تحديد بروتين في مجمعات كولاي استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Mohan Babu; Olga Kagan; Hongbo Guo; Jack Greenblatt; Andrew Emili

doi:10.3791/4057

Method Article

تحديد بروتين في مجمعات كولاي استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

DOI:

10.3791/4057

⸱

November 12th, 2012

Mohan Babu¹^,² , Olga Kagan¹ , Hongbo Guo¹ , Jack Greenblatt¹^,³ , Andrew Emili¹^,³

¹Banting and Best Department of Medical Research, Donnelly Centre, University of Toronto, ²Deparment of Biochemistry, Research and Innovation Centre, University of Regina, ³Department of Medical Genetics and Microbiology, University of Toronto

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنقية البروتينات من تقارب الموسومة بالاشتراك مع مطياف الكتلة (الألغام المضادة للأفراد) هو وسيلة قوية لرسم خرائط منهجية لشبكات التفاعل البروتين وعن التحقيق في أساس الآلية من العمليات البيولوجية. هنا، نحن تصف والأمثل متتابعة الببتيد تقارب الإجراء الألغام المضادة للأفراد (SPA) وضعت لبكتيريا كولاي التي يمكن استخدامها لعزل وتوصيف البروتين مستقرة متعددة لمجمعات بالقرب من التجانس بدءا من أرقام حتى نسخة منخفضة لكل خلية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حيث أن معظم عمليات توسط الخليوي عن الجمعيات الجزيئات، وتحديد منهجية للبروتين البروتين التفاعلات (PPI) وتحديد تكوين الوحيدات من البروتين المجمعات متعددة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة وظائف الجينات وتعزيز فهم النظم البيولوجية ^{1 و 2.} يمكن تعيين التفاعلات المادية مع ارتفاع العزلة vialarge النطاق الثقة وتوصيف البروتين المجمعات المحلية تحت ظروف شبه الفسيولوجية على أساس تنقية تقارب من البروتينات صبغويا الموسومة بالاشتراك مع مطياف الكتلة (الألغام المضادة للأفراد). وقد تم تطبيق هذا النهج بنجاح في الكائنات المتنوعة تطويريا، بما في ذلك الخميرة والذباب، والديدان، وخلايا الثدييات، والبكتيريا ^1-6. على وجه الخصوص، قد ولدت لدينا محطة كربوكسي لتقارب الببتيد متتابعة (SPA) نظام ثنائي لوضع علامات تقارب تنقية البروتين المجمعات الأصلية من مثقف كولاي سالبة الجرام، وذلك باستخدام جنرال الكتريكnetically-لين العريكة سلالات مختبر المضيفة التي يتم مناسبة تماما للالجينوم على نطاق التحقيقات في البيولوجيا الأساسية وعمليات الحفظ من بدائيات النوى ^{1، 2، 7.} لدينا نظام العنونة SPA مماثل للأسلوب تنقية جنبا إلى جنب تقارب وضعت أصلا للخميرة ^{8، 9،} ويتكون من الببتيد ملزمة كالمودولين (CBP)، يليه موقع الانقسام البروتيني للفيروس التبغ محددة للغاية حفر (TEV) وثلاث نسخ من حاتمة FLAG (FLAG 3X)، والسماح لجولتين متتاليتين لتخصيب تقارب. بعد التضخيم راديو كاسيت، تتكامل تسلسل محدد الخطية المنتجات PCR-SPA ترميز علامة وعلامة اختيار في الإطار أعرب وكما كربوكسي لمحطة اندماج في خلفية DY330 التي يسببها عابر للتعبير عن ذات كفاءة عالية لامدا عاثية مغاير إعادة التركيب نظام ^10. الخطوة اللاحقة ثنائي تنقية باستخدام كالمودولين والخرز تقارب مكافحة FLAG تمكن انتقائية للغايةوالانتعاش كفاءة منخفضة حتى مجمعات البروتين وفرة من الثقافات على نطاق واسع. ثم يتم استخدام مطياف الكتلة جنبا إلى جنب لتحديد ثابت شارك في تنقية البروتينات مع حساسية عالية (الأقل حدود الكشف نانوغرام).

