الأمثل تحليل الحامض النووي والتعبير الجيني من المناطق، الصغيرة تشريحيا المعرفة من الدماغ

Summary

ويرد تبسيط العمل لدراسة الحامض النووي والتغيرات في التعبير الجيني في وقت مبكر على الحياة التوتر. بدءا من فصل الأمهات من الفئران حديثي الولادة والعزلة من أنسجة المخ المنفصلة، ​​التي نمثلها بروتوكول لعزل في وقت واحد DNA و RNA من اللكمات أنسجة المخ لتسلسل بيسلفيت اللاحقة وتحليل RT-PCR.

Abstract

التعرض لاتباع نظام غذائي، يمكن أن المخدرات والمحن في وقت مبكر الحياة خلال النوافذ الحساسة من حياة ^1،2 تؤدي إلى تغييرات دائمة في التعبير الجيني التي تسهم في العرض من الظواهر الفسيولوجية والسلوكية. البرمجة البيئية مثل من المرجح أن تزيد من التعرض للأمراض، الأيض القلب والأوعية الدموية والعقلية ^3،4.

ويعتبر الحامض النووي وتعديلات بسيطة العمليات الرئيسية في وساطة للحوار الجينات والبيئة، ويبدو أيضا أن الأساس الذي تقوم عليه البرمجة البيئية ^5. في الثدييات، والحامض النووي وعادة ما تضم ​​إضافة التساهمية لمجموعة الميثيل في موقف-5 من السيتوزين في سياق dinucleotides الدليل السياسي الشامل.

مثلأيشن الدليل السياسي الشامل يحدث بطريقة الأنسجة والخلايا محددة للغاية مما يجعلها تمثل تحديا لدراسة منفصلة، ​​ومناطق صغيرة من المخ حيث التجانس الخلوية عالية وكمية محدودة الأنسجة. وعلاوة على ذلك، بترتبط ارتباطا وثيقا ecause التعبير الجيني ومثيلة أحداث، يمكن المكتسبة ارتفعت قيمة وبمقارنة كل من المعلمات في نفس العينة.

هنا، ويرد على بروتوكول خطوة بخطوة (الشكل 1) للتحقيق في برمجة جينية في الدماغ باستخدام نموذج على "فصل الأمهات" المحن الحياة في وقت مبكر لأغراض التوضيح. بروتوكول يصف إعداد micropunches من أدمغة فئران تفاضلي في سن من الذي يمكن أن الحمض النووي والحمض النووي الريبي معزولة في وقت واحد، مما يسمح لتحليل الحامض النووي والجينات في نفس العينة.

Protocol

1. برمجة من قبل المحنة الحياة المبكرة

يتم تنفيذ الفصل الأمهات (MS) في وقت مبكر للحث على الحياة الإجهاد (ELS) في الجراء التي ألقاها الفئران C57BL/6N توقيت الحوامل (يوم بعد الولادة 0 (P0) في يوم ولادته).

1. يتم وضع الفضلات فرد في أقفاص نظيفة (مع وسادة التدفئة) لصحيفة H 3 من P1-10.
2. سيطرة (غير ELS) الجراء لا تزال دون عائق في العش الأمهات في جميع أنحاء.
3. يتم الاحتفاظ الجراء مع أمهاتهم حتى الفطام (P21)، وبعد ذلك مرة ويقيم هؤلاء في مجموعات الجنس المتطابقة (3-5 الفئران في قفص) تحت ظروف المختبر القياسية السكن الحيوانية.

2. العزلة والتشريح من أنسجة المخ

1. وقتل الفئران في سن المطلوب من قبل ملاحظة عنق الرحم التفكك: لأن هذا البروتوكول ينطوي على نموذج الإجهاد، ويتم إعطاء أي تخدير قبل خلع عنق الرحم، لتجنب التداخل مع التنظيم الفيزيولوجي الطبيعي للهرمونات التوتر. يتم فتح جماجم وتتم إزالة العقول بعناية وعلى الفور المفاجئة مجمدة من قبل الانغماس في الجليد ISO-البنتان الجافة، قبل أن يتم تخزينها في -80 درجة مئوية.
2. العقول هي cryosectioned (10 ميكرون سمك)؛ هي التي شنت المقاطع على الشرائح الزجاجية Superfrost والحفاظ على -20 درجة مئوية. يستخدم إشارة إلى أطلس الماوس التجسيمي معيار (على سبيل المثال Paxinos ⁶⁾ للتحقق من الدقة التشريحية وضمان إدراج المنطقة من اهتمام (مثلا الخلايا العصبية في النواة مجاور للبطين - PVN - جمع الأجزاء بدءا من مستوى PVN منقاري، bregma -0.75 -0.85 إلى).
3. وملطخة المقاطع مع البنفسجي cresyl لتسهيل التعرف على هياكل الدماغ المختلفة. اللكمات (0.8 ملم) في المناطق ذات الاهتمام (على سبيل المثال PVN) والتي حصلت عليها في microdissection وكو.

3. حمض النووي استخراج المخ من اللكمات

بروتوكول الأمثل لاستخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي في وقت واحد صغير من الدماغ ريج neuroanatomically المعرفةيوصف الأيونات لتحليل التعبير الجيني وبيسلفيت ^7.

ملاحظة: وبالنظر إلى أن الحمض النووي الريبي أقل استقرارا من الحمض النووي في المنطقة العازلة، GTC، من المستحسن معالجة RNA الأولى. ويمكن أن تظل جناسة المستخدمة لتنقية الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة (RT) خلال تلك الفترة.

1. التجانس اللكمات باستخدام ماصة وvortexer في 400 ميكرولتر من العازلة guanidinium (GTC) ثيوسيانات (4.5 ثيوسيانات guanidinium M، N-2٪ lauroylsarcosine، 50 مم EDTA درجة الحموضة 8.25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، 0.1 M بيتا المركابتويثانول، مضاد الرغوة 0.2٪ أ) على RT، ويمر عدة مرات من خلال حقنة تحت الجلد (29G) (الشكل 2).
2. تقسيم المحللة إلى أجزاء متساوية، ويمكن استخراج الحمض النووي الريبي والحمض النووي على حد سواء في نفس الوقت أو على حدة، تبعا لاحتياجات تجريبية خاصة.
3. لتنقية الحمض النووي الريبي إضافة حجم 1/10 من NaOAc، 1 AquaPhenol حجم (Appligene) (درجة الحموضة 4) و 1/2 حجم من كلوروفورم: أيزو أميلي (24:1) إلى المحللة. دوامة بقوة بعد كل خطوة،احتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة، الطرد المركزي (20 دقيقة في 10000 ز في 4 درجات مئوية)، إضافة حجم مساو من EtOH 70٪ إلى مرحلة aequous.
4. نقل الخليط إلى عمود الدوران الحمض النووي الريبي (RNA مثل Nucleospin الثاني من Macherey-ناجل) وتنفيذ الخطوات على عمود الدناز-الهضم وغسيل (اتبع بروتوكول الشركة المصنعة)؛ أزل الحمض النووي الريبي في 25 ميكرولتر O. ₂ H
5. لتنقية الحمض النووي يتم استخدام بروتوكول الأمثل من الدم DNeasy QIAGEN ومجموعة الأنسجة. المحللة تتوازن مع وحدات التخزين على قدم المساواة AL العازلة وEtOH 100٪، والحمل على العمود تدور أجهزة الطرد المركزي (1 دقيقة في 10000 ز في RT) وتجاهل التدفق من خلال.
6. إضافة 500 العازلة ميكروليتر AW1 بما في ذلك 5 ريبونوكلياز ميكروليتر (1 ملغ / مل) على عمود واحتضان 10 دقيقة في RT. تدور (1 دقيقة في 10000 غرام، RT) وتجاهل التدفق من خلال.
7. غسل عمود مع 500 AW2 العازلة ميكروليتر، تجاهل التدفق من خلال وتدور الجافة عمود فارغ (1 دقيقة في 15000 ز).
8. إضافة prewarmed (70 درجة مئوية) الواق AE والأعمدة من الحضانة لمدة 10 دقيقة عند 70 درجة مئوية. أزل عن طريق الطرد المركزي (1 دقيقة، 10000 ز)، وإعادة تطبيق تدفق من خلال وكرر الخطوة الطرد المركزي.

استخدام مقياس الطيف لتحديد الحمض النووي وتركيز الحمض النووي الريبي. نموذجي لكمة PVN غلة ~ الحمض النووي نانوغرام 600 و ~ 400 نانوغرام في الحمض النووي الريبي. لتحليل التعبير الجيني بواسطة PCR الكمي (qPCR)، ونحن عادة استخدام ~ 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي في رد فعل النسخ العكسي.

4. بيسلفيت التحويل

ويستخدم بيسلفيت الصوديوم لتحويل غير ميثليته cytosines إلى uracils. في المقابل، محمية cytosines ميثليته من التحويل. ولذلك، كل cytosines التي يتم الكشف عنها في التسلسل النهائي للبيسلفيت PCR-amplicon تمثل cytosines ميثليته.

تحويل بيسلفيت يسبب تدهور كبير الحمض النووي التي يمكن أن تكون عاملا محددا في تحليل PCR. لا يمكن أن يتحقق ظروف التفاعل الأمثل لتعظيم تحويل السيتوزين، والحد من تفتيت الحمض النووي والحفاظ على واحد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي حتى في درجات الحرارة المنخفضة باستخدامQIAGEN في عدة بيسلفيت EpiTect. في ايدينا ~ 200 نانوغرام من الحمض النووي تنقيته من micropunches توفير كمية كافية من المواد اللازمة لبدء رد فعل بيسلفيت.

لمنع الخلافات في كفاءة تحويل رد فعل، يجب أن تبقى كمية من الحمض النووي قالب ثابت بين جميع العينات المجهزة خلال تجربة. وبالإضافة إلى ذلك، تتابع يقرأ ينبغي فحص لكفاءة التحويل عن طريق فحص نسبة غير المحولة CpGs غير. يجب أن هذا المعدل يتجاوز 98٪. انخفاض قيم تشير إلى عدم اكتمال أو عدم كفاءة تحويل بيسلفيت وينبغي استبعاد تسلسل الأساسي من التحليل.

5. بيسلفيت PCR

1. بيسلفيت تصميم التسلسل الاشعال التي تخص الحمض النووي بيسلفيت تحويل (انظر المناقشة)؛ الميثيل التمهيدي اكسبرس البرنامج ( https://products.appliedbiosystems.com/ab/ EN / الولايات المتحدة / adirect / أب؟ كمد = catNavigate2 وcatID = 602121) وهذا سوف يساعد على تحديد أفضل درجات الحرارة الصلب في التجارب الرائدة.
2. إعداد PCR-ماجستير ميكس (رد فعل لأحد) على النحو التالي:

   2،5 ميكرولتر العازلة PCR 10X
   0،5 ميكرولتر dNTPs 10 ملم
   1 ميكروليتر 10 ميكرومتر إلى الأمام التمهيدي
   1 ميكروليتر عكس ميكرومتر 10 التمهيدي
   0،125 ميكرولتر QIAGEN Hotstart طق زائد
   ملء تصل إلى 23 ميكروليتر مع H ₂ O

3. إضافة 2 ميكرولتر بيسلفيت المعالجة DNA إلى رد فعل.
4. تضخيم باستخدام الشروط التالية:

   1 دورة 6 دقائق 95 درجة مئوية
   45-50 دورات من 1 دقيقة درجة مئوية 95، 1 دقيقة في درجة الحرارة المثلى الصلب، 1 دقيقة 72 درجة مئوية
   1 دورة 5 دقائق 72 درجة مئوية

تحليل 7 ميكرولتر من منتج PCR بواسطة الكهربائي للهلام الاغاروز للتحقق من حجم amplicon وتنقية رد فعل PCR المتبقية لربط لاحقة باستخدام المتاحة تجاريا PCR تنظيف عدة (على سبيل المثال، Macherey ناهلام Nucleospin استخراج). في حال تم الحصول على منتجات إضافية غير مرغوب فيها PCR، يوصى تنقية هلام.

6. بيسلفيت تسلسل

يمكن عالية الدقة ملامح الحامض النووي استخلاصه من قراءات استنساخ واحد كشف عن تغيرات طفيفة في الحامض النووي وتحديد المناطق التنظيمية التي تستجيب للعلاج (البرمجة البيئية). عملية التسلسل بيسلفيت تضم ثلاث مرات متتالية خطوات العمل. أولا، و تربط منتجات PCR PCR التي حصلت عليها قبل بيسلفيت الى ناقلات وتحويلها إلى بكتيريا. ثانيا، يعمل PCR مستعمرة من الحيوانات المستنسخة واحدة لتحديد الحجم الصحيح للإدراج. ثالثا، يتم تنظيف تقارير إتمام المشروعات مستعمرة إيجابية حتى وتعرض لردة فعل التسلسل الكبيرة صبغ. بعد خطوة التنظيف، ومنتجات electrophoresed على المنظم الشعرية.

6.1 ربط وتحويل

ملاحظة: نحن نستخدم بشكل روتيني pGEM-T ناقلات CLoning مجموعة (Promega). في تجربتنا، وكفاءة استنساخ يتوقف بصورة حاسمة على إدراج لتكون ligated. وينبغي اختبار نواقل مختلفة في حال تم الحصول عليها مرارا وتكرارا انخفاض عدد الحيوانات المستنسخة المؤتلف.

1. إعداد رد فعل الربط:

   5 ميكرولتر الواق ربط 2X
   1 ميكروليتر pGEM-T المتجهات
   1 ميكروليتر T4-يغاز
   3 ميكروليتر منتج PCR تنظيف الهاتفي

2. خلط رد فعل من قبل pipetting واحتضانها طوال الليل في 4 درجات مئوية.

   ملاحظة: يمكن أيضا ربط تنفيذها لمدة 1 ساعة على RT أيضا. لزيادة عدد الحيوانات المستنسخة المؤتلف، على ربط الليل في 4 درجات مئوية ويفضل.

3. تنظيف من منتجات الربط عن طريق الهطول الايثانول:
   1. إضافة 1 الجليكوجين ميكرولتر، 1 ميكرولتر NAAC 3M و 25 ميكرولتر EtOH 100٪ الى رد فعل متهور وربط لمدة 1 دقيقة في النيتروجين السائل.
   2. الطرد المركزي (15،0000 ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية)، ونبذ طاف.
   3. تغسل مع 300 ميكرولترEtOH 70٪ وأجهزة الطرد المركزي (15،000 جم لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية)، تجاهل بيليه طاف والجافة في RT (10 دقائق).
   4. Resuspend بيليه في 10 ميكرولتر O. ₂ H

6.2 تحويل المنتجات في ربط البكتيريا electrocompetent

1. Precool cuvettes electroporation (1 مم العرض) على الجليد وذوبان قسامة من البكتيريا DH5α electrocompetent على الجليد.
2. إضافة 45 البكتيريا DH5α ميكروليتر إلى 10 ميكروليتر تنظيف المنتج ربط (انظر أعلاه)، ونقل إلى كوفيت.
3. تحول البكتيريا بنحو 1.5 كيلو فولت، 200 Ω، 15 μF وإضافة 1 مل من المتوسط ​​SOB prewarmed مباشرة بعد تسليم النبض.
4. انتشار بكتيريا استرداد لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، 100 ميكرولتر من التعليق على LB / لوحات الأمبيسيلين المغلفة مع IPTG / X-غال.
5. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.

6.3 مستعمرة PCR

ملاحظة: يتم إجراء PCR مستعمرة من الحيوانات المستنسخة واحدة لضمان أن يدرج هيمن حجم وتوقع. قد تأخر تطوير لون من فحص أزرق / أبيض، أحداث غير مرغوب فيها إعادة التركيب خلال ربط، دمج أزواج التمهيدي oligomeric أو اقتطاع منتجات PCR أن تؤدي إلى نتائج التسلسل الخاطئ. نحن نستخدم بشكل روتيني T7 والاشعال SP6 لتضخيم إدراج المستنسخة، وهذا نهج النتائج في متواليات ناقلات إضافية من ما يقرب من 150 شركة بريتيش بتروليوم. ويستخدم T7 التمهيدي في رد فعل التسلسل في خطوة لاحقة.

1. انشاء مستعمرة PCR رد فعل في لوحة 96-جيدا. رد فعل لمدة الاستخدام:

   3 ميكروليتر 2.5 ملم MgCl ₂
   2،5 ميكرولتر العازلة طق 10X
   1،5 ميكرولتر dNTP 10 ملم
   2 ميكرولتر 2.5 ملي التمهيدي T7
   2 ميكرولتر 2.5 ملم SP6 التمهيدي
   1 ميكروليتر البوليميراز Fermentas طق
   شغل ما يصل إلى 25 ميكروليتر مع H ₂ O

2. الاستغناء عن 25 ميكرولتر / مزيج جيد من سيد إلى كل بئر من لوحة 96-جيدا.
3. اختيار إيجابي (أبيض) نسخة من لوحة مع طرف ماصة وتراجع إلى رد فعل PCR.
4. تضخيم باستخدام فل خوار الشروط:

   1 دورة في 4 دقائق و 95 درجة مئوية
   10 دورة في 30 ثانية 94 درجة مئوية، 30 ثانية عند 56 درجة مئوية و S 30 في 72 درجة مئوية
   30 دورة في 30 ثانية 94 درجة مئوية، 30 ثانية في 48 درجة مئوية و S 30 في 72 درجة مئوية
   1 دورة 5 دقائق عند 72 درجة مئوية

5. تحميل 5 ميكرولتر من PCR مستعمرة على هلام الاغاروز وتحديد ردود الفعل التي تحتوي على حجم إدراج حق.
6. يتم تنظيف تقارير إتمام المشروعات التي تحتوي على مستعمرة amplicons المرغوب فيه استخدام عدة متاحة تجاريا (Machery ناجل Nucleofast).

6.4 رد فعل المنهي الكبيرة صبغ وتسلسلها

1. إعداد مزيج الرئيسي لصبغ رد الفعل الكبيرة. رد فعل لمدة الاستخدام:

   1 ميكروليتر H ₂ O
   0،5 ميكرولتر الكبيرة صبغ الكاشف
   1.5 العازلة تسلسل ميكرولتر

2. الاستغناء عن 3 ميكروليتر / بشكل جيد في كل بئر من لوحة 96-جيدا، إضافة إلى كل جيد 2 ميكرولتر من تنظيف مستعمرة PCR المنتج وتشغيل رد فعل على thermocycler مع المعلمات التالية:

   > 1 دورة 1 دقيقة في 96 درجة مئوية
   35 دورات من 10 ثانية في 96 درجة مئوية، 5 ثوان عند 50 درجة مئوية والحد الأدنى 4 في 60 درجة مئوية

3. يتم تنظيف رد فعل كبير، صبغ حتى استخدام عدة التجارية (96 ميليبور المونتاج التسلسل تنظيف كيت) ومعالجتها على المنظم الشعرية (على سبيل المثال ABI 3100 DNA).
4. ويتم تحليل تسلسل باستخدام محلل BIQ ( http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/ ) أو على شبكة الإنترنت أداة BISMA ( http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/ ) للتوصل إلى نمط مثيلة في المنطقة الحمض النووي التحقيق في (الشكل 4).

7. ممثل النتائج

للحصول على نظرة ثاقبة تأثير ELS على التعبير AVP وحالة مثيلة، تمت معالجة الفئران C57BL/6N وفقا لسير العمل المذكورة أعلاه. لفترة وجيزة، كانت مجموعة من الفئران C57BL/6N قubjected إلى ELS بينما تركت المجموعة الضابطة دون عائق. واللكم وPVN والنواة فوق البصرية (SON) و تم عزل الحمض النووي والحمض النووي الريبي في وقت واحد من اللكمات واحدة. وقد كتب عكس الحمض النووي الريبي وقيست مستويات النصوص AVP بواسطة تحليل qPCR وتطبيع للتعبير عن Hprt والجينات التدبير المنزلي Gapdh. وكان الحمض النووي بيسلفيت المعالجة، وتتضخم مع الاشعال محددة إلى محسن AVP الشكل (4A) والمنتجات PCR والمستنسخة وتسلسلها. وقد تم تحليل 20 على الاقل من كل الحيوانات المستنسخة المؤتلف الماوس / PCR لتحديد الترددات مثيلة لCpGs الواردة في amplicon PCR (الشكل 4B). بالمقارنة مع الضوابط، ELS استحث hypomethylation كبيرة في CpG10، CpG13، CpG12 وCpg14 من محسن AVP (P <0.05، ن = 6-8 الحيوانات) مما يوحي جينية وضع علامات على هذه المنطقة في وقت مبكر من خلال التنظيم والحياة تجارب. وعلى النقيض من مثيلة، من PVNكان محسن AVP تتأثر ELS في نسيج خصوصية SON تبين من علامات جينية (الشكل 4C). تحليل الحمض النووي في حالة مثيلة CpG10 وAVP التعبير الجيني في الحيوانات التحكم (ن = 6) يدل على وجود علاقة سلبية مشيرا إلى دور الحامض النووي في صقل التعبير الجيني AVP (الشكل 4D).

ويتم الحصول على الشكل 1. Micropunches من أدمغة تشريح من سيطرة وبداية للحياة الفئران وشدد. بعد الحمض النووي الريبي والعزلة، ويتحدد التعبير الجيني من قبل qRT-PCR بينما يتم تضخيم الحمض النووي بيسلفيت المعالجة ويتم استنساخ المنتجات النقية في تحديد ناقلات مناسب يسمح للاستنساخ المؤتلف بواسطة أزرق / أبيض اختيار. يتم التحقق من أحجام تضاف الصحيحPCR مستعمرة قبل القيام الكبيرة صبغ رد فعل وتجهيزها على المنظم الشعرية. نمط مثيلة وتصور من قبل أدوات البرمجيات المناسبة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2. الجدول الزمني من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي لاستخراج التسلسل بيسلفيت.

الشكل 3. سير العمل لاستخراج في وقت واحد من الحمض النووي والحمض النووي الريبي. يتم وضع لكمة من نواة المهاد paraventricularis، جين AVP صغيرة معربا عن منطقة في الدماغ، في 400 العازلة GTA ميكرولتر، vortexed حتى تعطلت والمتجانس مزيد من المرور عبر حقنة (29G). يتم تقسيم ثم جناسة لتنقية الحمض النووي الريبي والحمض النووي. لا يمكن للانقسام أن تكون 1:1 أو ذات أبعاد مختلفة وفقاعلى سؤال التجريبية خاص. وينبغي أن تتم معالجة الخليط في غضون ساعات قليلة.

الشكل 4. مثلأيشن الدليل السياسي الشامل في مكان الجريمة AVP في مراقبة 6 أسابيع من العمر والحيوانات ELS. (أ) خطة من الذيل AVP والجينات الأوكسيتوسين الموجه إلى الذيل، ومفصولة المنطقة بين الجينات (IGR). وصفت من قبل صناديق exons متماثلة (مرقمة) مفتوحة. يشار إلى توزيع بقايا الدليل السياسي الشامل، ويتميز حجم وموضع من amplicon PCR منها تحتوي على 10 إلى الدليل السياسي الشامل CpG14 بخط عريض. (ب) مثلأيشن من محسن AVP في PVN في الحيوانات السيطرة وELS (ن = 6-8). (C) مثلأيشن من AVP محسن في الابن في السيطرة والحيوانات ELS (ن = 8-10). (د) ارتبط AVP التعبير الجينيمع مثيلة في CpG10 (ن = 6). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Discussion

ويتزايد الاعتراف برمجة جينية باعتباره آلية هامة الكامنة وراء الصحة والمرض. هنا نقدم اتباع أسلوب دقيق للعزلة في وقت واحد من الحمض النووي والحمض النووي الريبي من micropunches والخطوات اللاحقة للحصول على ملامح الحامض النووي من خلال التسلسل بيسلفيت. سير العمل الأمثل يسمح تحليل ملائم للبرمجة جينية في الدماغ استجابة للمؤثرات البيئية. وعلاوة على ذلك، ويسهل هذا النهج من التحقيق في العلاقة الوظيفية بين الحامض النووي والجينات كما يتم تحليل كل من نفس العينة. أخيرا، يمكن أن أعداد الحيوانات اللازمة للتجربة انخفاضا كبيرا.

وينبغي الأخذ ببعض الاحتياطات والمبادئ التوجيهية أثناء تنفيذ العمل المقدمة. نظرا لتعقيد غير عادية وعدم التجانس في الدماغ ومنذ مثيلة والتعبير نمط قد تختلف بطريقة الخلايا والأنسجة معين هو من أقصىيتم تنفيذ أهمية أن micropunching بطريقة موحدة. كما مثال على ذلك، تم الكشف عن برمجة جينية من AVP في paravaventriuclar، ولكن ليس في النواة فوق البصرية (الشكل 4B-D)، واثنين من AVP معربا عن مناطق ما تحت المهاد ^4. في هذا الصدد، وتوافر DNA و RNA من لكمة النسيج نفسه هو مفيد والتعبير RNA من الجينات الأنسجة علامة معينة يمكن استخدامها في بعض الحالات للتصديق على أن تعرض للكم المكان الصحيح. على الرغم من أن micropunching يمكن أن تقلل من عدم التجانس الخلوية، وأنه لا بد من التذكير بأن هذا النهج لا يؤدي إلى عزل أنواع خلية واحدة أو السكان. يمكن أن تعتبر خطوات تنقية إضافية لمعالجة هذا الموضوع.

لبيسلفيت التسلسل الأمثل التصميم التمهيدي لتلقي العلاج PCR التضخيم بيسلفيت التالية أمر ضروري. المنتجات يمكن ان PCR يتجاوز 400 شركة بريتيش بتروليوم في طول أن يكون مشكلة بسبب تدهور الحمض النووي من قبل بisulfite العلاج. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن PCR المتداخلة يمكن أن تعطي نتائج منحازة إلا إذا كان بعض القوالب سليمة تسهم في عملية التضخيم. وينبغي تصميم أزواج التمهيدي التي هي محددة لamplicon المحورة؛ متواليات لا ينبغي أن تحتوي على dinucleotides الدليل السياسي الشامل من أجل تجنب مثيلة المنحازة التضخيم. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تحتوي على الاشعال عدم الدليل السياسي الشامل cytosines لمنع تضخيم الحمض النووي معدلة أو تحويلها بشكل غير كامل. قد التضخيم من بعض القوالب الاستفادة من إجراء الساخن بداية PCR. على أي حال، ينبغي التحقق من ملاءمة من أزواج التمهيدي في التجارب الرائدة وذلك لمنع تلف العينات التجريبية قيمة.

تسلسل بيسلفيت يمثل طريقة قياسية لتحليل مثيلة في مواقع محددة كما أنها قادرة على موثوق بها وعلى وجه التحديد الكشف عن مثيلة من مخلفات الدليل السياسي الشامل واحدة بطريقة أليل محددة ^8. لا ينصح التسلسل المباشر للمنتج PCR كما س مثيلة مختلطواتحاد كرة القدم الدليل السياسي الشامل بقايا تبدو وكأنها ذروة C / T مزدوجة في مخطط رحلاني، التي يمكن أن تمنع الكمي لمثيلة في الموقع المعني. لهذا السبب يجري استنساخ خطوة وسيطة والتسلسل استنساخ عدة (~ 20-30) لتحديد مدى مثيلة. Pyrosequencing يمثل طريقة بديلة لتحديد الحامض النووي. فإنه يستخدم أيضا تحويل بيسلفيت وبيسلفيت PCR ولكن بدلا من استنساخ وتسلسل يتعرض amplicon الى رد فعل pyrosequencing مباشرة حيث يتم قراءة حالة مثيلة من بقايا الدليل السياسي الشامل باعتباره تعدد الأشكال C / تي للتركيبات النووية المنفردة التي يمكن قياسها كميا بسهولة. كلا أساليب الكشف عن مستويات مماثلة من مثيلة ^{9 ولكن} نظرا لأنه يمكن حذف استنساخ خطوة pyrosequencing هو مزيد من الوقت بكفاءة. ومع ذلك، يمكن اعتمادا على قالب تكون متسلسلة فقط 40-100 النيوكليوتيدات في آن واحد بحيث عدة جولات من pyrosequencing التمهيدي مع تسلسل مختلفة ضرورية. هذا هو الحد الحرج، نظرا ثاهناك حاجة إلى كميات أعلى طن من الحمض النووي (حوالي 1 ميكروغرام لكل رد فعل)، وهو المنظور تتجاوز المبالغ المتاحة من اللكمات صغيرة أنسجة المخ. وهكذا المسح الأولي لمناطق واسعة من kilobases عدة pyrosequencing يبدو أقل ملاءمة مثل القراءة استنساخ واحدة. ومع ذلك، ينبغي النظر بعد في التعرف على منطقة صغيرة من pyrosequencing الفائدة.

بشكل جماعي، والبروتوكول المذكورة أعلاه توفر نهجا دقيقة وفعالة ومبسطة لتحليل سريع وفعال من حيث التكلفة من micropunches الدماغ لإحداث تغييرات جينية. يمكن معالجة عينات متعددة في تشغيل واحد، والأساليب المناسبة عند تشغيل عينات من التجارب المتوسطة الحجم.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد
DNeasy الدم والأنسجة كيت	QIAGEN	69506
Nucleospin الحمض النووي الريبي الثاني	Macherey-ناجل	740955.50
Epitect كيت بيسلفيت	QIAGEN	59104
Nucleospin مستخلصات	Macherey-ناجل	740609.50
pGEM-T ناقلات الاستنساخ كيت	Promega	A3600
Nucleofast 96	Macherey-ناجل	743100.50
مونتاج 96 تسلسل تنظيف	ميليبور	LSK09624
Hotstar طق البوليميراز	QIAGEN	203203
طق البوليميراز	Fermentas	EP0401