مقالة منهجية

والإنسان النموذجي قناة فالوب للتحقيق في

15.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/4036

⸱

أغسطس 11, 2012

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Microbiology and Hygiene, University of Lübeck, 2Institute of Anatomie, University of Lübeck, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck, 4Medical Clinic III, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck

في هذه المقالة

ملخص

وصفنا 1 خارج الحي عدوى نموذج لرؤية التفاعلات المباشرة من مسببات الأمراض البكتيرية مع خلايا قناة فالوب. وقد تم تأسيسها في الأنسجة الجهاز كله نموذج للتحقيق C. الحثرية علم الأمراض التي يسببها إلى قناة فالوب الإناث في ظل ظروف "الحياة مثل".

الملخص

التهابات الجهاز التناسلي مع الكلاميديا ​​(سي. الحثرية) هي الأكثر شيوعا التي تنتقل عن طريق الاتصال الجنسي مرض في النساء على مستوى العالم. قد التخليص غير فعال أو استمرار مسببات الأمراض تؤدي إلى الصعود التهابات الجهاز التناسلي العلوي ويفترض أن يسبب ضررا للالتهابات المزمنة إلى 1،2 الأنسجة المصابة. ونتيجة لذلك، قد عقابيل سريرية شديدة مثل مرض التهاب الحوض (PID)، الانسداد الأنبوبي والعقم تحدث 3،4.

معظم الأبحاث مع جيم وقد أجريت الحثرية في خطوط الخلايا الظهارية (مثل التهاب الكبد-2 الخلايا وهيلا 229) أو في الفئران. ومع ذلك، كما هو الحال مع خلية ثقافة النماذج القائمة، فإنها لا تعكس أيا من علم وظائف الأعضاء من الأنسجة الأصلية ولا الفيزيولوجيا المرضية من C. التهابات الجهاز التناسلي الحثرية في الجسم الحي 5. ونظرا للقيود مزيد من حقيقة أن أجهزة الطرد المركزي وسط إشارات (مثل الإنترفيرون γ mediatإد JAK / STAT مسار الإشارات) التي تتحكم في نمو الخلايا المتدثرة تختلف جوهريا بين الفئران والبشر 6،7. نحن وغيرنا وبالتالي، أنشأت كل نموذج هيئة قناة فالوب للتحقيق التفاعل المباشر بين C. الحثرية والبشرية فالوب السابقين خلايا الجسم الحي أنبوب 8،9.

لهذا الغرض، جمعت قناة فالوب الإنسان من النساء اللواتي خضعن لاستئصال الرحم والمصابين بفيروس C. الحثرية ضرب مصلي د. في غضون 24 ساعة إصابة آخر، عينة حيث حللت باستخدام المجهر الإلكتروني (SEM) والمجهر الإلكتروني انتقال (تيم) للكشف عن الكلاميديا ​​تتوسط ضرر الظهارية، فضلا عن جيم الحثرية تشكيل إدراجها في نسيج فالوب.