هنا، نحن تصف مفصلة خطوة بخطوة الإجراءات التي نستخدمها عادة للمنهجية تنقية البروتين، ووضع علامات قياس الطيف الكتلي على أساس تحليل المجمعات البروتين للذوبان من E. كولاي، والتي يمكن الارتقاء بها ومصممة يحتمل أن الأنواع البكتيرية الأخرى، بما في ذلك بعض مسببات الأمراض الانتهازية التي هي قابلة للrecombineering. يمكن للتفاعلات الناجمة المادية كثيرا ما تكشف مكونات غير متوقعة للاهتمام والاتصالات اقتراح روابط آليا الرواية. دمج البيانات مع البيانات البديلة PPI جمعية الجزيئية مثل تفاعل (الجينات الجين) الوراثي الجيني و-السياق (GC) التنبؤات يمكن أن يسهل استجلاء هذه المنظمة العالمية الجزيئية المتعددة البروتين داخل المجمعات ثنائيةological مسارات. شبكات توليد E. ويمكن استخدام القولونية إلى التبصر في العمارة الفنية للمنتجات الجين في orthologous الميكروبات الأخرى التي تعاني من نقص وظيفي الشروح حاليا.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. بناء الجينات المحددة في وضع العلامات SPA E. القولونية سلالة DY330

يتم استخدام البلازميد pJL148 يشمل تسلسل DNA-SPA علامة وعلامة الكاناميسين المقاومة للمضادات الحيوية كاسيت (اساسه ^R) كقالب في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) التضخيم ^7. ال 45 NT الجينات المحددة التمهيدي إلى الأمام، وتقع المنبع مباشرة من المحطة كودون الهدف الجينات في الإطار مع بي بي في 27 ('5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3) التمهيدي إلى الأمام علامة محددة، وقدرها 45 NT الجينات المحددة التمهيدي العكسي، وتقع مباشرة وتستخدم محطة المصب من كودون الهدف الجينات في الإطار مع بي بي 27 (5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 ') علامة التمهيدي عكس محددة، لتضخيم علامة ^SPA-R كاسيت واساسه من pJL148 باستخدام PCR التالية الدراجات الظروف: 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و 30 ° C دورات 94 لل1 دقيقة و 55 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 68 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة 2 ثانية، تليها C ° 68 لمدة 10 دقيقة. هذه المتتاليات تضخيم خدمةق ركائز لعرض ectopically λ الأحمر آلات إعادة التركيب مثلي (انظر أدناه).
يتم تنقيته من المنتج PCR PCR باستخدام تنقية Qiaquick عدة لإزالة الأملاح التي قد تتداخل مع الصعق الكهربائي. ويستهدف المنتج PCR في وقت لاحق إلى دمج المنقى في نهاية 3 '(المنبع مباشرة من كودون وقف الأم) من جين معين في DY330 سلالة وهو ما يعبر عنه في آلية إعادة التركيب λ الأحمر ^10.
ويزرع في DY330 λ الأحمر معربا عن سلالة بين عشية وضحاها في 2 مل المتوسطة (LB) لوريا Bertani-C ° 32 في بهز في 180 دورة في الدقيقة. وفيما بعد تلقيح 1 مل من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 70 مل المتوسطة LB جديدة في قارورة 500 مل المخروطية. ويزرع على اللقاح في C ° 32 عن طريق هز في 180 دورة في الدقيقة حتى تصل إلى ₆₀₀ OD ~ 0.8.
يتم نقل الثقافة في قارورة جديدة 250 مل المخروطية، حيث يسببها الخلايا عن طريق احتضان القارورة في حمام مائي في 42 ° C عن طريق هز بلطف على180 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. مباشرة بعد الاستقراء، وحضنت القارورة في حمام الطين جليد الماء لمدة لا تقل 30 دقيقة مع اهتزاز.
وعلى الفور انتقلت ثقافة الجليد الباردة إلى ما قبل 50 مل أنبوب المبرد البولي بروبلين وتعرض للالطرد المركزي في 3993 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. وبيليه معلق الخلية في 50 الماء المثلج مل العقيمة وطرد مرة أخرى في 3993 x ج لمدة 6 دقائق في C. ° 4 ومعلق ثم بيليه خلية في 1 مل من الماء البارد ونقل إلى أنبوب 1.5 مل Effendorf، وطرد في أقصى سرعة لمدة 20 ثانية في C. ° 4 بعد دورتين أو ثلاث خطوات الغسيل بالماء البارد الجليد، ومعلق على بيليه الخلية وأخيرا في 700 ميكرولتر من الماء المثلج العقيمة، مما أدى إلى الخلايا الكهربائية المختصة.
من خلال الصعق الكهربائي، وقدم أحد ميكرولتر من AMPLICON المنقى إلى 40 ميكرولتر من الخلايا الكهربائية المختصة. وelectroporated الخلايا في الثاني GenePulser بيو راد مع الإعدادات التالية: 2.5 كيلو فولت، 25 المكثف مع نبضتحكم من 200 Ω. بعد إعادة التركيب مثلي والتكامل، يتم تحديد معاد بنجاح transformants أن العلامة / راديو كاسيت في الكروموسوم على أساس المقاومة لكان (الشكل 1A). ويتم اختيار transformants متعددة لغربي النشاف للتحقق من الجيل الصحيح (أي إشارة إيجابية) من SPA-الموسومة البروتينات الانصهار مع الأجسام المضادة لمكافحة FLAG M2 وهذا هو انتقائية ضد الحواتم علم TAG-SPA.
وأكد مثقف كربوكسي سلالة محطة الانصهار SPA-علامة على نطاق واسع لعزل بروتين قابل للذوبان المجمعات تحصد من الخلايا باستخدام بروتوكول تنقية SPA. ويظهر الخطوط العريضة للخطوات التي ينطوي عليها إجراء تنقية تقارب العلامة في الشكل 1B.

2. زراعة وصوتنة

تطعيم 100 ميكرولتر من E. SPA-الموسومة القولونية الأسهم الجلسرين إلى 50 مل مرق رائع (TB) وسط سائل تستكمل مع 50 ميكرولتر من 25 ميكروغرام / مل سو اساسه حل في قارورة 250 مل المخروطية. تنمو بين عشية وضحاها في ثقافة C. ° 32
ملاحظة: بما أن درجة حرارة كاسيت λ-محرض الأحمر في سلالة DY330 تحت سيطرة كاظمة حساسة للحرارة ^10، ويزرع في كولاي SPA-الموسومة سلالة في C. ° 32
نقل 10 مل من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 990 مل الطازجة TB تستكمل مع 25 ميكروغرام / مل من اساسه في قارورة لتر 4. ويزرع ثقافة في 32 ° C مع ثابت تهتز في 250 دورة في الدقيقة، لمدة 5 إلى 6 ساعة، حتى تصل إلى ₆₀₀ OD ~ 2 إلى 3.
نقل E. 1 لتر القولونية SPA-علامة لتنظيف الزجاجات الثقافة الطرد المركزي وتدور الخلايا في 4 درجات مئوية في بيكمان J6-HC الطرد المركزي @ 3993 x ج لمدة 15 دقيقة.
تتم إزالة طاف من زجاجات الطرد المركزي. إعادة تعليق على E. الكريات الخلايا القولونية مع 25 مل من العازلة صوتنة. ضمان للحفاظ على زجاجات الطرد المركزي على الجليد في جميع الأوقات.
معلق بيليه هونقل إلى أنبوب 50 مل الصقر البولي بروبلين وجمدت باستخدام النيتروجين السائل. يتم تخزين الخلايا المجمدة في -80 درجة مئوية لمدة طويلة الأجل الاستخدام.
قبل صوتنة، ذوبان الجليد تماما الخلايا المجمدة عن طريق الحفاظ على الكريات على الجليد. يتم نقل عينات لإذابة الفولاذ المقاوم للصدأ كوب عقيمة وضعت على الجليد لصوتنة. هي غارقة التحقيق في العينة وsonicated لمدة 3 دقائق. يسمح إضافية لتبريد 2 دقيقة العينة من ارتفاع درجة الحرارة.
يتم نقل lysate الخلية في أنبوب sonicated قبل الطرد المركزي المبردة العقيمة، وتعرض ل° C الطرد المركزي في 4 في أجهزة الطرد المركزي بيكمان باستخدام JA-17 @ 35267 XG الدوار (16،000 دورة في الدقيقة) لمدة 15 دقيقة مرتين.
ملاحظة: في حالة تنقية البروتين الغشاء، ويتم طرد lysate الخلية sonicated مرة واحدة فقط لمدة 15 دقيقة لأننا لا نعرف في أي جزء من غشاء البروتينات، أي إما في بيليه أو في جزء طاف. لتجنب خسارة تتجاوز مالبروتينات الغشاء، ونحن تدور الخلايا لمدة 15 دقيقة في الطرد المركزي عالية السرعة وتتم معالجتها في وقت لاحق لتنقية طاف (انظر الخطوات أدناه) حيث يتم استخدام المنظفات 1٪ إلى ذوبان البروتينات الغشاء.
يتم نقل بعناية طاف من أنبوب إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل فالكون البولي بروبلين وجمدت باستخدام النيتروجين السائل. يتم تخزين الخلايا المجمدة استخراج sonicated لمدة أقصاها 6 أشهر في C ° -80 لاستخدامها في المستقبل.

3. تقارب تنقية

قبل الاستخدام، وغسل 100 ميكرولتر من الخرز مكافحة العلم M2 بنسبة 10 مجلدا من AFC العازلة (30 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 150 مم كلوريد الصوديوم، والمنظفات بنسبة 0.1٪، و0،1-0،5 ملم TCEP [تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين - حمض الهيدروكلوريك]) دون المنظفات والحد من TCEP عامل (تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين).
وإذابة المجمدة، واستخراج الخلايا sonicated عن طريق وضع أنبوب في الماء البارد. وحضنت استخراج خلية إذابة مع 3 ميكرولتر من بنزوnase نوكلياز لمدة 30 دقيقة في C. ° 4 لهذا الخليط، إضافة المنظفات غير الأيونية تريتون X-100 (تركيز النهائي من المنظفات يجب أن يكون 0.1٪) و 200 ميكرولتر تعليق المضادة للعلم الخرز الاغاروز M2.
ملاحظة: للحصول على جميع التنقيات البروتين القابلة للذوبان، 0.1٪ تريتون X يستخدم لتقليل-100 غير محددة الامتزاز، حيث كما لتنقية بروتين الغشاء، خفيفة مختلفة المنظفات غير الأيونية، مثل C12E8 (Octaethylene الأثير دوديسيل جليكول)، DDM ( ويمكن استخدام N-دوديسيل β-D-مالتوزيد) والمالتوز-neopentyl غليكول (MNG) بتركيز 1٪ المنظفات لتعزيز الانحلالية. منذ المنظفات المختلفة متفاوتة الكفاءة الانحلالية للبروتينات الغشاء، فمن المستحسن لأداء التنقيات البروتين مستقلة تستخدم أكثر من المنظفات.
يتم خلط محتويات بلطف عن طريق تناوب أنبوب لمدة 3 ساعة في 4 درجات مئوية باستخدام شاكر LabQuake. بعد 3 ساعة من الدوران، يتم طرد الأنبوب في 1700 x ج لمدة 6 دقائق. ثم طاف هو Removed بعناية، قدر الإمكان، من دون إزعاج فضفاضة حبة بيليه.
وبيليه معلق في طاف المتبقية ثم نقل إلى 0.8 * 4 سم بيو راد العمود الإعدادية البولي بروبلين. ضمان لإزالة المقابس مخرج الجزء السفلي من العمود، للسماح للeluates لاستنزاف من قبل تدفق الجاذبية. غسل العمود 5 مرات مع خطوة الانقسام TEV.
بعد افراغ eluates غسلها، يتم إغلاق منفذ أسفل العمود. لنفس العمود، يتم تنفيذ الانقسام عن طريق إضافة ~ 5 حتي 10 ميكرولتر (50 وحدة) من الأنزيم البروتيني TEV و 400 ميكرولتر من العازلة AFC 1X على العمود. ضمان لإغلاق أعلى العمود مع قبعة. وتناوب العمود الذي يحتوي على حبات بلطف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية خلال الليل باستخدام شاكر LabQuake.
إزالة الغطاء على الجزء العلوي والمكونات منفذ في الجزء السفلي من العمود، واستنزاف eluates عافيتها بعد انشقاق TEV في عمود الطازجة تحتوي على 200 ميكرولتر من تعليق كالمودولين-sepharose و الخرز، التي يتم غسلها بنسبة 10حجم المخزن المؤقت كالمودولين ملزمة.
يتم تثبيتها على كل من أعلى وأسفل العمود بإحكام، ويتم خلط محتويات العمود بلطف عن طريق تناوب لمدة 3 ساعة في 4 درجات مئوية باستخدام شاكر LabQuake.
بعد 3 ساعة التناوب، واستنزفت شطافة عن طريق إزالة الغطاء العلوي والمكونات السفلي من العمود. يتم غسل العمود أربع مرات مع 200 ميكرولتر من العازلة ملزمة كالمودولين 1X ثم وغسل صرامة مع 400 ميكرولتر من العازلة غسل كالمودولين.
ومزال البروتين محددة في أربعة أجزاء من 50 ميكرولتر في أنبوب إيبندورف 1X العازلة جديد يعتمد شطف كالمودولين. يتم توزيع جزء مزال في اثنين من أنابيب إيبندورف نظيفة في أحجام متساوية. يتم تجفيفها بعد ذلك باستخدام كل من أنابيب فراغ السرعة.
يتم استخدام المجفف شطافة من أنبوب واحد لتشغيل هلام تلطيخ الفضة، في حين يتم تخزين أخرى في C ° -80، قبل استخدام مطياف الكتلة.

4. الفضة تلوين

للفضة stainiنانوغرام، يضاف نصف حجم SDS 3X (كبريتات الصوديوم دوديسيل) عينة العازلة إلى 50 ميكرولتر من شطافة المجففة. بعد غلي الخليط لمدة 5 دقائق، يتم تحميل العينات على هلام بولكرلميد SDS.
بعد انتهاء تشغيل هلام، يتم وضع بعناية في حل تثبيت (الميثانول 50٪ وحامض الخليك 10٪) وتحريكها بلطف على شاكر دوارة لمدة 20 دقيقة. يتم شطف ثم جل في الإيثانول 20٪ لمدة 10 دقيقة.
يتم غسل هلام الثابتة بدقة مرتين مع 500 مل من الماء المقطر مزدوجة لمدة 10 دقيقة للتأكد من انخفاض خلفية موحدة.
يتم تحريكها بلطف ثم جل 500 مل في ثيوسلفات الصوديوم لمدة 1 دقيقة، تليها خطوتين الغسيل مع الماء المقطر لمدة 20 ثانية.
يتم تجاهل المياه، وحضنت الجل في 200 مل من نترات الفضة 0.1٪ لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك الوقت، تتم إزالة نترات الفضة ويتم غسل هلام مع الماء المقطر لمدة 20 ثانية لإزالة نترات الفضة الزائدة.
واخيرا ومن الجل تحريكها في 75 ملمن الحل النامية. عندما يتحقق شدة المطلوب، يتم تجاهل الحل النامية ويضاف 80 مل من حمض الخليك لوقف رد الفعل. ضمان لاحتضان الجل في حامض الخليك مدة لا تقل عن 20 دقيقة لتصور سليم من العصابات هلام.

5. التحلل البروتيني وتحضير العينة لقياس الطيف الكتلي

إلى عينة المجففة، إضافة 50 ميكرولتر من العازلة ميكرولتر الهضم و 0.9 100 مم TCEP، حمض الهيدروكلوريك (تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين - حمض الهيدروكلوريك) واحتضان الخليط لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للخطوة التخفيض. المقبل، يتم إضافة 1 ميكرولتر من iodoacetamide 500 مم وحضنت في الظلام لمدة 40 دقيقة للسماح للألكلة العينة.
بعد الجولة الثانية من الحضانة، إضافة 1 ميكروغرام من التربسين يجمد الخليط لاحتضان وإما في C ° 37 ساعة لمدة 5 أو بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. ضمان لوقف رد فعل من خلال إضافة 1 ميكرولتر من حمض الخليك.
قبل الرطب Millipoتلميح ماصة إعادة الرمز البريدي تلميح بواسطة الشفط 10 ميكرولتر من حل التبول وموازنة. الاستغناء الحل لنضيعه. نضح في وقت لاحق 10 ميكرولتر من الحل الغسيل والاستغناء الحل لنضيعه. كرر هذه الخطوة مرتين.
للربط الفعال للخليط الببتيد إلى الطرف، مزيج ماصة الخليط الببتيد 20 مرة. يتم غسل الخليط الببتيد التي انضمت إلى تلميح قبالة عن طريق الشفط والاستغناء الحل الغسيل. كرر هذا الإجراء مرتين للربط الفعال للخليط الببتيد إلى الحافة.
مع تلميح التي تحتوي على الببتيد محدد، نضح 10 ميكرولتر من حل التبول وموازنة، والاستغناء في أنبوب إيبندورف نظيفة. كرر هذه الخطوة مرتين. بعد تجفيف العينات مزال في الفراغ سرعة، يمكن تحليل العينات على الفور من قبل مطياف الكتلة أو تخزينها في -80 درجة مئوية قبل الاستخدام.

6. تحديد بروتين عن طريق مطياف الكتلة Orbitrap LTQ Velos

اليتم تحديد المكونات الإلكترونية ببتيد من المجمعات المعزولة باستخدام Orbitrap LTQ Velos الشامل جنبا إلى جنب مطياف الهجين. وOrbitrap لديه السلطة لحل استثنائية (> 60000 العرض الكامل نصف الحد الأقصى، أو FWHM) ودقة الشامل (<2 جزء في المليون) التي تقلل MS / MS أخذ العينات من الملوثات غير ذي صلة الخلفية غير محددة في الكشف عن التنقيات السيطرة، في حين أن عالية السرعة فخ أيون Velos يمكن الكشف عن مكون والببتيدات جزء فرة منخفضة باستخدام كل من الإلكترون والتفكك نقل التصادم الناجم عن وسائط التفكك. يتم تعيين ثقة عالية بين المباريات مما أدى MS / MS الأطياف المرجعية لE. تسلسل البروتين القولونية باستخدام قاعدة بيانات خوارزمية البحث مثل SEQUEST وكل تسلسل مطابقة تقييمها خلال خوارزمية احتمال مثل STATQUEST ^11. وتعتبر عدد الأطياف المجموع، تفرد تسلسل الببتيد والملوثات المشتركة الكشف عن خلفية في السيطرة السلبية (أي. همية) التنقيات لتحقيق انخفاض التجريبية كاذبة ديسمعدل covery. يتم تنفيذ الخطوات التالية لتحديد البروتين:

