السيطرة	2420	(+) السيطرة	3030
Cmpnd A	3000	Cmpnd A	2500	Cmpnd A	3440
(-) السيطرة	530	(-) السيطرة	755	(-) السيطرة	910
Cmpnd B	2400	Cmpnd B	2000	Cmpnd B	2560
(+) السيطرة	2770	(+) السيطرة	2400	(+) لحد من الخطرل	3020

باستخدام القيم أعلاه لتجربة N = 3، وطرح الاستجابة سيطرة سلبية من كل قيمة في كل تجربة على افتراض سيطرة السلبية هي الأساس antennal استجابة لنفخة الميكانيكية والمذيبات المتبقية.

تشغيل # 1	EAG (μV)	تشغيل # 2	EAG (μV)	تشغيل # 3	EAG (μV)
(+) السيطرة	2270	(+) السيطرة	1665	(+) السيطرة	2120
Cmpnd A	2470	Cmpnd A	1745	Cmpnd A	2530
(-) السيطرة	0	(-) السيطرة	0	(-) السيطرة	0
Cmpnd B	1870	Cmpnd B	1245	Cmpnd B	1650
(+) السيطرة	2240	(+) السيطرة	1645	(+) السيطرة	2110

وبعد ذلك الضوابط الإيجابية لكل تجربة أن متوسط ​​وتصحيحه إلى 1،000 μV، مشيرا الى ان نسبة للتصحيح إلى 1،000 μV. ويمكن بسهولة ورقة البيانات (على سبيل المثال، اكسل) يمكن التلاعب بها لتحويل الردود على بيانات قابلة للاستخدام.

تشغيل # 1	AVG (μV)	تشغيل # 2	AVG (μV)	تشغيل # 3	AVG (μV)
(+) السيطرة	2255	(+) السيطرة	1655	(+) السيطرة	2115
(+) السيطرة صفة.	1000 (0.443)	(+) السيطرة صفة.	1000 (0.604)	(+) السيطرة صفة.	1000 (0.473)

ضرب من قبل نسبة التصحيح في كل تجربة، قيم مركب يتم تعديلها ثم A و B المركب.

تشغيل # 1	صفة. EAG (μV)	تشغيل # 2	صفة. EAG (μV)	تشغيل # 3	صفة. EAG (μV)
Cmpnd A	1094	Cmpnd A	1054	Cmpnd A	1197
Cmpnd B	828	Cmpnd B	752	Cmpnd B	780

ثم يتم تحديد المعدلات (وسائل) لكل مركب جنبا إلى جنب مع غيرها من البيانات الإحصائية ذات الصلة، وردود EAG للمركبات اخضعت للاختبار ومن ثم يمكن تقييمهاللترشيح لمزيد من التحقيق.

مركب	EAG (μV)	رقم أشواط، N =
A	1115	3
B	787	3

الشكل 1. EAG الممثل للاستجابة antennal الذكور (1180 μV) إلى ما قبل سيطرة (1 ^ش نفخة مراقبة إيجابية) انه سيتم التخلص منها نظرا لاستجابة antennal الفقراء بعد التأكد من هوائيات على اتصال جيد مع هلام. قضبان النوافذ الزرقاء في أسفل تمثل نفخة ثاني اثنين من التقلب. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

ترونج> الشكل 2. EAG الممثل للاستجابة لantennal الإناث (3400 μV) إلى 1 ^ش نفخة ما قبل السيطرة التي يمكن اعتبارها مناسبة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 3. EAG الممثل للاستجابة لantennal الإناث (1680 μV) للسيطرة على آخر (مراقبة إيجابية الأخير لكل تجربة) التي يمكن اعتبارها فقيرة، وتدل على تدهور هوائيات (<75٪ من 1 ^ش مراقبة مسبقة أو < 2 قيمة نفخة ^{الثانية} من مرحلة ما قبل سيطرة). على سبيل المثال هذا هو 1 ^ش ما قبل سيطرة نفخة 2730 μV و 2 ^{الثانية ومرحلة} ما قبل سيطرة نفخة كان μV 2350. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

dflinebreak ">
الشكل 4. الممثل EAG لاستجابة antennal الإناث (μV 3800) إلى سحابة من خليط مرشح متقلبة والقياسات لاحق من انحراف الأولية القصوى (μV 3800)، المنحدر الأولي خلال مدة نفخة (0.3 s/1.2 بالسيارات = 0.25 S / بالسيارات)، ومنحدر لمدة نفخة المتبقية (1.6 s/1.9 بالسيارات = 0.84 S / MV). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

أن منتفخ الشكل 5. السفينة الصغيرة التي تحتوي على تعديل مصفوفة عينة والمواد المتطايرة المرتبطة بها عبر A. transitella هوائيات.

ad/3931/3931table1.jpg "/>
الجدول رقم 1. في الانبعاثات المتطايرة الموقع من اللوز لا شبيه له (2007) والاستجابات EAG يحدده تكوين مختلف وأقل حساسية في البرنامج Autospike.

الجدول 2. مثال على شكل لتسجيل ردود antennal من الذكور والإناث على المكونات المتطايرة الفردية.

الجدول 3. مثال على شكل لتسجيل ردود antennal من الذكور والإناث إلى يمزج متقلبة و / أو باقات.

الجدول 4. أمثلة من إعداد 10 مل من 5 ملغ / مل حل لاثنين من نسب مختلفة من الأخلاط.

الجدول 5. مثال على شكل لتسجيل 2 نفث متتالية من المكونات المتطايرة واحدة عبر الهوائيات من الذكور والإناث.

المناقشة

استخدام التسجيلات electroantennogram باعتباره الأحيائي لتحديد استجابات استقبال كيميائي من حشرة الهدف هو شائع الى حد كبير ويمكن العثور على العديد من الدراسات التي تستخدم EAG كما كشف عن النفايات السائلة من الغاز اللوني (GC-EAD) في الأدب. أظهرت ^9،10 الأسلوب وسوف توفر التشخيص السريع لكميات يعادل المكونات المتطايرة مع مكررات عالية لتخصيص واثق من الاستجابة النسبية. برنامج AutoSpike في البرنامج Syntech هو برنامج جيد لفحص المواد المتطايرة لأنها قادرة على توفير سعة انحراف أقصى إ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
اسيتوفينون	ألفا، Aesar	A12727	إيجابي سيطرة الإناث
(Z، Z) -11،13-Hexadecadienal	Suterra		إيجابي سيطرة الذكور
α-Humulene	الدريتش	53675	Sesquiterpene
2-Undecanone	الدريتش	U1303	الأحماض الدهنية المشتقة
2-فينيل	الدريتش	77861	مركب بنزيني
البنتان	EMD	PX0167-1	مذيب
4-قناة اكتساب تحكم	Syntech	أناDAC-4
EAG التحقيق، قبل مكبر للصوت	Syntech	نوع PRG-2
هوائي حامل	Syntech	لPRG-2	شوكة كهربائي
التحفيز تحكم	Syntech	CS-55	تدفق الهواء ونفث
أطياف الكهربائي جل	باركر	12-02
الأحيائي أقراص	Whatman	2017-006	6 ملم
باستور pipets	VWR	14673-010	5 ¾ "(14.6 سم)
Parafilm M	بيميس	PM-992