مقالة منهجية

عزل الخلايا المناعية من الأورام الأولية

40.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/3952

⸱

يونيو 16, 2012

 ,  ,  , 
1Tumor Immunity and Tolerance Section, Laboratory of Molecular Immunoregulation, Cancer and Inflammation Program, National Cancer Institute - Frederick

في هذه المقالة

Retraction Notice

This article, Isolation of Immune Cells from Primary Tumors, has been retracted at the request of the corresponding author due to concerns regarding the validity of the data presented in the article.

ملخص

في هذا التقرير، ونحن تصف بروتوكول لعزل السكان عالي النقاء من الكريات البيض التي تتسلل الأورام. ويتم تكييف هذا البروتوكول من بروتوكول للتكنولوجيا الحيوية لتعزيز الغلة Miltenyi والنقاء لعزل الخلايا من أنسجة الورم المعقدة.

الملخص

الأورام المكروية إنشاء مناعة فريدة من نوعها (المكروية الورم، TME) حيث يتم تجنيد الكريات البيض داخل الورم بواسطة كيموكينات المختلفة والنمو 1،2 العوامل. ومع ذلك، مرة واحدة في TME، هذه الخلايا تفقد القدرة على تعزيز مناعة المضادة للورم والبدء في دعم نمو الورم وأسفل تنظيم المضادة للورم الاستجابات المناعية 3-4. وقد ركزت الدراسات على الورم المرتبطة أساسا على الكريات البيضاء خلايا معزولة عن ورم الغدد الليمفاوية أو استنزاف الطحال بسبب الصعوبات الكامنة في الحصول على ما يكفي من أعداد الخلايا والنقاء من الورم الرئيسي. مع تحديد آليات تنشيط الخلايا والاتجار من خلال الجهاز الليمفاوي من الفئران الحاملة الورم المهم، وربما تعطي نظرة إلى حركية الاستجابات المناعية للسرطان، في تجربتنا، الكريات البيض عديدة، بما في ذلك الخلايا الجذعية (DCS)، ورم في استنزاف الغدد الليمفاوية يكون النمط الظاهري مختلفة عن تلك التي تتسلل الأورام 5،6. وعلاوة على ذلك، لقد أثبتنا سابقا أن adoptively-T نقل خلايا معزولة عن ورم الغدد الليمفاوية استنزاف لا tolerized وتكون قادرة على الاستجابة لتحفيز الثانوية في المختبر على عكس خلايا T معزولة عن TME، والتي هي tolerized وغير قادرة على الانتشار أو خلوى إنتاج 7،8. ومن المثير للاهتمام، وقد أظهرنا أن تغيير المكروية الورم، مثل توفير CD4 + T الخلايا المساعدة عن طريق نقل بالتبني، ويعزز CD8 + T للحفاظ على الخلايا الموالية للالتهابات وظائف المستجيب 5. النتائج من كل دراسة من الدراسات التي سبق ذكرها تدل على أهمية قياس الاستجابات الخلوية من خلايا المناعة TME-التسلل بدلا من الخلايا التي تبقى في الهامش. لدراسة وظيفة الخلايا المناعية التي تسلل الأورام باستخدام التكنولوجيا الحيوية العزلة Miltenyi نظام 9، وقمنا بتعديل هذا الإجراء الأمثل العزلة الأجسام المضادة المستندة إلى غاية الحصول على البريدnriched السكان من الخلايا السرطانية مستضد تقديم المستضد والخلايا الليمفاوية T محددة السامة للخلايا. بروتوكول يتضمن تشريح مفصل للأنسجة البروستاتا الفئران من نموذج البروستاتا الورم عفوية (غدية المعدلة وراثيا للماوس البروستات TRAMP) 10 وتحت الجلد القتامي (B16) نموذج الورم تليها تنقية لاحقة من السكان الكريات البيض المختلفة.

البروتوكول

1. عزل خلايا سرطان البروستاتا متعلق بالنخاع الشوكي من TRAMP

  1. وأجريت كافة الإجراءات بتوجيه من حيوان مجلس المراجعة. الفئران TRAMP تطوير عفويا أورام البروستاتا الأصليين نتيجة لالتحوير (SV40) التي تسيطر عليها المروج probasin 10. يمكن استخدام أي ذكر الماوس لهذا الإجراء. في حين يمكن أن تحصد أورام TRAMP في أي عمر، ينبغي الإشارة إلى أن أورام البروستاتا TRAMP تبقى عموما صغيرة حتى تصل الفئران الذين تتراوح أعمارهم أكبر من 20 أسابيع. الموت ببطء الفئران خنقا 2 CO. إزالة الجهاز البولي التناسلي (UGT)، عن طريق خفض مفتوحة التجويف البريتوني وسحب النسيج الشحمي. هو الأنسجة الدهنية، لامعة مزبدة الأنسجة يبحث.
  2. تحديد موقع المثانة، بل تقع مباشرة بين الاثنين حويصلات بيضاء كبيرة، المنوي. التمسك المثانة مع ملقط. حفظ إغلاق المقص، وحد بعيدا الأنسجة الدهنية وتحديد مجرى البول. خفض على شrethra أقرب إلى الزنار الحوضي ممكن، وقطع الأسهر. في حين خفض، وسحب ما يصل في وقت واحد على المثانة. وهذا كله الافراج عن UGT التي يمكن أن تكون الآن الجزئي تشريح للحصول على كل من فصوص من البروستاتا.
  3. وضع UGT في درجة حرارة الغرفة PBS. استخدام المجهر تشريح لتصور واضح بعيدا UGT أي الأنسجة الدهنية الزائدة. باستخدام ملقط، التمسك مجرى البول وجمع الفصوص البطنية، والجانبي الأمامي من البروستاتا. وضع الأنسجة في أثناء جمع PBS بقية الفصوص.
  4. إزالة الحويصلات المنوية والتخلص منها.
  5. تحويل الأنسجة المتبقية 180 درجة. جمع الغدة الأمبولي وفصوص البروستاتا الظهرية.
  6. باستخدام الملقط، وبصرف النظر عن ندف أنسجة البروستات ووضعه في الهضم (التفكك) العازلة.
  7. المكان أنسجة الورم في 1 مل العازلة التفكك (100 U / مل كولاجيناز نوع IV و 100 ميكروغرام / مل الدناز في FBS + RPMI 10٪). كل ورم مايو REQUغضب فريدة ظروف التفكك؛ للأورام البروستاتا TRAMP، استخدم 1 مل وB16 الأورام، استخدم 5 مل (انظر أدناه). ملاحظة: سوف الصف من كولاجيناز (I-IV) تعتمد على السكان الخلية لتكون معزولة؛ النخاعي العزلة الخلية هو أفضل نوع مع IV، بينما العائد اللمفاويات أعلى باستخدام نوع I.
  8. أنبوب مكان في 37 ° C الحاضنة لمدة 30 دقيقة.
  9. ماصة صعودا وهبوطا مع 1 مل ماصة للحصول على تدفق بسهولة التعليق خلية واحدة.
  10. تصفية التعليق من خلال تصفية ميكرون 70 و غسل 3X مع العازلة الفصل تستكمل مع FBS بالاعمال 10٪ لعزل الخلايا النخاعي.
  11. أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية في 400 x ج لمدة 10 دقيقة. شطف ثم بيليه مع 10 مل العازلة بالاعمال وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى مع نفس الإعدادات.
  12. إعادة تعليق بيليه الخلية في 100 ميكرولتر العازلة بالاعمال. المقبل، إضافة 1 ميكروغرام anti-CD16/32 الأجسام المضادة (أ ب) في 10 8 خلايا (200 ميكرولتر الثقافة ورم هجين 2.4.G2 طاف) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: رانه قد كمية الأجسام المضادة FCR-γ حظر (أ ب) لتتم إضافته تختلف تبعا للتردد / عدد FCR-γ + الخلايا في الأنسجة وحجم الخلية التعليق، وبالتالي، هذه الخطوة قد تتطلب التحسين.
  13. إضافة 100 ميكرولتر من "عموم DC" أو 10 ميكرولتر المضادة للCD11b، CD11c للسامية أو المعادية للPDCA-1. MicroBeads في خلايا 8 10 المجموع، اعتمادا على السكان الخلية المطلوبة ملاحظة: كمية MicroBeads المطلوبة قد تختلف تبعا للتردد / عدد الخلايا من السكان المطلوب في الأنسجة، وبالتالي، هذه الخطوة قد تتطلب التحسين.
  14. مزيج جيد من قبل عبها بلطف أنبوب (لا الدوامة) واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4-8 درجة مئوية، محمية من الضوء. لا احتضان على الجليد.
  15. غسل الخلايا عن طريق إضافة 10 مل من العازلة أجهزة ماكينتوش. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
  16. صب قبالة طاف تماما و resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من العازلة أجهزة ماكينتوش. تعليق خلية الورم تدفق أفضل من خلال الأعمدة LC. (أخرىخيارات: MS، LS، LD).
  17. تطبيق جديد لعمود فاصل المغناطيس. رئيس العمود وذلك بدهن مع كمية مناسبة من المخزن المؤقت للعمود بالاعمال المختارة: LC لوالأعمدة MS استخدام 500 ميكرولتر. لLS أو LD الأعمدة استخدام 1 مل. بعد فتيلة العمود، وتطبيق نظام التعليق الخلية على الجزء العلوي من العمود. استخدام عمود واحد لكل 1 × 8 10 خلايا.
  18. جمع الخلايا غير المسماة (المار) وغسل العمود لا تقل عن ثلاث (ما يصل إلى خمسة) مرات مع 500 ميكرولتر حجم لما مجموعه 1،5-2،5 مل من السائل غسيل. أداء غسل الخطوة 1 بإضافة بالاعمال العازلة إلى العمود، ومن المهم للحفاظ على العمود المتدفقة. بمجرد العمود تقطر آخر قطرة، إضافة المزيد من المخزن المؤقت. لا تدع موقف العمود دون تدفق أو السماح لها تجف (هذا لا يمكن التقليل، وتجفيف العمود يمكن أن تدمر النقاء وتؤدي إلى خسائر كبيرة في بقاء الخلية). لخطوة غسيل 2، العمود شطف مع مزيج العازلة التفكك (التي تحتوي على كولاجيناز + الدناز وديمكتوب في الخطوة 1.7)، وهذا بمثابة "أقسى" خطوة للقضاء على غسل الحطام زجة من الخلايا السرطانية الميتة أو التي تحتضر. أداء غسل الخطوة 3 مع العازلة بالاعمال، وإذا كان تدفق من خلال لا تبدو واضحة تماما بعد خطوة الغسيل 3، تستمر لمدة 2 لغسل غسل خطوات إضافية مع العازلة بالاعمال (على ما مجموعه 5 يغسل). للأورام تحت الجلد كبيرة (على سبيل المثال، سرطان الجلد B16)، أثناء الخطوة غسل الماضي، تطبيق ضغط لطيف مع الإصبع القفاز إلى أعلى العمود، وهذا يطلق الحطام إضافي لنظافة وتنقية السكان الخلية. هذا غير مطلوب للأورام الأنسجة الخطوة الصلبة مثل البروستاتا وبدلا من ذلك، استخدم الخطوات غسيل إضافية، وغسل ما مجموعه على الأقل 5-6 مرات.
  19. إزالة عمود من الفاصل المغناطيسي ووضعه على أنبوب جمع مناسبة. ماصة 2 مل من العازلة على العمود. جمع الخلايا المسمى مغناطيسيا من خلال تطبيق بحزم الغواص المتوفرة مع العمود.
  20. عد عدد الخلايا وتأكيد نقاء للسكان الخلية المحددة من قبلتحليل تدفق cytometric. لتحديد السكان DC، علامات اقترح تشمل CD45، CD11c، PDCA 1-، B220 وCD11b. علامات البلاعم اقترح تشمل CD45، CD11b، 80-F4، وLy6C.