كانت معبأة في الأعمدة الصغيرة مع 10 سم من ~ 3 ميكرومتر لونا-C ₁₈ و الراتنج وتفاعل لايون Proxeon مصدر nanoelectrospray التي يتم وضعها وفقا لأداة Orbitrap.
ويستخدم تدفق نانو Proxeon ثنائي HPLC مضخة لتقديم نصيحة تدفق مستقر معدل ~ 300 دقيقة ^-1 NL خلال فصل الببتيد.
لتحقيق شطف الببتيد، يتم تعيين التدرج العازلة يصل العضوية وفقا لتعقيد العينة. على سبيل المثال، يتم عادة تعيين التدرج التالي لتصل E. عينات SPA القولونية: يتم زيادة B المذيبات من 2٪ إلى 6٪ في 1 دقيقة، إلى 24٪ في 38 دقيقة، إلى 100٪ في الحد الأدنى 4 التالي، الذي عقد في 100٪ لمدة 1 دقيقة، ثم انخفضت إلى 2٪ في 1 دقيقة، وعقد في النهائي 2٪ لمدة 15 دقيقة. الطور المتحرك مذيب A لديه 95٪ HPLC والمياه التدرج ACN 5٪ مع حمض الفورميك بنسبة 0.1٪، في حين B المذيبات والماء 5٪ التدرج HPLC وACN 95٪ مع المجلس الدولي للمطارات الفورميك بنسبة 0.1٪د. تم تعيين معدل التدفق في رأس الإبرة إلى 300 دقيقة ^-1 NL لمدة 60 دقيقة.
كما دورات مطياف الكتلة تشغيل المسح الشامل من خلال واحدة كاملة في قرارات 60000، يتم جمع 10 تجزئة المسح الشامل جنبا إلى جنب يصاحب ذلك للأيونات السلائف على أشده. يتم تمكين استبعاد الحيوية، monoisotopic اختيار الشامل، وحيازة الصك في الوقت الحقيقي ميزات البيانات التابعة.
يتم البحث الأطياف باستخدام خوارزمية البحث في قاعدة البيانات مثل SEQUEST مقابل قاعدة بيانات من E. يتم تصفية إحصائيا تسلسل البروتين القولونية، والنتيجة باستخدام خوارزمية احتمال مثل STAQUEST ¹¹ إلى ضمان انخفاض معدل اكتشاف كاذبة. ويتم اختيار المرشحين الثقة العالية فقط (99٪ الاحتمال)، في حين تظهر مباريات أكثر من 10 جزء في المليون مقارنة الخطأ الشامل لكتلة الببتيد النظرية يتم استبعاد لمزيد من الدراسة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بمجرد وضع علامة على بروتينات الطعم ، والتي يتم التعبير عنها عند مستويات داخلية ، يتم تنقية التقارب من مزارع الطور اللوغاريتمي ، تم تشغيل العينات على هلام صبغة فضية لتصور مكونات عديد الببتيد الفردية للمجمعات المستقرة المعزولة. قمنا أيضا بتعريض جزء ثان من عينات البروتين المنقى بالتقارب لقياس الطيف الكتلي الترادفي الخالي من الهلام (LCMS) لتحديد تسلسلات عديد الببتيد المقابلة. تظهر فعالية إجراء APMS هذا من خلال تحليل SDS-PAGE التمثيلي لمكونات مجمعات بروتين الحديد والكبريت SufBCD (Fe-S) التي تم تنقيتها بالتقارب من الإشريك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أحد الجوانب الرئيسية لنهج القائم على الألغام المضادة للأفراد SPA الموصوفة هنا هو أن يتم تنفيذ علامات في السياق الطبيعي الكروموسومات، وبالتالي ضمان تنظيم الجينات العادية يتم الاحتفاظ (أي. المروج الطعم الأصلي الحفاظ عليها، وبالتالي لا قلق مستويات التعبير) والأم ثابت المرتبطة يتم استرداد مجمعات البروتين في شبه الذاتية المستويات. وتجنب أيضا قضايا القطبية OPERON من قبل بما في ذلك المروج الموجهة ظاهريا في علامة اختيار. هذا النهج هو SPA العنونة فعالة بما فيه الكفاية لتنقية مكونا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل الأموال من المؤسسة الكندية للإبداع وكندا الجينوم، ومعهد أونتاريو علم الجينوم، وزارة أونتاريو للابتكار، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة ومنحة لJG AE E. والأحمر، معربا عن كان القولونية سلالة DY330 هدية من نوع دونالد L. المحكمة (المعهد الوطني للسرطان، فريدريك، MD).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments < td colspan = "4" >2. مرق رائع متوسط < / قوي > بروميد بيكمان كولتر TJ-25 جهاز طرد مركزي بيكمان كولتر TS-5.1-500 32 درجة ؛< td colspan = "4" >7. الرحلان الكهربائي والنشاف الغربي < / قوي > جهاز فيلم ورقة < td colspan = "4"><قوي>8. معدات وكواشف الصوتنة < / قوي >td colspan = "4" >9. كواشف ومعدات تنقية التقارب< / قوي> ميليبور الكتلة 4 الدقيقة < td colspan = "4" > Buffers and Solutions

