هذه الدراسة توضح وضع في المختبر تقنية electroporation التي تسمح للتلاعب في التعبير الجيني في الشفة السفلى معيني الشكل من الأجنة midgestation.
مقالة منهجية
هذه الدراسة توضح وضع في المختبر تقنية electroporation التي تسمح للتلاعب في التعبير الجيني في الشفة السفلى معيني الشكل من الأجنة midgestation.
الشفة المعينية هو الظهارة العصبية الجنينية الموجودة في الدماغ المؤخر على مفترق الطرق بين الأنبوب العصبي وroofplate من البطين الرابع (استعرضت في 1). ويمكن تقسيم الشفة المعينية إلى الشفة العليا والمعينية (URL) الذي يضم قسيم معيني 1 (R1) وتولد الخلايا العصبية في المخيخ، والشفة السفلى المعينية (LRL) والذي يؤدي إلى تنوع السلالات الدماغ العصبية 2-4. وتشمل المشتقات LRL الخلايا العصبية السمعية من نوى القوقعة وتلك التابعة للنوى precerebellar التي تشارك في تنظيم التوازن والتحكم في المحركات 5-8. تكوين الخلايا العصبية من خلال LRL يحدث النافذة الزمنية الكبيرة التي تشمل أيام الجنينية (E) 9،5-16،5 5 و 9. الأنساب العصبية المختلفة على الخروج من LRL كخلايا تالية للتفتل (أو يولدون) خلال أيام تنموية متميزة خلال هذه النافذة العصبية.
ويمكن استخدام Electroporation من بنيات التعبير الجيني للالتلاعب في التعبير الجيني في LRL الأسلاف، ويمكن تغيير محتمل في مصير الخلايا العصبية التي تنتج من هذه المنطقة 10-12. وكان تغيير الجينات من الأسلاف LRL في الماوس عبر في الرحم electroporation ناجحة للغاية لمعالجة الأنساب ولدت في يوم الجنينية E12.5 أو 10 في وقت لاحق، 12-14. في electroporations الرحم قبل E12.5 لم تكلل بالنجاح في المقام الأول نظرا ل الفتك المرتبطة ثقب roofplate البطين الرابع، خطوة ضرورية في تقديم الحمض النووي الخارجية التي يتم electroporated في LRL. ومع ذلك، فإن العديد LRL الأنساب المستمدة تنشأ من LRL في وقت سابق من E12.5 9. هذه النسب في وقت سابق من مواليد تشمل الخلايا العصبية التي تشكل شبكي الوحشي، الإسفينية الخارجية، ونوى الزيتونية السفلية للنظام precerebellar التي تعمل على ربط مدخلات من النخاع الشوكي والقشرة في المخيخ 5. من أجل التعامل مع التعبير في LRLمن الأجنة الذين تقل أعمارهم عن E12.5، قمنا بتطوير نظام 1 في المختبر في الأجنة التي يتم وضعها في الثقافة بعد electroporation.
تقدم هذه الدراسة وسيلة فعالة وفعالة من أجل التلاعب في الجينات من الأسلاف LRL في E11.5. الأجنة electroporated مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP) طردوا من المروج CAG نشط على نطاق واسع وأعرب بتكاثر GFP بعد 24 ساعة من ثقافة. وهناك جانب حاسم من هذا الفحص هو أن يتم تبديل فقط التعبير الجيني بسبب التعبير عن الجينات خارجية وليس بسبب الآثار الثانوية التي تنتج عن electroporation وتقنيات زراعة. وقد تقرر أن أنماط التعبير الجيني الذاتية لا تزال دون عائق في الأجنة electroporated والمثقفين. ويمكن استخدام هذا الاختبار لتغيير مصير الخلايا الناشئة من LRL الأجنة الذين تقل أعمارهم عن E12.5 من خلال إدخال البلازميدات لoverexpression أو هدم (من خلال رني) من مختلف الموالية للعوامل النسخ العصبية.
1. وقبل Electroporation الاستعدادات
2. الجنينية الحصاد
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
وفي تقنية electroporation المختبر التي قدمت في هذه الدراسة هو منهج الرواية التي يمكن استخدامها بكفاءة لمعالجة الجينات في الأجنة الذين تقل أعمارهم عن 12 يوما من الحمل. وضع الأجنة في الثقافة يسمح التعبير عن الجينات المدخلة وتلتف على الفتك لاحظ عندما يسمح لأجنة electroporated أن تبقى في الجسم الحي. هذا الأسلوب يسمح للتلاعب في التعبير الجيني في الأسلاف الجنينية التي كان يتعذر الوصول إليها سابقا لelectroporation المستندة إلى دراسات.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
فإن الكتاب أود أن أشكر جين جونسون لNgn1، Math1، والأجسام المضادة Ptf1a وكوني Cepko لpCAG :: GFP البلازميد. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة 1R15HD059922 R15-01.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليق (اختياري) |
| ناظم البرد | لايكا | CM-1850 | |
| تعامل البيولوجيا طرف Dumoxel دومون ملقط | العلمي أدوات غرامة | 11252-30 | |
| 20 ملعقة موريا ملم مثقوبة | العلمي أدوات غرامة | 10370-17 | |
| ECM موجة مربع 830 Electroporation مولد | BTX (VWR) | 47745-928 | |
| هارفارد جهاز Tweezertrodes 7 ملم * الأقطاب الكهربائية | BTX (فيشر) | BTX450165 | |
| فيشر Isotemp CO 2 حاضنة | الصياد | 1325525 | |
| نابكو ثاني منظم غاز 2 | الصياد | 15497020 | |
| 12 زراعة الأنسجة حسنا لوحات | دينار بحريني الصقر (فيشر) | 877229 | |
| HyClone سائل الإعلام DMEM/F-12 (1:1)، مع الجلوتامين-L وHEPES؛ 500mL | الحرارية العلمية (فيشر) | SH3002301 | |
| HyClone * المانحة فرسي المصل | الحرارية العلمية (فيشر) | SH3007402 | |
| الأبقار مصل الجنين، ومؤهل، الحرارة المعطل | إينفيتروجن | 16140-063 | |
| cellgro * 10،000 وحدة دولية البنسلين، 10000 ميكروغرام / مل الستربتوميسين | Mediatech (فيشر) | MT-30-002-CI | |
| HyClone * L-L-الجلوتامين الجلوتامين، و 200mM في كلوريد الصوديوم 0.85٪ | الحرارية العلمية (فيشر) | SH3003401 | |
| سريع والخضر | الصياد | AC41053-0250 | 0.01٪ |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن