مقالة منهجية

تنقية تقارب من المجمعات الأنفلونزا فيروس بروتين نووي ريبوزي من لونين من الخلايا المصابة

DOI:

10.3791/4028

⸱

يونيو 3, 2012

 , 
1Department of Virology, Universitätsklinikum Freiburg

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيروسات الأنفلونزا من تكرار الحمض النووي الريبي الجينوم بالاشتراك مع الخلية المضيفة لونين. هنا، نقدم طريقة لتنقية سليمة المجمعات بروتين نووي ريبوزي الفيروسية من لونين من الخلايا المصابة. يمكن تنقية المجمعات فيروسي يتم تحليلها من قبل كل من لطخة غربية والإرشاد التمهيدي من البروتين ومحتوى الحمض النووي الريبي، على التوالي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على غرار جميع فيروسات RNA سلبي حبلا، يتم حزم الجينوم من فيروسات الانفلونزا في شكل مجمعات بروتين نووي ريبوزي الفيروسي (vRNP)، التي يتم فيها encapsidated الجينوم واحد الذين تقطعت بهم السبل من البروتين النووي (NP)، ويترافق مع مجمع بوليميريز مثلوثي تتكون للسلطة الفلسطينية، PB1، ومفارز PB2. لكن، على النقيض من معظم الفيروسات الحمض النووي الريبي، فيروسات الانفلونزا الفيروسية أداء توليف الحمض النووي الريبي في نوى الخلايا المصابة. ومن المثير للاهتمام، الفيروسية تخليق مرنا يستخدم الخليوي قبل mRNAs كما الاشعال، واقترحت أن تتم هذه العملية في لونين 1. التفاعلات بين البلمرة الفيروسية وبوليميريز الحمض النووي الريبي الثاني المضيفة، وكذلك بين الحزب الوطني و nucleosomes المضيفة كما تميزت 1،2.

في الآونة الأخيرة، وتوليد فيروسات الانفلونزا المؤتلف ترميز واحدة تنصهر فيها بكتيريا طلال أبو غزاله وراثيا لمحطة-C من الوحيدات PB2 من بوليميريز الفيروسي (rWSN-PB2 بكتيريا-3) قد يكونووصف EN. هذه الفيروسات المؤتلف السماح للتنقية من PB2 المحتوية على المجمعات، بما في ذلك vRNPs، من الخلايا المصابة. للحصول على تنقية vRNPs، يصاب الثقافات الخلية، وvRNPs هي تقارب تنقيته من lysates المستمدة من هذه الخلايا. ومع ذلك، وقد وضعت إجراءات تحلل تستخدم حتى الآن على خطوة واحدة تحلل المنظفات، والذي، على الرغم من وجود nuclease العامة، واستخراج كثير من الأحيان لونين متجهة الى مادة غير فعال فقط.

عملنا الاولية اشارت الى ان عدم استخراج جزء كبير من vRNPs النووية خلال تحلل الخلية التقليدية، وبالتالي لا يمكن أن يكون تقارب المنقى. لزيادة كفاءة هذا الاستخراج، وفصل الكروماتين ملزمة من غير لونين متجهة vRNPs النووية، وتكييفها لدينا خطوة حكيمة بروتوكول الاستخراج التحت خلوية إلى الخلايا المصابة بالفيروسات الأنفلونزا. باختصار، هذا الإجراء يفصل لأول مرة من نواة الخلية ومن ثم استخراج البروتينات النووية القابلة للذوبان (وهو ما يسمى هنا "النواة للهيولى" جزء).يتم هضمها ثم ما تبقى من المواد النووية غير قابلة للذوبان مع Benzonase، وهي غير محددة الحمض النووي / الحمض النووي الريبي nuclease، تليها خطوتين استخراج الملح: الأولى باستخدام 150 مم كلوريد الصوديوم (وهو ما يسمى "ch150")، ثم كلوريد الصوديوم 500 ملم ("ch500") (الشكل 1 ). وقد تم اختيار هذه الخطوات استخراج الملح على أساس ما نلاحظه 500 ملم كلوريد الصوديوم كان كافيا لذوبان أكثر من 85٪ من vRNPs النووية حتى الآن لا تزال تسمح ملزم من vRNPs المفتاحية للمصفوفة تقارب.