1. 1 لتر وسائط مرق رائع (TB) 11 جم Bio-Tryptone
22 جم مستخلص الخميرة
2٪ جلسرين
50 مل مرق ملح البوتاسيوم solution

2. محلول مخزون ملح البوتاسيوم

1.5 M K_{2HPO_{4
0.35 M KH_{2PO_{4}}}}

3. Sonication Buffer 20 ملي مولار Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.9)
150 ملي كلوريد الصوديوم 0.2 ملي مولار EDTA
10٪ جلسرين
قبل الاستخدام أضف مثبط أنزيم البروتياز (PI) و 0.1-0.5 ملي مولار TCEP

4. AFC buffer

30 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 7.9)
150 ملي كلوريد الصوديوم
0.1٪ منظف
قبل الاستخدام أضف PI و 0.1-0.5 ملي مولار TCEP

5. المخزن المؤقت للانقسام TEV 

30 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 7.9)
150 ملي كلوريد الصوديوم
0.2 ملي مولار EDTA
0.1٪ منظف
قبل الاستخدام أضف PI و 0.1-0.5 ملي مولار TCEP

6. المخزن المؤقت لربط Calmodulin 30 mM Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.9)
150 ملي مولار كلوريد الصوديوم 2 ملي مولار كلوريد الصوديوم < الفرعي >2 
0.1٪ منظف
قبل الاستخدام أضف PI و 0.1-0.5 ملي مولار TCEP

7. كالمودولين المخزن المؤقت للغسيل 

30 ملي مولار Tris-HCl الرقم الهيدروجيني 7.9
150 ملي مولار كلوريد الصوديوم 2 ملي مولار CaCl _{2
0.1-0.5 mM TCEP }

8. كالمودولين المخزن المؤقت للشطف

30 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 7.9)
100 ملي مولار كلوريد الصوديوم
10 ملي مولار EGTA
0.1-0.5 ملي مولار TCEP

9. تطوير المحلول (1 لتر) < / ص > < ص الفئة = "jove_content" >37٪ الفورمالديهايد
30 جم كربونات الصوديوم
1000 مل ماء مقطر < / ص > < ص فئة = "jove_step" >10. المخزن المؤقت للهضم

50 mM NH_{4HCO₃
1 mM CaCl₂}

11. محلول الترطيب والتوازن

70٪ أسيتونيتريل (ACN) في 0.1٪ حمض الفورميك < / ص > 12. محلول الغسيل

100٪ H_{2O في 0.1٪ حمض الفورميك }

I. المضادات الحيوية < / strong>
Kanamycin	Bioshop	#KAN201
Ampicillin	Bioshop	#AMP201
بيو تريبتون	بيو	#TRP 402
مستخلص الخميرة	بيوشوب	#YEX 555
جلسرين	بيوشوب	#GLY 002
ك < ساب > 2 < / فرعي > HPO < sub >4 < / sub >	Bioshop	#PPM 302
KH_{2< / sub>PO_{4< / sub>}}	Bioshop	#PPM 303
<قوي>3. سلالة بكتيرية وبلازميد< / قوي>
DY330		يو <إم>وآخرون< / إم>. (2000)¹⁰
pJL148		Zeghouf et al. (2004)⁷
4. كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل والرحلان الكهربائي < / قوي >
Taq DNA	polymerase Fermentas	# EP0281
10 × PCR buffer	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl _{2< / sub>}	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Loading صبغ	NEB	#B7021S
الإيثيديوم	Bioshop	# ETB444
10X TBE عازلة	حراري علمي	# 28355
تريس بيس	بيوشۆب	#TRS001
حمض	البوريك Bioshop	#BOR001
0.5 م EDTA (درجة الحموضة 8.0)	Sigma	# E6768
سلم الحمض النووي	NEB	#N3232L
5. مجموعات عزل البلازميد وتنظيفه < / قوية >
طقم بلازميد ميدي	Qiagen	# 12143
طقم تنقية QIAquick PCR	Qiagen	# 28104
6. PCR ومعدات التحويل< / قوي >
الحرارية Cycler	BioRad	iCycler
Agarose هلام الرحلان الكهربائي	BioRad
Electroporator	Bio-Rad	GenePulser II
0.2 سم كهربائي كوفيت	Bio-Rad
42 & درجة ؛ شاكر حمام مائي C	Innova 3100

سي شاكر	نيو برونزويك العلمي ، الولايات المتحدة الأمريكية
32 درجة ؛ C كبير شاكر	نيو برونزويك العلمي ، الولايات المتحدة الأمريكية
32 درجة ؛ حاضنة الألواح C	فيشر العلمي
مونومر أكريلاميد ، N ، N'- ميثيلينبيس أكريلاميد	Bio-Rad	# 161-0125
بيرسلفات الأمونيوم	Bioshop	# AMP001
n-butanol	Sigma	# B7906
TEMED	Bioshop	#TEM001
Whatman رقم 1 ورق ترشيح	فيشر العلمي	# 09-806A
جهاز نقل هلام البروتين الصغير 3 خلايا	Bio-Rad	# 165-3301
iBlot	نقل هلام Invitrogen	#IB1001
أغشية النيتروسليلوز	Bio-Rad	# 162-0115
أحادي النسيلة المضاد للعلم M2 الجسم المضاد	سيجما	#F3165
الفجل بيروكسيداز	أميرشام	#NA931V
ملطخ مسبقا معايير الوزن الجزيئي للبروتين	Bio-Rad	# 161-0363
كاشف التلألؤ الكيميائي	بيرس	# 1856136
التصوير الشعاعي	الذاتي Clonex Corp	#CLEC810
النشاف السحب السريع	سيجما	#P7796
C2 منصة هزاز شاكر	نيو برونزويك العلمية ، الولايات المتحدة الأمريكية
سونيكاتور	برانسون بالموجات فوق الصوتية	# 23395
كلوريد الصوديوم	Bioshop	#SOD001
مثبطات الإنزيم البروتيني	روش	# 800-363-5887
0.5 ملي متر TCEP-HCl	الحرارية العلمية	# 20490 <
0.8 × 4 سم عمود البولي بروبيلين Bio-Rad	Bio-Rad #	732-6008
نوكلياز البنزونازي	Novagen	# 70746
خرز الاغاروز M2 المضاد للعلم	سيجما	#A2220
حبات كالمودولين سيفاروز	GE Healthcare	# 17-0529-01
TEV protease	Invitrogen	# 12575-015
Triton X-100	Sigma	#T9284
CaCl _{2< / sub >}	Sigma	#C2661
EGTA	Sigma	#E3889
LabQuake Shaker	Thermolyne	# 59558
10. كواشف تلطيخ الفضة < / قوي >
ميثانول		بيوشوب #MET302
حمض الخليك	Bioshop	t # ACE222
صوديوم ثيوكبريتات	سيجما	#S-7143
نترات الفضة	فيشر العلمية	#S181 -100
فورمالديهايد	بيوشۆب	#FOR201
كربونات	الصوديومBioshop	#SOC512
11. الكواشف والمعدات لتحديد البروتين < / قوي >
التربسين الذهب ، قياس الطيف الكتلي الصف	Promega	# V5280
50 ملي مولار NH_{4< / sub>HCO_{3< / sub>}}	Bioshop	#AMC555
1 ملي مولار CaCl _{2< / sub>}	Bioshop	#CCL302
Acetonitrile	Sigma	#A998-4
Formic حمض	سيجما	#F0507
HPLC درجة المياه	سيجما	# 95304
يودوأسيتاميد	سيجما	# 16125
ميليبور الرمز البريدي		# ZTC18M960
~ 10 سم من 3 & مو ؛ م Luna-C18 الراتنج	Phenomenex
Proxeon نانو مضخة HPLC	الحرارية فيشر العلمي
LTQ Orbitrap Velos مطياف		Thermo Fisher العلمي
<قوي>12. Labware< / قوي>
لتر قوارير مخروطية	VWR	# 89000-372
50 مل أنابيب صقر البولي بروبلين أي	بائع
1.5 مل أنابيب الطرد المركزي	أي بائع
250 مل قشور مخروطية	VWR	# 29140-045
15 مل أنابيب ثقافة معقمة	علمية حرارية	# 366052
قوارير مبردة	VWR	# 479-3221-80
° ؛ C الفريزر	فيشر العلمي	# 13-990-14
نظام فراغ السرعة	الحرارية العلمي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, e1000096(2009).
Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
Mak, A. B., et al. A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency. Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).
Polanowska, J., et al. Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 36, 778-782 (2004).
Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
Kislinger, T., et al. PRISM, a generic large scale proteomic investigation strategy for mammals. Mol. Cell Proteomics. 2, 96-106 (2003).
Vlasblom, J., et al. GenePro: a Cytoscape plug-in for advanced visualization and analysis of interaction networks. Bioinformatics. 22, 2178-219 (2006).
de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174(2008).
Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

تحديد بروتين في مجمعات كولاي استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

In This Article

Summary

Abstract

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles