مقالة منهجية

وα الاختبار: رابيد تعداد CD4 خالية من الخلايا عن طريق اللعاب الجامعة

12.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/3999

⸱

مايو 16, 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Weill Cornell Medical College , 2Department of Oral Biology, University of Missouri-Kansas City-School of Dentistry, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Missouri Kansas City- School of Pharmacy, 4Regional Hospital, Bamenda, NWP, Cameroon, 5Mezam Polyclinic HIV/AIDS Treatment Center, Cameroon, 6Institute for Human Genetics and Biochemistry

في هذه المقالة

ملخص

ووصف طريقة تعداد CD4، وα اختبار، والذي يستخدم لعاب كامل لتوفير سريعة ودقيقة CD4 التهم. وα اختبار تكاليف البنسات ويلغي الحاجة لتقنية الكواشف، والتدريب مكلفة مثل الاجسام المضادة، والأجهزة، والتبريد، ونقل العينات، فضلا عن جمع ومعالجة الدم.

الملخص

هناك حاجة ملحة لتوفير طريقة ميسورة التكلفة لتعداد خلايا CD4 لمراقبة مرض HIV. إن تعداد خلايا CD4 بعيد المنال في المناطق محدودة الموارد بسبب القيود المتعلقة بالوقت ودرجة الحرارة، والتعقيد التقني، وتكلفة الكواشف، لا سيما الأجسام المضادة أحادية النسيلة لقياس CD4 على خلايا الدم، وهي الطريقة الوحيدة المقبولة حالياً. وتتمثل إحدى الاستراتيجيات المختبرية الشائعة لتوفير التكلفة والوقت في حساب قيم دموية معينة بدلاً من قياسها. فعلى سبيل المثال، يتم حساب مستويات LDL باستخدام المستويات المقاسة للكوليسترول الكلي، وHDL، والدهون الثلاثية1. وبناءً على ذلك، فإن تحديد الارتباطات الخالية من الخلايا التي تنظم بشكل مباشر عدد خلايا T ذات النمط CD4+ قد يوفر طريقة دقيقة لحساب تعداد CD4 نظراً للأهمية الفسيولوجية لهذه الارتباطات.

يتم تحديد عدد الخلايا الجذعية التي تدخل الدم والمقدر لها أن تصبح خلايا T من نوع CD4+ منتشرة عن طريق الكيموكين CXCL12 ومستقبله CXCR4 نظرًا لتأثيرهما على الحركة2. كما يتم تنظيم عملية انتقال الخلايا الجذعية إلى الدم بشكل إضافي بواسطة إيلاستاز الكريات البيضاء البشرية الموجود على سطح الخلية (HLECS) ومثبط البروتيناز α1 النشط المتفاعل مع HLECS (α1PI, α1antitrypsin, SerpinA1)3. في مرض HIV-1، يتم تثبيط α1PI بسبب عمليات المرض 4. وفي الفئات المبكرة غير المصحوبة بأعراض من مرض HIV-1، وُجد أن α1PI النشط كان أقل من المستويات الطبيعية في 100% من مرضى HIV-1 غير المعالجين (الوسيط=12 μM)، ويصل إلى المستويات الطبيعية خلال الفئات المصحوبة بأعراض4, 5. وقد عُزي هذا النمط إلى التعطيل المناعي، وليس إلى عدم كفاية التصنيع، أو التعطيل البروتيني، أو الأكسجة. لقد لاحظنا أنه في الأشخاص المصابين بـ HIV-1 الذين لديهم >220 CD4 cells/μl، كانت أعداد CD4 مرتبطة بمستويات مصل α1PI النشط (r2=0.93, p<0.0001, n=26) وα1PI غير النشط (r2=0.91, p<0.0001, n=26) 5. أدى إعطاء α1PI للأشخاص المصابين وغير المصابين بـ HIV-1 إلى زيادات كبيرة في أعداد CD4، مما يشير إلى أن α1PI يشارك في تنظيم عدد خلايا T من نوع CD4+ في الدم 3.

عند التحفيز، يحتوي اللعاب الكامل على كمية كافية من النضح المَصلي (بلازما تحتوي على مواد بروتينية تمر عبر جدران الأوعية الدموية إلى اللعاب) بما يسمح بقياس α1PI النشط، ويُعد ارتباط هذا القياس دليلاً على أنها طريقة دقيقة لحساب تعداد خلايا CD4. باختصار، تعمل المواد المحفزة للإفراز اللعابي مثل علكة المضغ أو حمض الستريك على تحفيز نضح المصل في لعاب الفم الكامل. وبعد تحفيز نضح المصل، يتم قياس نشاط α1PI المصلي في اللعاب من خلال قدرته على تثبيط نشاط الإيلاستاز. ويُعد الإيلاستاز البنكرياسي الخنزيري (PPE) مصدراً متاحاً وغير مكلف للإيلاستاز. يرتبط PPE بـ α1PI مكوناً معقداً بنسبة واحد إلى واحد، مما يمنع PPE من شطر ركائزها المحددة، والتي أحدها هو الببتيد اللوني succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA3NA). وتسمح حضن اللعاب مع تركيز مشبع من PPE لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة بارتباط PPE بجميع جزيئات α1PI النشطة في اللعاب. ويمكن قياس التثبيط الناتج لـ PPE بواسطة α1PI النشط عن طريق إضافة ركيزة PPE وهي SA3NA (الشكل 1). ورغم أن تعداد CD4 يُقاس بدلالة حجم الدم (CD4 cells/μl)، فإن تركيز α1PI في اللعاب يرتبط بتركيز المصل في اللعاب، وليس بحجم اللعاب نظراً لأن الحجم قد يتفاوت بشكل كبير خلال اليوم ومن شخص لآخر6. ومع ذلك، فإن جميع البروتينات الموجودة في اللعاب تقريباً تعود لمحتوى المصل، ومحتوى البروتين في اللعاب قابل للقياس7. وبناءً على ذلك، يتم حساب α1PI النشط في اللعاب كنسبة إلى محتوى بروتين اللعاب ويُطلق عليه مؤشر α1PI. وتُظهر النتائج المعروضة هنا أن مؤشر α1PI يوفر طريقة فسيولوجية دقيقة ومحددة لحساب تعداد CD4.

البروتوكول

1. إعداد الطازجة حلول العمل

  1. التخزين المؤقت 0.05 متر تريس المالحة، ودرجة الحموضة 7.8 (TBS): TBS. تحضير 60 مل TBS / microplate.
  2. معدات الوقاية الشخصية: خنزيري إيلاستاز البنكرياس، نوع 1 (PPE) وعلى النحو المنصوص عليه تعليق. يهز جيدا وتخفف من وسائل الحماية الشخصية في TBS إلى ما يقرب من 0.01 يو / مل. إعداد 6 مل العمل حل / microplate).
  3. SA 3 NA: Succinyl-L-علاء-L-علاء-L-علاء-P-nitroanilide (SA 3 NA). تحضير 0.1 M الأسهم SA حل NA 3 في سلفوكسيد ميثيل (DMSO) واستخدامها على الفور أو تخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. إعداد 6ml حل الفريق / microplate بواسطة تمييع الأسهم SA حل NA 3 1/100 في TBS.
  4. COOMASSIE BLUE: تحضير محلول المخزون بنسبة 10٪ الزرقاء الرائعة Coomassie R-250 (Coomassie الأزرق) في TBS واستخدامها على الفور أو متجر عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. إعداد 6 مل حل الفريق من قبل تمييع الحل الأوراق المالية 1/1000 في TBS.

2. إعداد اللعاب

  1. جمع اللعاب: في وضع الوقوف، وتحفيز نضح المصل في اللعاب من خلال وضع مدر اللعاب مثل حمض الليمون أو العلكة في الفم. قطرة ليمون خالية من السكر غير مريحة للمرضى-1 فيروس نقص المناعة البشرية الذين هم أدرد في كثير من الأحيان وغير قادر على مضغ العلكة. ابتلاع حسب الحاجة ل3 دقيقة الأولى، وجمع كل لعاب الفم في كوب توج ل3 دقيقة المقبل. وهذا سيوفر حوالي 2 مل من اللعاب. استخدامها على الفور أو في تخزين -80 درجة مئوية.
  2. المناولة اللعاب: إذا المجمدة عينة ذوبان الجليد، على 37 درجة مئوية ومكان على الجليد. تخزين عينة طازجة أو مذاب في 2-4 درجة مئوية لا تزيد عن 3 أيام. لعاب لا تفعل وتجنب دوامة pipetting الميوسين الذي لا يحتوي على مصل الدم الافرازات. استخدام الاحتياطات العادية عند التعامل مع لعاب http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf .

3. Microplate مجموعة المتابعة

  1. BUFFER: يتم إجراء قياسات في ثلاث نسخ. إلى كل بئر من لوحة microtiter يضاف 130 TBS ميكرولتر.
  2. عينات: إلى كل اختبار جيد، يضاف لعاب 20 ميكرولتر عن الحجم النهائي من 150 ميكروليتر / جيد. مزيج من قبل pipetting دون إدخال فقاعات.
  3. الضوابط: التحكم إيجابي على معدات الوقاية الشخصية، ولكن لا لعاب. سيطرة سلبية يحتوي اللعاب، ولكن لا PPE.To سيطرة إيجابية جيدا يضاف 20 TBS ميكرولتر. لسيطرة سلبية تماما يضاف لعاب 20 ميكرولتر.
  4. PPE الحضانة: هزة PPE حل يعمل بشكل جيد. إضافة 50 عامل PPE ميكرولتر حل كل بئر باستثناء آبار مراقبة سلبية. إلى آبار مراقبة سلبية، إضافة 50 TBS ميكرولتر. احتضان 10 دقيقة في 23 درجة مئوية.
  5. التحضين الركيزة: أضف 50 ميكرولتر SA حل NA 3 العمل على كل بئر. احتضان 45 دقيقة في 23 درجة مئوية.
  6. COOMASSIE BLUE: أضف 50 ميكرولتر حل الأزرق Coomassie العمل < / لى>
  7. قراءة-OUT: اقرأ الامتصاصية في قارئ microplate، ونانومتر 405 للكشف عن انشقاق NA SA (3) الذي يمثل نشاطا α 1 PI وألف نانومتر 595 للكشف عن Coomassie الأزرق الذي يمثل نسبة البروتين.

4. α حساب مؤشر بي 1

  1. تطبيع المتوسط ​​نانومتر 405 و 595 ألف نانومتر: للحصول على كل ثلاث نسخ، وحساب متوسط. طرح متوسط ​​مراقبة سلبية من متوسط ​​العينة. للتقليل من لوحة إلى لوحة الاختلاف، وتطبيع المتوسطات بقسمة متوسط ​​كل نموذج من متوسط ​​مراقبة إيجابية على النحو التالي:

figure-protocol-1

  1. احسب 1 α PI INEX: اقسم تطبيع ألف نانومتر 405 نانومتر من قبل تطبيع 595 ألف:

"jove_content"> figure-protocol-2

5. ممثل النتائج

لتحديد ما إذا كان α تجارب قد تكون مناسبة للاستخدام على انها اختبار فحص نقطة من الرعاية لرصد CD4 التهم المستوطنة في المناطق ذات الموارد المحدودة، وقد تم جمع لعاب حفزت من 20 أنثى و 11 ذكرا HIV-1 عيادة الموضوعات يحضرون لل الرعاية الروتينية في الكاميرون. بما يتفق مع الملاحظات الأولية خلال تطوير اختبار α باستخدام اللعاب التي جمعت في مدينة نيويورك، ومؤشر α بي 1 في اللعاب التي تم جمعها في الكاميرون ترتبط التهم CD4 (ص 2 = 0.91، P <0.0001. ن = 31). تم تعريف العلاقة منحنى 3-المعلمة السيني وهو ما يتسق مع وجود علاقة بين الجرعة والاستجابة (الشكل 2A). وصفت ثقة 95٪، وفترات تنبؤ بخطوط زرقاء وحمراء، على التوالي (2B الشكل).

فيدراسة سابقة، توصلنا إلى أن خلايا CD4 + T عرض الدراجات جيبية مع تواتر 23 ± 3.5 أيام في المواضيع-1 فيروس نقص المناعة البشرية والموضوعات مع إصدار ورثت من PI α نقص 1 (PIZZ) 3. هنا يصور مثال ممثل ولدت كمبيوتر الجيب تحليل منحنى CD4 ركوب الدراجات في غير HIV-1 مراقبة صحية دورية المعرض 27 يوما (الشكل 3A).

الحاسوب ولدت منحنى جيب تحليل CD4 + الخلايا التائية أسفرت التغييرات في 6 موضوعات قيم الذروة إلى الذروة السعة ومحور التذبذب 3. كما هو متوقع، فقد ارتبط محور التذبذب مع السعة (ص 2 = 0.96، P = 0.009، ن = 6) (الشكل 3B). سوف CD4 في المرضى الذين يعانون انخفاض عدد خلايا تي +، والتغيرات الدورية في عدد الخلايا التائية CD4 كانت صغيرة، وعلى المرضى الذين يعانون من ارتفاع CD4 + عدد خلايا تي، التغيرات الدورية كانت كبيرة.

لأنخط الانحدار صورت في الشكل 2 ويقدر يرتبط المحور من التذبذب ومحور التذبذب مع السعة، ويمكن حساب سعة للخط الانحدار وبالتالي تقدير مدى فوق وتحت ويتوقع أن CD4 خط الانحدار + الخلايا التائية أن تختلف نتيجة لل ركوب الدراجات (الشكل 3C). تتراكب مع سعة محسوب في 3C الشكل وفاصل الثقة محسوبة في الشكل 2B، وجد أن السعة (الخط الأخضر) يقع ضمن 95٪ فاصل الثقة (الخط الأزرق) (الشكل 3D).

figure-protocol-3
الشكل 1. ملخص الإجراء: حامض الستريك مكان في الفم وجمع اللعاب. إضافة إلى الآبار اللعاب المخفف من microplate في ثلاث نسخ. إضافة إلى كل وسائل الحماية الشخصية بشكل جيد واحتضان لمدة 15 دقيقة في 23 درجة مئوية. إضافة إلى معدات الوقاية الشخصية ركيزة كل جيدا واحتضان لمدة 45 دقيقة عند 23 درجة مئوية. إضافة Coomassie الأزرق وقراءة في 405 نانومتر للكشف عن نشاط وسائل الحماية الشخصية في 595 نيوتن متر للكشف عن البروتين.

figure-protocol-4
الشكل 2. مقارنة بين تجارب α مع أسلوب قياسي تعداد CD4. A) وقد أجريت تجارب بواسطة α quantitating مؤشر α بي 1 في تحفيز اللعاب الفم كله. وأجريت CD4 التهم من قبل مختبر طبي مستقل باستخدام معيار التدفق الخلوي. تم جمع الدم من أجل التدفق الخلوي واللعاب في زيارة عيادة نفسه. وقد تم تعريف العلاقة بين مؤشر α PI (1) والتهم CD4 بواسطة منحنى 3-المعلمة السيني (ص 2 = 0.91، P <0.0001، ن = 31). ب) وصفت والثقة 95٪، وفترات تنبؤ في الأزرق والأحمر خطوط، على التوالي.

figure-protocol-5
الشكل 3. دقة حساب CD4 جounts باستخدام Index.A α1PI معارضها) خلايا CD4 + T الدراجات جيبية مع دورية يوم 27 في عنصر تحكم غير HIV-1 صحي. ويصور المحور من التذبذب (الخط المنقط باللون الأحمر). B) الحاسوب ولدت موجة جيبية تحليل CD4 T الدراجات استخدمت الخلية لحساب السعة الذروة إلى الذروة ومحور من التذبذب في 4 موضوعات-1 فيروس نقص المناعة البشرية (1)، غير فيروس نقص المناعة البشرية -1 PIzz الموضوع، وعدم HIV-1 مراقبة صحية صورت في ألف جزء العلاقة بين CD4 + T عرف سعة الخلية ومحور من التذبذب من قبل 3-المعلمة منحنى السيني (ص 2 = 0.96، P = 0.009، ن = 6). C) واستخدمت علاقة السيني بين السعة ومحور التذبذب المشتقة في جزء B) لحساب السعة المتوقعة (خطوط خضراء) من نقاط على طول خط الانحدار (الخط الأسود) من الشكل 2. D) والسعة المتوقعة وكان الفاصل الزمني (خطوط خضراء) تختلف اختلافا كبيرا من فترة الثقة 95٪ (الزرقاء خطوط) على النحو الذي يحدده اختبار مان ويتني مجموع الرتبة (على أساس المقارنة بين متوسط ​​الفرق بين فاصل الثقة 95٪ و خط الانحدار (63 خلية / ميكرولتر) والفرق بين متوسط ​​خط السعة وخط الانحدار (37 الخلايا / ميكرولتر)، P = 0.001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

المصل غير مخفف يحتوي على متوسط ​​36 ميكرومتر α 1 PI و 3.6 ميكرومتر α 2 macroglobulin (α 2 م) فارق بمقدار 10 أضعاف 8. كلا البروتينات تنافس للربط إلى معدات الوقاية الشخصية. وقد تم استغلال هذه الخصائص اثنين والتركيز والانجذاب معدات الوقاية الشخصية، لوضع طريقة التي هي قادرة على قياس تحديدا α 1 PI في مصل الدم طبيعي في ظل وجود منافسة α 2 م 8. وهذه الطريقة يمكن الكشف عن أقل قدر 50 نانومتر μ 1 PI في مص...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم البحوث ومؤسسة هاري وينستون للبحوث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة فهرس العدد
مدر اللعاب، وحامض الستريك 0.05M جمعية الإمارات للغوص والحلويات خال من السكر، 4900 خلفي N.20th شارع، فيلادلفيا، بنسلفانيا 19144 قطرات الليمون الخالي من السكر
الخنزيري إيلاستاز البنكرياس، نوع 1 (EC 3.4.21.36) سيغما الدريخ، وسانت لويس، MO 63103 E1250
Succinyl-L-علاء-L-علاء-L-علاء-P-nitroanilide سيغما الدريخ S4760
Coomassie بريليانت الأزرق R-250 سيغما الدريخ B7920
زراعة الأنسجة المعاملة، و 96 microplates جيد بيكتون ديكنسون، فرانكلين البحيرات، NJ 07417-1886 35-3072
Microplate القارئ مع المرشحات لل405 نانومتر و 595 نانومتر MTX مختبر أنظمة، 8456 تايكو الطريق، بويlding D، فيينا، فيرجينيا 22182 Dynex P97277

المراجع

  1. Friedlander, Y., Kark, J. D., Eisenberg, S., Stein, Y. Calculation of LDL-cholesterol from total cholesterol, triglyceride and HDL-cholesterol: a comparison of methods in the Jerusalem Lipid Research Clinic Prevalence Study. Isr. J. Med. Sci. 18, 1242-1252 (1982).
  2. Lapidot, T., Petit, I. Current understanding of stem cell mobilization: The roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells. Exp. Hematol. 30, 973-981 (2002).
  3. Bristow, C. L. α1Antitrypsin therapy increases CD4+ lymphocytes to normal values in HIV-1 patients. Soluble factors mediating innate immune responses to HIV infection. Alfano, M. , Bentham Science Publishers. (2010).
  4. Bristow, C. L., Patel, H., Arnold, R. R. Self antigen prognostic for human immunodeficiency virus disease progression. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 937-942 (2001).
  5. Bristow, C. L., Babayeva, M. A., LaBrunda, M., Mullen, M. P., Winston, R. α1Proteinase Inhibitor regulates CD4+ lymphocyte levels and is rate limiting in HIV-1 disease. PLoS One. , Forthcoming (2011).
  6. de Almeida, P. D. V., Gregio, A. M. T., Machado, M. A. N., de Lima, A. A. S., Azevedo, L. R. Saliva Composition and Functions: A Comprehensive Review. J. Contemp. Dent. Pract. 9, 72-80 (2008).
  7. Edgar, W. M. Saliva: its secretion, composition and funcitons. Br. Dent. J. , 172-305 (1992).
  8. Bristow, C. L., Meo, F. di, Arnold, R. R. Specific activity of α1proteinase inhibitor and 2macroglobulin in human serum: Application to insulin-dependent diabetes mellitus. Clin. Immunol. Immunopathol. 89, 247-259 (1998).
  9. Pederson, E. D. Salivary levels of α2-macroglobulin, α1-antitrypsin, C-reactive protein, cathepsin G and elastase in humans with or without destructive periodontal disease. Arch. Oral Biol. 40, 1151-1155 (1995).
  10. Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. PNAS. 87, 9188-9192 (1990).
  11. LeVeque, F. G. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, dose- titration study of oral pilocarpine for treatment of radiation-induced xerostomia in head and neck cancer patients. J. Clin. Oncol. 11, 1124-1131 (1993).
  12. Stevens, W. Evaluating new CD4 enumeration technologies for resource-constrained countries. Nat. Rev. Microbiol. 6, S29-S38 (2008).
  13. WHO. 2010 ART guidelines for adults and adolescents - evidence map. , Available from: http://www.who.int/hiv/topics/treatment/evidence/en/index.html (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

1 psin SA3NA

مقالات ذات صلة