بعد تجزئة التحت خلوية من الخلايا المصابة، فمن الممكن أن تنقي vRNPs تقارب PB2 الموسومة من كل جزء فردي وتحليل البروتين ومكوناتها باستخدام الحمض النووي الريبي البقعة الغربية وتمديد التمهيدي، على التوالي. في الآونة الأخيرة، استخدمت هذه الطريقة لأننا نكتشف أن vRNP شكل مجمعات التصدير خلال نقاط في وقت متأخر من بعد الإصابة على جزء لونين المستخرجة مع كلوريد الصوديوم 500 ملم (ch500) 3.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين المخطط الانسيابي التخطيطي للبروتوكول في الشكل. وتقدم (1) وجدول الكواشف أدناه.

1. إصابة (16 - 24 ساعة)

  1. بذرة من خلايا هيلا في 5 150 ملم من البلاستيك أطباق ثقافة خلية في المتوسط ​​Dulbecco لتعديل النسر (DMEM) عالية متوسطة الجلوكوز، بحيث سيصل الى حوالي 80٪ confluency في اليوم التالي (ما يقرب من 5 × 10 8 خلايا). من المهم أن الخلايا لا تصل إلى 100٪ confluency.
  2. في اليوم التالي، يخفف من بكتيريا الموسومة فيروس الانفلونزا الأوراق المالية في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 0.3٪ الأبقار مصل (BSA) إلى عدد وافر من العدوى من 3.
  3. إزالة متوسط ​​نمو من الخلايا، ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 10 مل PBS التي تحتوي على الفيروس الى الخلايا. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. استبدال المتوسطة عدوى مع DMEM عالية الجلوكوز، وتستمر الحضانة عند 37 درجة مئوية.
"> ويبلغ طول الحضانة يعتمد على مرحلة العدوى إلى دراسة (انظر المناقشة).

2. التحت خلوية تقطير (3 ح)

  1. غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني الباردة وتعليق ثم الخلايا في برنامج تلفزيوني الباردة مع مكشطة المطاط، ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
  2. بيليه الخلايا في جهاز للطرد المركزي فوق المنضدة لمدة 5 دقائق في 1000 دورة في الدقيقة ومن ثم نضح في برنامج تلفزيوني.
  3. Resuspend خلية بيليه في 10 مل العازلة السكروز البارد (10 درجة الحموضة HEPES ملي 7.9، 10 ملي بوكل، 2 خلات الماغنسيوم ملم (MgOAc)، 3 مم CaCl 2، 340 السكروز مم، 1 مم dithiothreitol (DTT)، 1٪ خليط مثبط للبروتياز) . بعد تعليق، تمر الخلايا من خلال طرف 200 ماصة ميكرولتر تعلق على ماصة بلاستيكية المصل 10 مل لعرقلة كتل الخلية.
  4. احتضان 10 دقيقة على الجليد. عكس بلطف دوريا لresuspend الخلايا.
  5. إضافة Nonidet P-40 (NP-40) إلى تركيز النهائي من 0.5٪، ودوامة بسرعة عالية لمدة 15 ثانية. أجهزة الطرد المركزي على الفور لمدة 10 دقيقة في 3500 XG في درجة مئوية 4 في centrifu فوق المنضدةشركة جنرال الكتريك.
  6. إزالة طاف ومخزن في 4 درجات مئوية. هذا هو جزء حشوية. يجب أن يكون بيليه أصغر حجما وأشد بياضا من بيليه الخلية الأصلية. ويمكن تخزين جميع أجزاء ما لا يقل عن 4 ساعات في 4 درجة مئوية.
  7. غسل بيليه في 5 مل العازلة السكروز الباردة، وإعادة الطرد المركزي كما في الخطوة 2.5 وتجاهل طاف.
  8. Resuspend وبيليه (التي تحتوي على نوى) في 1.5 مل الباردة العازلة استخراج النواة إلى الهيولى (HEPES 50 ملم 7.9 درجة الحموضة، 150 مم KOAc، 1.5 ملم MgCl 2، 0.1٪ NP-40، 1 ملم DTT، 1٪ خليط مثبط للبروتياز).
  9. نقل إلى مبرد، كل من الزجاج 4 الخالط Dounce مل مع مدقة ضيقة والتجانس نواة مع 20 السكتات الدماغية.
    تجنب الرغوة خلال التجانس. وينبغي زيادة المقاومة بعد ما يقرب من 10 السكتات الدماغية. ويمكن التأكد من تجانس فعال تحت مجهر مرحلة التباين.
  10. نقل نواة متجانسة إلى أنبوب مل microcentrifuge 1.5 واحتضان 20 دقيقة على عجلة دوارة في 4 درجاتC.
  11. الطرد المركزي في ز س 16000 في microcentrifuge في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  12. إزالة طاف ومخزن في 4 درجات مئوية. هذا هو جزء النواة إلى الهيولى.
  13. Resuspend بيليه في 1.5 مل العازلة الهضم (HEPES 50 ملم درجة الحموضة 7.9 و 10 ملم كلوريد الصوديوم، 1.5 ملم MgCl 2، 1 ملم DTT، 1٪ خليط مثبط البروتياز، 100 U / Benzonase مل (الحمض النووي الريبي للتحليل، بديلا مع 20 U / ريبونوكلياز مل خالية من الدناز I)) قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية، واحتضان 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  14. إضافة 42 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم M 5 (لتركيز النهائي من كلوريد الصوديوم 150 مم)، واحتضان 20 دقيقة أخرى في 4 درجات مئوية.
  15. الطرد المركزي في ز س 16000 في microcentrifuge في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  16. إزالة طاف ومخزن في 4 درجات مئوية. هذا هو جزء ch150.
  17. Resuspend بيليه في 1.5 مل العازلة عالية من الملح البارد (50 درجة الحموضة HEPES ملي 7.9، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1.5 MgCl 2 مم، 0.1٪ NP-40، 1 ملم DTT، 1٪ خليط مثبط للبروتياز)، واحتضان 20 دقيقة على الجليد.
  18. الطرد المركزي في 16000 س ز </ م> في microcentrifuge في درجة مئوية لمدة 10 دقيقة 4.
  19. إزالة طاف ومخزن في 4 درجات مئوية. هذا هو جزء ch500.

3. بكتيريا، علامة تنقية (2 ح)

  1. إضافة 300 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم M 5 إلى كسر هيولي (لتركيز النهائي من كلوريد الصوديوم 150 مم).
  2. قسامة 100 ميكرولتر من الخرز معبأة sepharose و بكتيريا، Tactin في كسر في أنبوب 15 مل مخروطي.
  3. إضافة 10 مجلدا من عازلة غسيل بكتيريا (20 درجة الحموضة HEPES ملي 7.9، 150 مم كلوريد الصوديوم (500 ملي مول كلوريد الصوديوم لch500 عينات)، 1 ملم EDTA) لالخرز، وعكس أنبوب لخلط، وأجهزة الطرد المركزي في 5 دقائق ز س 1000 في منضدية الطرد المركزي.
  4. تجاهل طاف، كرر الخطوة 3،3 مرتين وresuspend ثم بيليه حبة في حجم مساو من عازلة غسيل بكتيريا.
  5. إضافة 200 ميكرولتر من غسلها الطين حبة بكتيريا-Tactin إلى كل جزء (1،5 في أنابيب microcentrifuge مل nuceloplasmic، ch150، وch500 الكسور وأنبوب 15 مل مخروطي لكسر حشوية).
  6. تناوبأنابيب 1H في 4 درجات مئوية على عجلة دوارة.
  7. منبذة أنابيب 1 دقيقة في ز س 1000 في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف.
  8. إضافة 1 مل غسيل بكتيريا الباردة العازلة على كل أنبوب. نقل حبات من أنبوب مل 15 (جزء حشوية) إلى أنبوب 1.5 مل. غسل جميع مواسير 1 دقيقة في 4 درجات مئوية، بعد الطرد المركزي كما في الخطوة 3.7. كرر هذه الخطوة يغسل مرتين.
  9. بعد الخطوة غسل الماضي، وإزالة كل أثر للغسيل العازلة باستخدام طرف ماصة شقة. إضافة 100 العازلة شطف ميكروليتر (بكتيريا العازلة غسيل تحتوي على 2،5 desthiobiotin ملم) ومزيج بلطف.
  10. احتضان 15 دقيقة على الجليد. مزيج بلطف حبات من حين لآخر من خلال استغلال الجزء السفلي من الأنابيب.
  11. أنابيب الطرد المركزي 1 دقيقة في 1000 × ز في 4 درجات مئوية في microcentrifuge. جمع تحتوي على بكتيريا مزال طاف الموسومة vRNPs.

4. ممثل النتائج

فإن الحكم على كفاءة التجزئة عن طريق تحليل لطخة غربية من lysates مجزأة باستخدام antibعلامات محددة لالتحت خلوية (الشكل 2) odies. على وجه التحديد، ينبغي تجزئة النووية الدقيقة الناجحة تظهر ضئيلة أو معدومة بوليميريز الحمض النووي الريبي الخلوية الثاني (بول الثاني) في النواة إلى الهيولى، أو جزء النووية القابلة للذوبان 4، ومعظم وينبغي استخلاص مع 150 ملم كلوريد الصوديوم 5. وأيضا تدهور بول الثاني لوحظ في بتكاثر الخلايا المصابة بالفيروسات إنفلونزا مقارنة مع الخلايا غير المصابة، بما يتفق مع الأدب 6.

يتم الحكم على أفضل تنقية vRNPs بواسطة فضة أو تلطيخ Coomassie، كما هو موضح لشطافة السيتوبلازمية في الشكل. 3. في تجربتنا، ويتم تنقيته معظم بكتيريا، PB2 في كجزء من vRNP الصياغة التامة، يتم القبض على أي بوليميريز قابل للذوبان القليل. وينعكس هذا في ارتفاع NP: PA/PB1/PB2 نسبة الفضة التي لاحظها أو تلطيخ Coomassie. انخفاض نسبة تلوث يوحي العازلة مع RNases، كما هي معروفة في كل مكان RNases عدة (مثل ريبونوكلياز A) على الحمض النووي الريبي يلتصق الفيروس في مثل هذه الطريقة لdissociيأكل من البلمرة من multimers NP 7. ومن المثير للاهتمام، والمعاملة مع Benzonase وحدها، في حين يكفي لهضم RNA الفيروسي، ويبدو أن ليس لها أي تأثير على نسب stochiometric من البروتينات vRNP. على الرغم من أننا لا يمكن تفسير هذه الظاهرة، لاحظنا انقطاع vRNPs بعد الهضم مع RNases أخرى (لا تظهر البيانات)، مما يوحي بأن Benzonase قد يترك بعض مناطق مهمة من الناحية الهيكلية RNA سليمة. بعد تنقية vRNPs من السيتوبلازم وnucleoplasm (القيام بها دون هضم nuclease)، يمكن ملاحظة 8 فرق خافت ولكن منفصلة في أوزان جزيئية عالية من تلطيخ الفضة، والتي تتوافق مع الأوزان الجزيئية وتوقع من شرائح إنفلونزا الجينوم 8 (انظر المرجع. 3 ).

وترد المبالغ النسبية للvRNPs تنقيته من كل جزء في 9 إصابة آخر ساعة في الشكل. 4. توزيع vRNPs يختلف على مدى الإصابة، مع أقوى تراكم في جزء ch150 نقاط في وقت مبكر، وزيادة تراكم في nucleoplasm والسيتوبلازم في نقاط وقت متأخر.

figure-protocol-1
الرسم البياني رقم 1 التدفق. للتجزئة التحت خلوية. مقتبس من المرجع. 3.

figure-protocol-2
الشكل 2. الغربية لطخة تحليل الكسور التحت خلوية من الخلايا المصابة بالفيروسات الأنفلونزا. أصيب 10 9 خلايا هيلا مع فيروس الانفلونزا WSN سلالة لمدة 9 ساعات قبل تجزئة التحت خلوية. تم تحميل كميات متساوية من البروتين الكلي في كل حارة وتحليلها باستخدام الأجسام المضادة هو مبين. تم الكشف عن الحمض النووي الريبي الثاني بوليميريز (بول الثاني) باستخدام استنساخ 8WG16، الذي يعترف جميع أشكال المجال C-محطة (الفرقة hypophosphorylated هو الأبرز). مقتبس من المرجع. 3.

figure-protocol-3
الشكل 3.وصمة عار تحليل الفضة النقية من vRNPs. أصيب خلايا هيلا مع rWSN (كعنصر تحكم سلبية) أو rWSN-PB2-بكتيريا لمدة 9 ساعات، تليها تنقية بكتيريا من الكسر حشوية. النجمة يدل على الفرق التي ليست واضحة بعد الهضم ريبونوكلياز. مقتبس من المرجع. 3.

figure-protocol-4
الشكل 4. تحليل وصمة عار من فضة vRNPs تنقيته من كسور الخلوية المختلفة. أصيب 10 9 خلايا هيلا مع rWSN-PB2-بكتيريا أو rWSN لمدة 9 ساعات ثم بواسطة تجزئة التحت خلوية وتنقية بكتيريا. تم تحميل كميات متساوية من شطافة من كل جزء. مقتبس من المرجع. 3.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في حين أن العديد من الدراسات قد حددت مؤخرا البروتينات الفردية أو الشبكات الخلوية العاملة في عدوى فيروس الانفلونزا 8، وأهمية وظيفية لغالبية هذه التفاعلات لا يزال غير واضح. بالنظر إلى الاعتماد المطلق من لونين على أساس وظائف لتخليق فيروس انفلونزا الحمض النووي الريبي، والطبيعة المعقدة الفيزيائية الحيوية والكيمياء الحيوية من نواة 9، سيكون مطلوبا تقنيات جديدة لتوضيح هذه الوظائف. وتجزئة النووية الدقيقة نقدم هنا، إلى جانب تنقية تقارب من vRNPs، بما يسمح للتوصيف حاسم م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أشكر ندى Naffakh وماري آن Rameix-يلتي (معهد باستور) لفيروس rWSN-PB2-بكتيريا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة فهرس العدد تعليقات
DMEM عالية الجلوكوز Gibco 11965-092
جيش صرب البوسنة سيغما A9418
البروتيني المانع ميكس G Serva 39101
Benzonase Nuclease Novagen 71206 يو 25 / ميكرولتر
الدناز أنا، ريبونوكلياز خالية ThermoScientific EN0523 يو 50 / ميكرولتر
الخالط Dounce ويتون 432-1271 استخدام نوع "ب" مدقة
بكتيريا-Tactin sepharose و IBA شركة محدودة 2-1201-025 ويمكن أيضا أن 50٪ شكل عمود التعليق يمكن استخدام
Desthiobiotin IBAشركة محدودة 2-1000-002

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II. J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).
  2. Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes. Virology. 332, 329(2005).
  3. Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting. PLoS Pathogens. 7, e1002187(2011).
  4. Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure. Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).
  5. Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin. Genome Res. 19, 460(2009).
  6. Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II. J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).
  7. Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins. J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).
  8. Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, Cellular networks involved in the influenza virus life cycle. Cell Host Microbe. 7, 427(2010).
  9. Engelhardt, O. G., Fodor, E. Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection. Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).
  10. Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315. J. Biol. Chem. 249, 5889(1974).
  11. Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. Of proteins and DNA--proteomic role in the field of chromatin research. Mol. Biosyst. 6, 30(2010).
  12. Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J. Virol. 85, 6618(2011).
  13. Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication. EMBO J. 29, 3879(2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Viral RNA SynthesisChromatin FractionationSubcellular FractionationBenzonase DigestionSalt ExtractionWestern Blot AnalysisPrimer Extension AssayStrep Tag Purification

مقالات ذات صلة