البروتوكول

1. إعداد ألبوم المتدثرة الحثرية D ضرب مصلي

  1. متموجة تصيب 175 زراعة الخلايا التي تحتوي على 2 قارورة هيلا-229 الخلايا مع جيم مل 4 D الحثرية في الإشتراكي العازلة.
  2. احتضان لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية خلال الهز المستمر.
  3. إضافة 20 مل DMEM مع FCS 10٪ و 240 سيكلوهيكسيميد ميكرولتر.
  4. احتضان في حاضنة مرطب لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  5. إضافة 5 حبات مل زجاجية معقمة، هزة قوية لفصل وتدمير C. الحثرية ايواء هيلا-229 الخلايا.
  6. طاف جمع وإضافة آخر 5 مل من الخرز الزجاجي ومعقمة.
  7. صخرة ثلاث مرات لمدة 1 دقيقة لتدمير كل-229 هيلا الخلايا وجيم الافراج الحثرية.
  8. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في rpmi 1000 و 4 درجات مئوية للتخلص من الحطام الخلوي.
  9. جمع طاف للعدوى من 8 إلى 10 175 سم ثقافة الخلية 2 قوارير ز متكدسةrown مع خلايا 229 هيلا.
  10. احتضان كل قارورة مع عازلة مل 4 الإشتراكي و 4 طاف مل من الإصابة السابقة لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهز المستمر.
  11. بعد ساعة واحدة إضافة 15 مل DMEM مع FCS 10٪ و 230 سيكلوهيكسيميد ميكرولتر تليها حضانة ح 48 إلى 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  12. إضافة 5 مل الخرز الزجاجي عقيم، هز لفصل وتدمير C. الحثرية ايواء هيلا-229 الخلايا.
  13. جمع وطاف وإضافة آخر 5 مل من الخرز الزجاجي ومعقمة.
  14. صخرة ثلاث مرات لمدة 1 دقيقة لتدمير كل-229 هيلا الخلايا وجيم الافراج الحثرية.
  15. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في rpmi 1000 في 4 درجات مئوية للتخلص من الحطام الخلوي.
  16. جمع وطاف.
  17. ملء 40 مل من طاف في 50 مل من أنابيب الصقر، الطرد المركزي لمدة 99 دقيقة مع 11000 rpmi.
  18. بعد الطرد المركزي تجاهل طاف ويغسل بيليه مع 1 مل الإشتراكي العازلة.
  19. تجانسبيليه في SPG 1 مل وقسامة ميكرولتر 20 في 1 و 5 مخزن إيبندورف مل، أنبوب في -70 درجة مئوية حتى استخدامها. وقد أكد النشاط البيولوجي للسهم المعدة في تأسيس هيلا-229 خلية نموذج عدوى.

2. إعداد قناة فالوب الإنسان

  1. متجر الإنسان قناة فالوب (HFT) من النساء اللواتي خضعن لاستئصال الرحم مباشرة بعد عملية جراحية في RPMI تحتوي على السفح 5٪ بدون المضادات الحيوية في 4 درجات مئوية حتى إعداد. وتمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة أخلاقية من جامعة لوبيك (09-153). ويتعين على المرأة التي شملتها الدراسة (سن 34 حتى 53) لا يوجد تاريخ من قبل C. الحثرية عدوى. وقد تم جمع الأنسجة من قناتي فالوب في تعقيم الفترة المحيطة بالولادة بناء على طلب الأمهات خلال عمليات الولادة القيصرية أو أثناء استئصال الرحم بسبب الأورام الليفية الرحمية أعراض في مرحلة الجسم الأصفر. وقد تم اختبار جميع HFT سلبية على C. الحثرية بواسطة PCR.
  2. تشريح HFT في طبق بتري تحتوي على RPMI مع5 FCS٪ بدون مضادات حيوية. وينبغي أثناء معالجة كله أن يغطس في الأنسجة في وسائل الاعلام لمنع جفاف.
  3. قطعت وتجاهل النسيج الضام والأنسجة التي دمرت خلال عملية جراحية.
  4. بعد تشريح فتح HFT بعناية مع مشرط صغير.
  5. لمزيد من التجارب تعد قطعة من النسيج في حجم 0،5 سم x 0.5 سم يصل إلى 1 سم × 1 سم.
  6. لمتجر عدوى عينة HFT في 1 مل RPMI تحتوي على السفح 5٪ بدون مضادات حيوية. أصيب العينات HFT مع 5.5x10 5 IFU (وحدات إدراج تشكيل) من جيم الحثرية.
  7. احتضان HFT عينة في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 و٪ 21 O 2، وكذلك في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون بنسبة 5٪ و 2٪ 2 O 2 لمدة 24 ساعة.
  8. بعد فترة حضانة جمع العينات وتخزينها في مونتي مثبت لثلاثة أيام على الأقل في 4 درجات مئوية حتى SEM / تيم إعداد.

3. إعداد نموذج لHFT TEM

  1. للتيم إزالة عينة من مثبت مونتي وقطع 2 × 2 مم إلى 4 قطع 5 × ملم. ويمكن استخدام النسيج المتبقي لوزارة شؤون المرأة.
  2. غسل القطع مع عازلة كاكوديلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.35 لمدة 1 ساعة.
  3. احتضان في 1٪ (W / V) رباعي أكسيد الأوزميوم في دست المائية. بين عشية وضحاها.
  4. إزالة الزائدة رباعي أكسيد الأوزميوم بواسطة غسل دقيقة 6x5 في عازلة كاكوديلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.35.
  5. إزالة المياه عن طريق احتضان في زيادة تركيزات الايثانول في الماء (V / V) (30٪ لمدة 2 ساعة، و 40٪ لمدة 2 ساعة، 50٪ لمدة 2 ساعة، و 60٪ لمدة 2 ساعة، 70٪ بين ليلة، و 80٪ لمدة 2 ح، 90٪ لمدة 1 ساعة، 95٪ لمدة 1 ساعة، و 100٪ لمدة 1 ساعة.
  6. تغسل الايثانول لمدة 2 دقيقة 15 × في أكسيد البروبيلين ونقل بعد ذلك إلى خليط من 50٪ (V / V) araldite الطازجة (بما فيها جميع المكونات) في البروبيلين واحتضان بين عشية وضحاها.
  7. نقل إلى araldite الطازجة (بما فيها جميع المكونات) ما لا يقل عن 1 س.
  8. نقل إلى قوالب تضمين شقة وملء مع araldite.
  9. السماح لتتصلب aralditeما لا يقل عن 48 ساعة على 60 درجة مئوية
  10. بعد التشذيب من عينة قطع جزءا لا يتجزأ من الشرائح الرقيقة نصف (700 نانومتر) على مشراح مستدق باستخدام السكاكين والزجاج أو سكين الماس histo وصمة عار وصمة عار مع ريتشاردسون.
  11. قطع رقيقة جدا أقسام (حوالي 70 مترا) باستخدام سكين الماس ونقلها لشبكات النحاس (على سبيل المثال شبكة مربع 150).
  12. وصمة عار رقيقة جدا مع أقسام خلات اليورانيل 0.5٪ (W / V) في دست المائية. تليها 3٪ (W / V) سترات الرصاص في ماء مقطر. في الملطخ قسم تلقائي. بدلا من ذلك، يمكن ملطخة المقاطع يدويا من خلال ترك شبكات 15 دقيقة على حل طرده مركزيا المشبعة من خلات اليورانيل في دست المائية. تليها سترات الرصاص بنسبة 0.3٪ (W / V) في دست المائية.

4. إعداد عينة HFT لوزارة شؤون المرأة

  1. لوزارة شؤون المرأة وإزالة عينة من مثبت مونتي، مع توجيه ظهارة متجهة لأعلى على 1.5 × 1 سم ورقة الفلين وتحديد موقف باستخدام الإبر الحشرات.
  2. نقل العينة على الفلين إلى سلال معدنية مناسبة ويغسل لمدة 30 دقيقة في المخزن كاكوديلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.35.
  3. إزالة المياه عن طريق احتضان عينة في زيادة تركيز الأسيتون / المياه مخاليط (V / V) 30٪ لمدة 6 ساعات، و 40٪ لمدة 6 ساعات، 60٪ لمدة 8 ساعات، 70٪ بين ليلة، و 80٪ لمدة 2 ساعة، و 90٪ لل 2 ساعة و 100٪ على مدى ليلة (لنكون حذرين للغاية للحفاظ على العينات المغمورة باستمرار).
  4. نقل إلى الأسيتون الطازجة بنسبة 100٪ وعينة الجافة عن طريق التجفيف نقطة حرجة (درجة الحرارة 40 درجة مئوية، وضغط 80 بار).
  5. إزالة الإبر، والفلين وعينة الغراء مع ظهارة متجهة لأعلى جبل في عينة ووزارة شؤون المرأة مجهزة التبويب الكربون باستخدام موصل موصل الاسمنت الكربون. استخدام الفضة موصل سائل لتعزيز الموصلية بين جبل والتبويب الكربون موصل.
  6. يعد طلاء من البلاتين، الذهب أو البلاديوم موصل للعينة باستخدام تفل المغطي.

5. تلطيخ من الشرائح الرقيقة نصف مع اللطخة ريتشاردسون

  1. اسمحوا المقاطع رقيقة شبه الجافة على الشريحة.
  2. وصمة عار المقاطع مع تلطيخ حل في 60 درجة مئوية لمدة 1-2 دقيقة.
  3. تغسل في ماء مقطر.
  4. جفاف الفروع وساترة.

6. ممثل النتائج

داخل الإنسان قناة فالوب نموذج عدوى كنا قادرين على تصور الفروق في التشكل الظهارية بين الضوابط غير المصابة (الشكل 1) وجيم لل الحثرية - أنابيب المصاب (الشكل 2) تحت حالة normoxic. ضمني الاختلافات الشكلية المميزة الممرض الناجم عن تورم وتحلل الخلايا الظهارية قناة فالوب التي لا يمكن الكشف عنها في غير المصابة الضوابط. باستخدام الشرائح الرقيقة شبه وانتقال المجهر الإلكتروني كنا قادرين على اثبات جيم بين الخلايا الحثرية تشكيل إدراجها في الجسم الحي السابقين إصابة النسيج البشري قناة فالوب (الشكل 3، 5) ولكن ليس في غير المصابة الضوابط (الشكل 4). كما تركيزات الأكسجينستعقد في المسالك التناسلية للإناث هي بالفعل منخفضة في ظل الظروف الفسيولوجية 11، ومزيد من الانخفاض خلال عملية التحقيق التهابات نحن أيضا لدينا نموذج في ظل ظروف نقص الأوكسجين. النتائج الأولية تشير إلى هذا النموذج هو مفيد لتحليل النمو الناجمة عن المتدثرة وآله تحت بدرجات تركيز الأوكسجين. الكلاميديا ​​الناجم عن تلف الخلايا الظهارية لابد من فصلها عن القطع الأثرية التي توسطت من خلال إعداد غافل والتعامل معها من قبل قناة فالوب عدوى (الشكل 6).

figure-protocol-1
الشكل 1. مسح المجهر الإلكتروني (SEM) من فالوب غير المصابة الإنسان بعد يوم واحد في الحضانة وسط سيطرة (السهم الأخضر تظهر خلية مهدبة، السهم الأزرق تظهر غير مهدبة الخلية).

figure-protocol-2
الشكل 2. مسح الإلكترون MICROS نسخة (SEM) لالحثرية السابق جيم فيفو إصابة قناة فالوب الإنسان أحد إصابة آخر يوم (أبيض إدراج علامة السهم تمزق).

figure-protocol-3
الشكل 3. أقسام رقيقة نصف تظهر شوائب داخل الخلايا نموذجي (السهام البيضاء) 1D بعد العدوى من قناة فالوب الإنسان مع جيم الحثرية خارج الحي.

figure-protocol-4
الشكل 4. نقل المجهر الإلكتروني (تيم) من أنبوب فالوب غير المصابة الإنسان بعد يوم واحد في الحضانة وسط سيطرة.

figure-protocol-5
المجهر الإلكتروني الرقم 5. انتقال (تيم) لجيم المجراة سابقا الحثرية إصابة قناة فالوب الإنسان أحد إصابة آخر يوم (السهام البيضاء بمناسبة الادراج المتدثرة).

ve_content "> figure-protocol-6
الشكل 6. مسح المجهر الإلكتروني (SEM) من ظهارة قناة فالوب تضررت من خلال إعداد غافل والتعامل معها من عينة (أبيض السهام علامة دمر نسيج طلائي).

المناقشة

تصور من العوامل المسببة للأمراض التي يسببها ضرر للأنسجة المصابة هي شاقة ومحدود في كثير من الأحيان إلى الإجراءات التجريبية في الفئران. أنشأنا وجود عدوى فيفو السابقين نموذج في قناة فالوب الإنسان لتحليل C. التهابات في المسالك الحثرية العلوي الأعضاء التناسلية للإناث. من خلال استخدام هذا الأسلوب، كنا قادرين على تصور C. الحثرية - الأضرار التي يسببها الإنسان لظهارة قناة فالوب خلال يوم واحد إصابة آخر. وكان تورم الخلوية وتحلل التغيرات المورفولوجية النموذجية التي لوحظت في C. الحثرية - قناة فالوب المصابة ولكن ليس في غير المصابة الضوابط. وكشفت التحليلات أن تيم متدثرات تطبيق نموذجي دورة تنموية داخل الخلايا داخل أنسجة المصابة، والتي تبين مشتملات كبير مع إعادة متباينة الهيئات الابتدائية ولكن أيضا أصغر الادراج مع الهيئات شبكي الموسعة التي قد تدل على استمرار. ومع ذلك، فإن الصورة الشكلية وحدها لا تكفي للتمييز بين النسخ المماثزيادة الالتهابات icating والمستمرة، التي تتميز بها عملية التمثيل الغذائي المنخفض ومقاومة مضادات الميكروبات 10.

تدمير الخلايا الطلائية في قناة فالوب المصابة هي إما بسبب تعطل C. الحثرية - الخلايا الظهارية المصابة بعد الانتهاء من دورة النمو داخل الخلايا وإطلاق الهيئات الابتدائية المعدية أو إطلاق سراح المؤيد للالتهابات السيتوكينات 8. العوامل المسببة للأمراض التي يسببها تلف الأنسجة والمضيف الناجم عن ردود فعل مناعية ضد C. ومن المفترض أن تكون الحثرية العوامل الرئيسية التي تؤدي إلى فقدان وظائف الخلايا الظهارية، وإعادة عرض الليفية والعقم الأنبوبي أخيرا 8،11 في الجسم الحي.

واحدة من القيود الرئيسية لهذا النموذج هو عدم وجود خلايا التهابية مما يعوق تحليل الآثار الثانوية للجيم الأولي عدوى الحثرية لظهارة قناة فالوب. ومع ذلك، فإن النموذج هو أبتكبده للتحقيق في ظروف بيئية مختلفة (على سبيل المثال محتوى الأكسجين) وأولي المضيف استجابة مناعية في جيم الحاد التهابات الحثرية 8،9. خطط أخرى هي لوضع نموذج لاختبار مضادات الميكروبات ضد C. الحثرية في أنابيب فالوب كامل الإنسان وإلى تميز الولايات التمثيل الغذائي من المراحل التنموية المختلفة التي لوحظت في ظهارة الأنبوبي بواسطة 2-فوتون ليزر المسح المجهري.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل الكتلة، DFG التميز "التهاب في واجهات" (RA-إذا، RA-D). ونحن ممتنون للمساعدة فنية ممتازة من Wischnat كريستين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة فهرس العدد تعليقات
DMEM PAA E15-843
RPMI PAA R15-802
FCS PAA A15-101
سيكلوهيكسيميد سيغما - الدريتش
الإشتراكي الواق مختلف انظر الوصفة أدناه
مونتي مثبت مختلف انظر الوصفة أدناه
الصوديوم كاكوديلات العازلة مختلف انظر الوصفة أدناه
Richardson وصمة عار مختلف انظر الوصفة أدناه

وصفات:

1. الإشتراكي الواق

  1. إضافة السكروز 75 ز.
  2. إضافة فوسفات الصوديوم 2،47 غرام.
  3. إضافة فوسفات أحادية الصوديوم 0،36 غرام.
  4. إضافة حمض الغلوتاميك 0.72 غرام.
  5. شغل إلى 1 لتر ماء مقطر مع.
  6. ضبط درجة الحموضة إلى 7.3.

2. 0.1 كاكوديلات الصوديوم M العازلة، ودرجة الحموضة 7.35.

  1. إضافة حامض 42.80 dimethylarsenic ز ملح الصوديوم.
  2. إضافة 68.46 السكروز ز.
  3. شغل إلى 1 لتر ماء مقطر مع. للحصول على 0.2 كاكوديلات الصوديوم العازلة M.
  4. قبل استخدام محلول مخفف مع ماء مقطر. والمطلوب التركيز وضبط درجة الحموضة إلى 7،35 إذا لزم الأمر.

3. مونتي مثبت

  1. إضافة 156 مل من الصوديوم 0.12 M العازلة كاكوديلات. 3.2 أضف 25 مل glutardialdehyde 25٪ في ماء مقطر.
  2. إضافة 19 مل10٪ لامتصاص العرق في دست المائية.
  3. أضف 3 مل CaCl 3٪ 2 في دست المائية.
  4. ضبط درجة الحموضة إلى 7،35 وملء مع ماء مقطر. إلى حل نهائي 312 مل.

4. ريتشاردسون وصمة عار

  1. خلط أجزاء متساوية من زرقة الميثيلين 1٪ في 1٪ حل البوراكس مائي و 1٪ الثاني دازور في دست المائية.

المراجع

  1. Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping. J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).
  2. Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility. Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).
  3. Peipert, J. F. Clinical practice. Genital chlamydial infections. N. Engl. J. Med. 349, 2424-2430 (2003).
  4. Mardh, P. A. Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis. Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).
  5. Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells. Mol. Cancer. 5, 55(2006).
  6. Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells. Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).
  7. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
  8. Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection. Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).
  9. Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).
  10. Wyrick, P. B., Knight, S. T. Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin. J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).
  11. Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring. Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة