تصور منظمة اللحاء وحيوية في الكائنات الدقيقة، وذلك باستخدام المجموع الإسفار التأمل الداخلي المجهر

Summary

مجموع داخلي التأمل الإسفار (TIRF) المجهري هو نهج قوي لمراقبة الهياكل على مقربة من سطح الخلية في التباين العالي وقرار مؤقت. علينا أن نبرهن كيف يمكن توظيف TIRF لدراسة ديناميات البروتين في خلايا قشرة جدار المغلقة الخلية البكتيرية والفطرية.

Abstract

وقد برزت TIRF المجهري باعتبارها تكنولوجيا التصوير قوية لدراسة المكانية والزمانية ديناميكية الجزيئات فلوري في التجارب المختبرية والخلايا الحية ^1. هذه الظاهرة البصرية من الانعكاس الداخلي الكامل يحدث عندما يمر الضوء من وسط معامل الانكسار مع ارتفاع في متوسط ​​معامل الانكسار مع انخفاض في زاوية أكبر من زاوية حرجة مميزة (أي أقرب إلى كونه بالتوازي مع الحدود). على الرغم من أن ينعكس كل الضوء مرة أخرى في ظل هذه الظروف، يتم إنشاء موجة زائل التي تنتشر عبر وعلى طول الحدود، والذى يضمحل بشكل كبير، مع المسافة، وتخترق المناطق فقط عينة التي هي 100-200 نانومتر بالقرب من واجهة ^2. بالإضافة إلى تقديم قرار محوري متفوقة، وإثارة انخفاض من أصل fluorophores التركيز يخلق إشارة إلى نسب عالية جدا من الضوضاء ويقلل من الآثار الضارة للphotobleaching ^2،3. كونها تقنية widefield، TIRF يسمح أيضا أسرع AC صورةquisition من مسح معظم الاجهزة مبائر القائم.

للوهلة الأولى، عمق الاختراق المنخفض للTIRF يبدو لتكون متوافقة مع التصوير من الخلايا البكتيرية والفطرية، والتي غالبا محاطة بجدران سميكة الخلية. على العكس من ذلك، وجدنا أن جدران الخلايا من خميرة وخلايا بكتيرية فعلا على تحسين قابليتها للاستخدام من TIRF وزيادة مجموعة من الهياكل ملاحظتها ^4-8. وبالتالي، يمكن العديد من العمليات الخلوية يمكن الوصول إليها مباشرة بواسطة الكائنات الحية الدقيقة TIRF في صغير وحيد الخلية، والتي غالبا ما تقدم قوي تقنيات التلاعب الجيني. وهذا يسمح لنا لأداء التجارب في الكيمياء الحيوية الحية، حيث يمكن حركية التفاعلات البروتينية والأنشطة المقررة مباشرة في الخلايا الحية.

نحن هنا وصف الخطوات الفردية المطلوبة للحصول على صور عالية الجودة للTIRF خميرة الخباز أو عصيات الخلايا الرقيقة. نشير إلى مختلف المشاكل التي يمكن أن affeط م TIRF تصور تحقيقات فلوري في الخلايا وتوضيح إجراءات تطبيق مع أمثلة عدة. أخيرا، علينا أن نبرهن كيف يمكن الصور TIRF تحسينها باستخدام تقنيات استعادة صورة ثابتة.

Protocol

1. عينة تحضير

1. إعداد قسائم الغطاء
   يجب تنظيف Coverslips من جزيئات الغبار وTIRF حساسة للإشارات خلفية الناشئة عن ساترة (الشكل 1A، فيلم 1).
   1. باستخدام ملقط زلات غطاء مكان في حامل السيراميك مع غطاء.
   2. ملء إناء زجاجي مع هيدروكسيد الصوديوم M 1 (يمكن إعادة استخدامها عدة مرات).
   3. احتضان لمدة 2 ساعة تحت تناوب متواصل بطيء (المداري شاك....

Discussion

TIRF المجهري هو الأسلوب المفضل للبروتينات صورة هامشية. عمق الاختراق المنخفض للمجال زائل يقلل من الخروج من ضوء التركيز، الأمر الذي يؤدي إلى إشارة جيدة للغاية لنسبة الضوضاء، ويتيح الحصول على البيانات مع ارتفاع معدلات الإطار، أو التصوير من البروتينات ضعيف جدا التي أعرب عنها. مزيج من التباين العالي وارتفاع معدلات الإطار يجعل TIRF المجهري أداة مثالية لديناميات المكانية والزمانية والتصوير من البروتينات المترجمة cortically. ومن المثير للاهتمام أن جدار الخلية سميك المحيطة بها العديد من ال.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الأداة / كاشف	نوع	شركة	فهرس العدد
شاكر المداري	أداة	UniEquip	UNITWIST 3-D ROCKER شاكر
TIRF المجهر	حتى		مخصصة الإعداد
زجاج حاوية	أداة	Vitlab	340-232880353
السيراميك تلطيخ رف	أداة	توماس الخيال العلمي.	8542E40
كونكانافالين A	الكاشف	سيغما	L7647
Coverslips # 1 (18 × 18 مم)	مجهر	منزل جلاسر	BB018018A1
مجهر الشرائح	مجهر	منزل Gالليزر	AA00000102E
غمر النفط	مجهر	زييس	Immersol 518F
الاغاروز	الكاشف	إينفيتروجن	16500-500
FluoSpheres	الكاشف	إينفيتروجن	F8795