2. عزل خلايا T المحول من الأورام تحت الجلد Adoptively الميلانوما B16

هذا البروتوكول يعمل بشكل أفضل مع الأورام التي هي 250 مم 2 أو أقل (قياس المقدرة من قبل أقطار تتوسط للورم).

  1. تم حقن تحت الجلد B16 الخلايا السرطانية في C57BL / 6 الفئران تم تسجيل قياسات الورم وكل يوم 2 8. يصرح باستخدامها في الفئران مع الاورام قياس 250 مم 2 بواسطة الخنق 2 CO. باستخدام الأدوات الجراحية تعقيمها تشطف مع ETOH 70٪، وخفض الورم إلى أجزاء (<3MM) الصغيرة واحتضان في 5 مل حل التفكك (RPMI متوسطة تستكمل مع 5٪ FBS، كولاجيناز النوع الأول (200 U / مل) والدناز I (100 ميكروغرام / مل)) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، Pipetting (باستخدام μ 1000تلميح ل الماصة) وvortexing كل 10 دقائق خلال الحضانة. إذا كان سيتم في وقت لاحق عزل خلايا الدم النخاعي، استبدل 5٪ FBS وكولاجيناز اكتب I FBS مع 10٪ وكولاجيناز النوع الرابع (200 U / مل) على التوالي.
  2. بعد الحضانة، وتمرير التعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 70 و ميكرومتر غسل مرتين مع 10 مل العازلة بالاعمال (أعدت في تعليمات الشركة الصانعة، Miltenyi التكنولوجيا الحيوية). اختياري - للأورام كبيرة جدا (> 300 مم 2)، يمكن خلايا التهابية مسبقا المخصب باستخدام الطرد المركزي المتدرج الكثافة (أو Percoll Ficoll).
  3. نضح طاف يغسل وإضافة 1 ميكروغرام anti-CD16/32 antibody/10 8 خلايا (200 ميكرولتر من طاف استنساخ ثقافة 2.4.G2) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  4. دون غسل، إضافة 1 ميكروغرام الأضداد المضادة للThy1.1 PE في خلايا 8 10، تخلط جيدا بواسطة أنبوب عبها بلطف واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد، محمية من الضوء.
  5. غسل الخلايا لإزالة الحزب الثوري المؤسسي غير منضممريم الأجسام المضادة بإضافة 10 مل العازلة بالاعمال وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق.
  6. نضح طاف وإضافة 20 ميكرولتر مكافحة PE microbeads (Miltenyi التكنولوجيا الحيوية) في 10 7 خلايا الكلية، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  7. مزيج جيد من قبل عبها بلطف أنبوب (لا الدوامة) واحتضان عند 4 ° C (لا تستخدم الثلج) لمدة 15 دقيقة، محمية من الضوء. تنبيه: vortexing يمكن أن تضعف سلامة الخرز.
  8. غسل الخلايا عن طريق إضافة 10 مل من العازلة أجهزة ماكينتوش وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق.
  9. نضح طاف الخلايا، و resuspend في 500 ميكرولتر العازلة بالاعمال. لأورام حجم أكبر (> 300 مم 2)، استخدم 1 مل العازلة.
  10. مكان واحد LC (الخلية الكبيرة) في العمود الفاصل المجال المغناطيسي. تعليق خلية الورم تتدفق من خلال هذه الأعمدة أفضل. شطف العمود مع 500 ميكرولتر العازلة بالاعمال لرئيس العمود. فإن معظم أورام تتدفق أيضا من خلال LS والأعمدة LD، ولكن تحتاج إلى مزيد من الهضم ود الميكانيكيةisruption لتحقيق المستوى المناسب من التعليق خلية واحدة. غسل العمود مع 1 مل العازلة بالاعمال لرئيس العمود.
  11. تطبيق التعليق على الخلية العمود والسماح بالتدفق تماما من خلال (دون السماح المدى العمود الجاف). المقبل، وغسل مع 500 ميكرولتر العازلة بالاعمال، وكرر غسل 3X. فقط إضافة جديدة عازلة عند الخزان العمود فارغة، ولكن لا تدع العمود تقف دون تدفق. سيؤدي ذلك انسداد والنقاء تقلص.
  12. هذا هو خطوة حاسمة للأورام تحت الجلد كبيرة: بعد غسل الخطوة الأخيرة، مع تلميح إصبع القفاز، وتطبيق ضغط لطيف على الجزء العلوي من العمود في حين لا يزال على فاصل المغناطيسي. هذه النشرات الحطام إضافية لسكان اكثر بحتة المخصب. المقبل، وغسل العمود 1 المزيد من الوقت مع 500 ميكرولتر العازلة بالاعمال.
  13. إزالة عمود من الفاصل ووضعه في أنبوب 15 مل المخروطية نظيفة، إضافة 2 مل العازلة بالاعمال على العمود. طرد سل مغناطيسيا التي تحمل علاماتLS عن طريق دفع المكبس بقوة في العمود.
  14. أجهزة الطرد المركزي لجزء مزال في 400 x ج لمدة 5 دقائق. النقاء في هذه الخطوة هو عادة بين 75-80٪. لتحقيق> نقاء 90٪، كرر الإجراء الفصل المغناطيسي كما هو موضح في الخطوة 1،10-1،12 باستخدام MS العمود الجديد. العمود MS أصغر وأكثر إحكاما وبالتالي فإن التعليق سيتم تشغيل أكثر ببطء من خلال العمود، ولكن سيحقق أعلى الأرقام ونقاء الخلية من الاهتمام.
  15. عد عدد الخلايا للمزيد من التجارب والتحقق من النقاء عن طريق تحليل تدفق cytometric. لعزل خلايا T adoptively نقل مثل تلك المبينة في هذا البروتوكول، وعلامات لتحديد أليلية تشمل CD45 وThy1.1 (خلايا نقل) وThy1.2 (المضيف خلايا T).

3. ممثل النتائج

سوف العائد من السكان خلية معينة (أي الضامة، DC، T الخلية، وما إلى ذلك) تختلف تبعا لحجم الورم والعلاجات التي كانت الادارةistered خلال نمو الورم. وينبغي أن يكون من دون علاج البروستاتا 14-16 الماوس الأسبوع TRAMP القديمة العائد بين 5-8X10 1x10 6 CD11c + /-1 + PDCA (DC) في خلايا النقاء 90-95٪ أو 1x10 6 1.5x10 6 F4/80 + / CD11b + (الضامة) في 80-90٪ من النقاء 300 ملغ من الأنسجة بعد بروتوكول العزلة أعلاه كما هو مبين في الشكل 1. عدد كل من هذه الخلايا يزيد قليلا على نقل بالتبني من ورم الخلايا T-مستضد محددة. نقاء الفقيرة وعادة ما يكون نتيجة لعدم كفاية غسل، والسماح للعمود حتى يجف (والتي يمكن أن تؤدي إلى احتباس الحطام ورم في العمود)، أو منع غير كافية التيسير مستقبلات.

وبالمثل، فإن الخلايا المعزولة من مجموع الأورام B16 تختلف أيضا تبعا لحجم الورم في وقت الحصاد ونقل الأنسجة من الخلايا T بالتبني (نقل 5x10 6) مع أو بدون لقاح DC (نقل 1x10 5). عدد قليل جدا من مستضد جمعية مهندسي البترولcific خلايا T التسلل الورم دون اعطاء لقاح DC مستضد بعد يوم واحد نابض نقل الخلايا T. إذا كانت تدار لقاح DC إلى ماوس تحمل، واضح الصغيرة (<50 مم 2) الورم، عائد من حوالي 5 3x10 خلايا T + Thy1.1، مع نقاء 80-85٪، يعتبر جيدا " "الحصاد كما هو مبين في الشكل 2A. ومع ذلك، إذا يتم حصاد أكبر الأورام، سيتم تخفيض العائد الكلي والنقاء.

الضامة (F4/80 + / CD11b +) وعادة ما تكون نسبة أقل من الخلايا B16 في مجموع الأورام. الشكل 2B يبين أن استخدام CD11b، من الورم الذي هو 250 مم 2، ينتج حوالي 1x10 6 الضامة في نقاء 90-95٪ . بالإضافة إلى ذلك الشكل 2B، يدل على أن السكان في العاصمة B16 الأورام غير متجانسة. على عكس الأورام البروستاتا، واثنين من مجموعات سكانية فرعية: CD11c + /-1 + PDCA (بلازماوية الشكل DC) وCD11cويمكن الحصول على (DC التقليدية) من أورام سرطان الجلد B16 - + /-1 PDCA. ومن المتوقع يقدر ب 6 2X10 PDC ومنها 4x10 6 من 250 مم B16 الأورام 2 في نقاء 80-90٪. نقاء خفض وعادة ما يكون نتيجة لعدم إزالة أورام الخلايا من العمود. خطوة 2،12 خطوة حاسمة لإزالة أجمة صغيرة من خلايا سرطان الجلد الذي لا يزال قائما في قاعدة العمود. بعد هذه الخطوة يحسن من فعالية الخطوات والنتائج في غسل أفضل النقاء.

figure-protocol-1
الشكل 1. البلدان النامية (CD11c + /-1 + PDCA) والضامة (F4/80 + / CD11b +) تم عزل من ورم البروستاتا TRAMP. القيم مؤامرة نقطة تمثل نسبة الخلايا ذات الاهتمام قبل أو تنقية آخر.

figure-protocol-2
الشكل 2 (A) Adoptivنقل اعل Thy1.1 + / CD8 + T والخلايا (B) النخاعي الخلايا بما في ذلك CD11c + /-1 + PDCA بلازماوية الشكل البلدان النامية، CD11c + / PDCA-1 - تم عزل البلدان النامية التقليدية وF4/80 + / + CD11b الضامة تحت الجلد من B16 الورم القتامي من الفئران + Thy1.2. القيم مؤامرة نقطة تمثل نسبة الخلايا ذات الاهتمام قبل أو تنقية آخر.

المناقشة

يمكن تعديل هذا البروتوكول، على أساس حجم ومصدر للورم (تحت الجلد، ورم عفوية، أو الأورام مثلي). للحصول على أكبر الأورام، فمن المستحسن أن زيادة كمية العازلة التفكك، عازلة أجهزة ماكينتوش، وعدد من يغسل. يمكن للالود للخلايا معزولة تعتمد على TME التي يجري المخصب فيها. على سبيل المثال، في تجربتنا، وخلايا معزولة عن أورام البروستاتا عفوية تتطلب ألطف تفارق من الخلايا المعزولة من الأورام تحت الجلد القتامي B16. خلال تشريح الورم، والقضاء على الكثير كما الدهنية، والجلد، أو غيرها من الحطام التي يمكن أن تمنع تفكك الأنزيمية فعالة. فمن الأهمية بمكان لهضم تماما الورم الجماهير والحصول على تعليق خلية واحدة لضمان حسن أب وضع العلامات ومنع أعمدة من انسداد. لعزل الخلايا النخاعي، تمت زيادة كمية المصل البقري الجنين الموصى بها في المخزن المؤقت بالاعمال العزلة من 2٪ إلى 10٪ لتحسين بقاء الخلية. بل هو أيضا ESSEntial للحفاظ على جميع مخازن والخلايا الباردة في جميع أنحاء بروتوكول لمنع غير محددة ملزمة أب وانسداد العمود. في الختام، للحصول على السكان عالي التخصيب من الخلايا مستضد تقديم المستضد وورم الخلايا الليمفاوية T محددة السامة للخلايا، وقمنا بتعديل الأمثل إجراء العزلة الأجسام المضادة القائمة على الاستفادة من التكنولوجيا الحيوية Miltenyi. استخدام هذا البروتوكول، يمكن نقل السكان على حد سواء المخصب adoptively والكريات البيض الذاتية باستخدام القيمة المطلقة الموجهة ضد علامات سطح الخلية نوع على حدة. ميزة واحدة من الإجراءات المذكورة هو الحد من الحطام الورم المرحل بعد غسل واسعة وصارمة. وهذا يشمل استخدام كولاجيناز في المخزن المؤقت غسل وكذلك تحديد النقطة التي واضاف الضغط على العمود يمكن القضاء على قباقيب عمود من الخلايا السرطانية. يمكن الحصول على عدد كاف من الخلايا المناعية الأنسجة من، وخاصة في نقاء التي هي مناسبة لتحليل وظيفي، يمكن أن يكون مهمة صعبة.ومع ذلك، في تجربتنا، وبروتوكول ينتج هنا أكبر عدد من الخلايا، في أكبر النقاء، مع معظم الاتساق.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم الإفصاحات ذات الصلة.

شكر وتقدير

فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور سكوت دورهام لإعادة النظر في مخطوطة والفيديو. ويدعم هذا العمل في جزء من برنامج البحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة، NCI.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكاشف شركة CATALOUGE عدد التعليقات
I كولاجيناز Gibco 17100-017 استخدم عند اختيار لخلايا T
كولاجيناز IV Gibco 17104-019 استخدم لاختيار النخاعي
الدناز Calbiochem 260913
RPMI Gibco 21870
Dulbecco في PBS Lonza 17-5158
مصل بقري جنيني Lonza 14-501F
بالاعمال العازلة 2٪ FBS للخلايا T
10٪ FBS لخلايا الدم النخاعي
Thy1.1 PE 551401
مكافحة PE microbeads Miltenyi التكنولوجيا الحيوية 120-000-294
مكافحة عموم DC microbeads Miltenyi التكنولوجيا الحيوية 120-003-183
مكافحة CD11b microbeads Miltenyi التكنولوجيا الحيوية 120-000-300
LC العمود Miltenyi التكنولوجيا الحيوية 130-042-202
MS العمود Miltenyi التكنولوجيا الحيوية 130-042-201

المراجع

  1. Shurin, M. R. Intratumoral cytokines/chemokines/growth factors and tumor infiltrating dendritic cells: friends or enemies. Cancer Metastasis Rev. 25, 333-356 (2006).
  2. Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Res. 66, 605-612 (2006).
  3. Anderson, M. J., Shafer-Weaver, K., Greenberg, N. M., Hurwitz, A. A. Tolerization of tumor-specific T cells despite efficient initial priming in a primary murine model of prostate cancer. J. Immunol. 178, 1268-1276 (2007).
  4. Ganss, R., Hanahan, D. Tumor microenvironment can restrict the effectiveness of activated antitumor lymphocytes. Cancer Res. 58, 4673-4681 (1998).
  5. Shafer-Weaver, K. A. Immunity to murine prostatic tumors: continuous provision of T-cell help prevents CD8 T-cell tolerance and activates tumor-infiltrating dendritic cells. Cancer Research. 69, 6256-6264 (2009).
  6. Watkins, S. K., Zhu, Z., Riboldi, E., Shafer-Weaver, K. A., Stagliano, K. E. R., Sklavos, M. M., Ambs, S., Yagita, H., Hurwitz, A. A. Foxo3a programs tumor associated dendritic cells to become tolerogenic in Human and Murine Prostate Cancer. Journal of Clinical Investigation. 121, (2011).
  7. Shafer-Weaver, K. A., Hurwitz, A. A. Tumor-Specific CD8+ T Cells Infiltrating Prostatic Tumors are Induced to Become Suppressor Cells. , (2009).
  8. Singh, V., Ji, Q., Feigenbaum, L., Leighty, R. M., Hurwitz, A. A. Melanoma progression despite infiltration by in vivo-primed TRP-2-specific T cells. J. Immunother. 32, 129-139 (2009).
  9. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification. J. Vis. Exp. (9), e409(2007).
  10. Hurwitz, A. A., Foster, B. A., Allison, J. P., Greenberg, N. M., Kwon, E. D. The TRAMP mouse as a model for prostate cancer. Curr. Protoc. Immunol. Chapter 20, (2001).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عزل الخلايا المناعيةالورم الأوليالبيئة المجهرية للورمتنقية الكريات البيضاءنظام Miltenyi Biotechورم البروستاتا TRAMPنموذج ميلانوما B16الجزء الوعائي السدويقياس التدفق الخلويمؤشرات سطح الخلية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.