بروتوكول لتحديد البروتين البروتين التفاعلات على أساس 15 N صفها الأيض، مناعي، الكمي والتحوير الطيف الكتلي الانجذاب

Summary

نقدم شكلا مختلفا للنهج QUICK (مناعي الكمية جنبا إلى جنب مع ضربة قاضية) التي تم تقديمها سابقا على التمييز بين البروتين البروتين التفاعلات الصواب والخطأ. ويستند نهجنا على ^15N وضع العلامات الأيضية، والتشكيل من الانتماءات من البروتين البروتين التفاعلات من خلال وجود / عدم وجود ATP، مناعي، والكمية مطياف الكتلة.

Abstract

البروتين البروتين التفاعلات الأساسية للكثير من العمليات البيولوجية في الخلية. ولذلك، تكييفها يلعب دورا هاما في الأبحاث الحالية وعدد كبير من وسائل لتحقيقها متاح ^1. البروتين البروتين التفاعلات غالبا ما تكون ديناميكية للغاية، وربما تعتمد على توطين التحت خلوية، بعد التعديلات متعدية والبيئة المحلية البروتين ^2. ولذلك، ينبغي التحقيق فيها في بيئتها الطبيعية، والتي شارك في مناعي النهج هي الطريقة المفضلة ^3. يتم تحديد الشركاء التفاعل المشترك عجلت إما عن طريق immunoblotting في خطوة هادفة، أو عن طريق مطياف الكتلة (LC-MS/MS) بطريقة غير مستهدفة. الاستراتيجية الأخيرة غالبا ما يتأثر سلبا من قبل عدد كبير من الاكتشافات إيجابية كاذبة، والمستمدة أساسا من حساسية عالية من الطيف الشامل الحديثة التي تكشف عن آثار بثقة unspecifically البروتينات عجل. A recenويستند النهج ر للتغلب على هذه المشكلة على فكرة أن انخفاض كميات من الشركاء معينا سوف يعمل على التفاعل المشترك مع يعجل بروتين هدف معين الخلوية التي يتم التركيز بنسبة رني، في حين أن كميات البروتينات عجل unspecifically ينبغي أن يكون تتأثر. هذا النهج، ووصف سريع لمناعي الكمية جنبا إلى جنب مع ضربة قاضية ^4، توظف مستقرة وصفها نظائر الأحماض الأمينية في الثقافة خلية (SILAC) ⁵ وMS لقياس كميات من البروتينات immunoprecipitated من سلالات البرية من نوع ونهدم. ويمكن اعتبار البروتينات الموجودة في نسبة 1:1 كما الملوثات، تلك المخصب في رواسب من نوع البرية كشركاء التفاعل محددة من البروتين الهدف. على الرغم من أن المبتكرة، QUICK يحمل بعض القيود: أولا، SILAC من حيث التكلفة مكثفة ومحدودة بالنسبة للكائنات التي هي من الناحية المثالية العوز الغذائي و / أو أرجينين يسين. النتائج interconversion وعلاوة على ذلك، عندما يتم تغذية أرجينين الثقيلة، أرجينين إلى البرولين في additIONAL الشامل لكل التحولات البرولين في الببتيد ويخفف قليلا الثقيلة مع أرجينين ضوء، مما يجعل الكمي أكثر مملة وأقل دقة ^5،6. الثاني، QUICK يتطلب أن يتم معاير الأجسام المضادة بحيث لا تصبح مشبعة البروتين المستهدف في مقتطفات من ضربة إلى أسفل المسوخ.

هنا نقدم بروتوكول تعديل QUICK الذي يتغلب على القيود المذكورة أعلاه من خلال استبدال QUICK SILAC لوضع العلامات ¹⁵ N التمثيل الغذائي من خلال استبدال ورني بوساطة ضرب لأسفل لتعديل النسب من البروتين البروتين التفاعلات. نبين إمكانية تطبيق هذا البروتوكول باستخدام الطحالب وحيدة الخلية الخضراء المتلحفة reinhardtii والحي النموذجي وكوصي HSP70B بلاستيدات الخضراء والبروتين الهدف ⁷ (الشكل 1). ومن المعروف HSP70s محددة للتفاعل مع مرافقين التعاون وركائز الدولة الوحيدة في ADP ^8. نستغل هذه الخاصية كوسيلة للتحقق من معينتفاعل مع HSP70B عامل من النقد النوكليوتيدات CGE1 ^9.

Protocol

1. الأجسام المضادة الامتزاز

1. تزن من 120 ملغ من البروتين sepharose و في أنبوب مخروطي 15-مل (فالكون). إلى 15 ملغ بروتين وهناك حاجة إلى sepharose و لكل مناعي (IP) هذا المبلغ يكفي لمدة 8 المتكاملة. إضافة 5 مل الفوسفات 0.1 M العازلة (درجة الحموضة 7.4)، والسماح للبروتين A تضخم sepharose و لمدة 30 دقيقة في C. ° 4

(لاحظ أن جميع الخطوات من هذه النقطة على ضرورة أن تنفذ مع قفازات لتجنب التلوث مع الكيراتين وعلى الجليد لتفادي التدهور البروتين / التفكك معقدة.)

2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 60 ثانية على ارتفاع 1،000 XG و 4 ° C لبيليه على البروتين تورم A sepharose و. إزالة بعناية طاف و resuspend حبات في 5 مل العازلة الفوسفات 0،1 M (درجة الحموضة 7.4). كرر هذه الخطوة ثلاث مرات لغسل حبات جيدا.
3. بعد الخطوة الطرد المركزي الأخيرة، إزالة طاف وترك حوالي 0.5 مل من العازلة الفوسفات. إضافة 0.9 مل الفوسفات 0،5 M العازلة (درجة الحموضة 7.4)، 400تقارب الأجسام المضادة الأولية تنقية ميكرولتر (50 ميكرولتر لكل IP) ضد البروتين المستهدف (هنا HSP70B)، و 16 ميكرولتر الأجسام المضادة ضد بروتين التحكم (هنا CF1β). تمتلئ DDH ₂ O إلى إجمالي حجم 5 مل.

(لاحظ أن يجب استخدام تقارب الأجسام المضادة-تنقيته للحد من التلوث الجماعات الحكومية الدولية غير محددة، والتي تتداخل مع نانو LC-MS تحليل - لبروتوكول رؤية Willmund وآخرون (2005) ¹⁰ وعجلت CF1β كعنصر تحكم التحميل واختيار و. لأنها وفيرة، وبعد تحلل الخلايا، موجودة في أجزاء القابلة للذوبان والغشاء. بدلا من ذلك، يمكن استخدام مستويات البروتينات تلويث لتطبيع للتحميل غير متكافئة.)

4. تسمح البروتين الخرز sepharose و الجماعات الحكومية الدولية إلى كثف خلال الحضانة 1-C ° ساعة في 25 على الأسطوانة أنبوب (CAT RM5W، 36 دورة في الدقيقة).
5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 60 ثانية على ارتفاع 1،000 XG و 4 ° C إلى A بيليه على البروتين الخرز sepharose و. إزالة بعناية طاف وصesuspend حبات في 5 مل العازلة 0.1 M بورات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 9.0). كرر هذه الخطوة ثلاث مرات لإزالة تماما الأمينات التي من شأنها أن إخماد crosslinker.
6. تزن 25،9 ملغ من خارج الطازجة والصلبة dimethylpimelimidate و resuspend في 5 مل العازلة 0.1 M بورات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 9.0) للحصول على تركيز النهائي من 20 ملم. إضافة إلى هذا الحل على البروتين A الخرز sepharose و.
7. السماح لجماعات الحكومية الدولية الارتباط العبور إلى البروتين لمدة 30 دقيقة في C ° 25 على الأسطوانة الأنبوب.
8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 60 ثانية على ارتفاع 1،000 XG و 4 ° C لبيليه الخرز. إزالة بعناية طاف و resuspend حبات في 5 1 مل M تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة) لإرواء crosslinker مجانا. كرر هذه الخطوة مرة واحدة واحتضان لمدة 2 ساعة عند درجة حرارة 25 مئوية أو ساعة 12-24 في 4 درجات مئوية على الأسطوانة الأنبوب.
9. اختياري: إذا البروتين ليست حبات sepharose و بالإضافة إلى استخدامها مباشرة الجماعات الحكومية الدولية للتخزين، IP لمدة تصل إلى أسبوع واحد أمر ممكن. لهذا، الطرد المركزي لمدة 60 ثانية على ارتفاع 1،000 XG و 4 ° C لبيليه والخرز، وإزالة بعناية supernatant الخرز و resuspend في 5 مل العازلة الفوسفات 0،1 M (7.5 درجة الحموضة) التي تحتوي على أزيد الصوديوم 0.02٪ وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

2. تحلل الخلايا، وتحضير العينة يشابك

1. 2 المتلحفة تنمو الثقافات في المتوسط ​​تحتوي على 7،5 مم ¹⁴ NH ₄ الكلورين أو ¹⁵ NH ₄ الكلور كمصدر للنتروجين إلى كثافة ~ 5 × 10 ⁶ خلية / مل. الخلايا تحتاج إلى تمرير من خلال ما لا يقل عن عشرة أجيال لوضع العلامات الكاملة. هنا، كانت تزرع الخلايا photomixotrophically في المتوسط ^​​11 على TAP شاكر تدويرية عند 25 ° C تحت أشعة الضوء الأبيض المستمر مع (30 م ^-2 μE ق ^-1).
2. نقل اثنين مأخوذة كل من ¹⁴ و ¹⁵ N-N-صفت الخلايا إلى أنابيب GSA الأربعة والخلايا بواسطة الطرد المركزي الحصاد 4-XG دقيقة على 4،000 و 4 ° C (عدد الخلايا تحصد لكل قسامة يعتمد على تركيز الخلوية من الهدف البروتين وتحدد احتياجات هmpirically مقدما لضمان أن عجلت البروتين الهدف كافيا. A نقطة انطلاق جيدة هو 10 ⁹ خلايا في قسامة، أي 200 مل من ثقافة مع 5 ⁶ 10 X الخلايا / مل).
   ليشابك فقط: في الحالة سوف يتم crosslinked مجمعات البروتين قبل IP، والخلايا تحتاج إلى أن تغسل لإزالة الأمينات الموجودة في المتوسط. لهذا، وخلايا resuspend في 40 مل العازلة KH قبل تبريد (20 ملم HEPES-KOH (الرقم الهيدروجيني 7.2)، 80 ملي بوكل) ونقلها إلى أنابيب فالكون 50 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 60 ثانية على ارتفاع 1،000 XG و 4 ° C. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
3. الخلايا resuspend في 2 مل العازلة يزيس (20 ملم HEPES-KOH (الرقم الهيدروجيني 7.2)، 1 ملم MgCl _{2 و} 10 ملي بوكل، 154 ملي مول كلوريد الصوديوم) قبل تبريده إلى 4 ° C ونقلها إلى أنابيب فالكون 15-مل. جمع الخلايا المتبقية في أنابيب GSA مع إضافية 1 مل العازلة يزيس لكل منهما. إضافة 50 ميكرولتر البروتيني × 25 و 12.5 ميكرولتر المانع 1 M MgCl ₂ (لتركيز النهائي من 3.5 ملم) لكل قسامة.
4. إضافة 150ميكرولتر العازلة يزيس، 12.5 ميكرولتر 1 M ATP، 833 ميكرولتر الكرياتين فوسفات 270 ملم و 7 ميكرولتر 5 فسفوكيناز الكرياتين ميكروغرام / ميكرولتر (تركيز النهائي هو 2.5 ملم ATP، 45 ملي فوسفات الكرياتين، و 7 ميكروغرام / مل فسفوكيناز الكرياتين) إلى واحد من ومأخوذة يحتوي على ¹⁴ و ¹⁵ N-N-الخلايا المسماة (هذه هي مأخوذة + ATP).
5. إضافة 930 ميكرولتر العازلة يزيس و 70 ميكرولتر U 1 / ميكرولتر آبيراز إلى مأخوذة أخرى تحتوي على ¹⁴ N و ¹⁵ N-الخلايا المسماة (هذه هي مأخوذة-ATP).
6. احتضان لمدة 2 دقيقة عند 25 درجة مئوية على الأسطوانة لإنشاء أنبوب ATP-تستنفد والدول ATP-تزخر. إذا تم حذف خطوة يشابك، إضافة آخر مل 1 من يزيس العازلة.
   ليشابك فقط: في حال التحقيق البروتين البروتين التفاعلات عابرة فإنه من المستحسن للقبض عليهم من قبل خطوة يشابك. لهذا، إضافة 500 ميكرولتر 20 ملي ثنائي ثيو؛ ديثيو مكرر (succinimidyl بروبيونات) (DSP) الذائبة في DMSO (تركيز النهائي هو 2 مم) همنظمة العمل ضد الجوع أنبوب مباشرة قبل صوتنة.
7. يصوتن أربع مرات و 20 ثانية لكسر الجليد في الخلايا مع 20-ثوانى فواصل بين للتبريد. (نحن نستخدم Sonoplus Bandelin HD2070 مع طرف KE76 في السيطرة الناتج من 75٪ ودورة العمل من 60٪. الإعدادات اللازمة لآلات أخرى / الأجهزة / نصائح يجب أن يتم تحديد مسبقا لضمان كامل تحلل الخلايا وتجنب إراقة. )
   ليشابك فقط: تسمح المجمعات البروتين لعبور الارتباط من احتضان لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية على الأسطوانة الأنبوب. بعد يشابك، يكمل كل منهما مع 500 ميكرولتر أنبوب جليكاين M 1 واحتضان على الأسطوانة أنبوب لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية لإرواء crosslinker مجانا.
8. إعداد أربعة وسائد السكروز 6 مل (20 ملم HEPES-KOH (الرقم الهيدروجيني 7.2)، 0.6 M السكروز) في SW41 تي أنابيب رقيقة الجدار (بيكمان كولتر البند رقم: 344059)، ووضع بعناية كاملة ~ 5،5 مل من الخلية لست] وعلى السكروز الوسائد (التوازن مع العازلة يزيس) وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في XG 200،000 و 4 ° C في روتو تي SW41ص.
9. نقل الجزء العلوي من الانحدار التي تحتوي على مجمعات البروتين للذوبان إلى أربعة أنابيب فالكون 15-مل (تجنب نقل أجزاء من سادة السكروز)، إضافة 350 ميكرولتر تريتون X 10٪-100 إلى تركيز النهائي من 0.5٪ لكل منهما، ومزيج دقيق وإضافة إلى المخزن المؤقت يزيس إجمالي حجم 7 مل لكل منهما.
   (نقل 70 ميكرولتر من كل مستخلص الخلايا القابلة للذوبان لأنابيب جديدة المخروطية 1.5 مل (إيبندورف أنابيب) إضافة 70 ميكرولتر و2 × SDS-عينة العازلة (4٪ SDS، 125 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 6.8)، الجلسرين 20٪، 10 ٪ 2-المركابتويثانول) لكل لSDS-PAGE والتحليلات طخة مناعية.)
10. تجاهل وسائد السكروز و resuspend غشاء الكريات في 3 مل العازلة يزيس لكل منهما. إضافة إلى كل تريتون مل 1 10٪ X-100 إلى تركيز النهائي من 2٪، يصوتن على الجليد بحل الكريات، وإضافة إلى المخزن المؤقت يزيس إجمالي حجم 5 مل لكل منهما.
11. ~ وضع 5 مل من الأغشية solubilized من الخطوة 2،10 إعداد أربعة آخرين سائد السكروز 6 مل أنابيب تي في SW41 رقيقة الجدار، والسكروز بعناية علىالوسائد، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في XG 200،000 و 4 ° C في الدوار تي SW41.
12. نقل الجزء العلوي من الانحدار التي تحتوي على مجمعات البروتين غشاء إلى أربعة أنابيب فالكون 15-مل وإضافة العازلة يزيس (التي تحتوي على تريتون X 2٪-100) إلى وحدة تخزين النهائي من 7 مل لكل منهما. (70 ميكرولتر من نقل كل خلية تذوب استخراج الطازجة لل أنابيب إيبندورف إضافة 70 ميكرولتر و2 × SDS-عينة لكل لSDS-PAGE والتحليلات طخة مناعية.)

3. مناعي

1. بيليه على البروتين A الخرز التي تحتوي على أجسام مضادة جانب sepharose و (من الخطوات 1.8 أو 1.9) من قبل الطرد المركزي 60-XG ثانية في 1000 و 4 ° C، وإزالة بعناية طاف الخرز و resuspend في 4 مل العازلة يزيس. كرر هذه الخطوة مرتين لتتوازن الخرز في المخزن المؤقت يزيس.
2. ملء تصل إلى 8 مل مع العازلة يزيس ونقل 1 مل من تعليق إلى كل من أنابيب فالكون 15-8 مل تحتوي على مجمعات البروتين للذوبان أو غشاء من ATP وتزخر-ATP ^{تستنفد-14} 15 وصفت الخلايا (من الخطوة 2.9 و 2.12).
3. احتضان لمدة 2 ساعة في C ° 4 على الأسطوانة أنبوب لمجمعات البروتين راسب.
4. بيليه حبات من قبل الطرد المركزي 60-XG ثانية في 1000 و 4 ° C وتجاهل supernatants. ترك كمية صغيرة من السائل على الجزء العلوي من الخرز لتسهيل نقل.
5. نقل الخرز من كل أنبوب فالكون لأنابيب مخروطية 1.5 مل (إيبندورف أنابيب). لجمع كل الخرز المتبقية في أنابيب فالكون، إضافة آخر يزيس مل 0،8 0،1 العازلة التي تحتوي على تريتون٪ لكل، دوامة بلطف، الطرد المركزي لمدة 60 ثانية على ارتفاع 1،000 XG و 4 ° C ونقل المخزن المؤقت مع حبات المتبقية للأنابيب إيبندورف. تبادل أنبوب ضروري لمنع التلوث من البروتينات التمسك الجدران البلاستيكية.
6. بيليه حبات من قبل الطرد المركزي في 15 ثانية و 4 16100 XG ° C، وإزالة بعناية supernatants والخرز resuspend في 1،3 مل العازلة التي تحتوي على 0،1 يزيس تريتون٪. كرر هذه الخطوة مرتين مع BUF تحللFER تحتوي على تريتون ومرتين مع تريتون العازلة يزيس تفتقر إلى اغسل الخرز. ترك كمية صغيرة من السائل على الجزء العلوي من الخرز لتسهيل نقل.
7. نقل مرة أخرى إلى حبات طازجة أنابيب إيبندورف 1.5 مل لإزالة البروتينات التمسك الجدران البلاستيكية. غسل أنابيب قديمة مع 1 مل العازلة تفتقر يزيس تريتون ونقل جميع حبات المتبقية إلى أنابيب جديدة.
8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 16100 XG و 4 ° C، قم بإزالة supernatants الأولى مع ماصة طبيعية، ثم قم بإزالة أي طاف المتبقية تماما مع حقنة هاميلتون 50-ميكرولتر.

4. تحضير العينة لnano-LC-MS/MS

1. إضافة 100 ميكرولتر العازلة شطف الطازجة (8 M اليوريا، 25 مم NH ₄ HCO ₃₎ لكل أنبوب، استخدم ال 100 ميكرولتر العازلة شطف ليغسل الخرز التمسك حقنة هاميلتون واحتضان لمدة 10 دقيقة في thermomixer في 800 دورة في الدقيقة و 65 ° C، وآخر 20 دقيقة في 30 ° C. (A أكثر من ذلك بكثير كاملةويتحقق شطف من البروتينات ملزمة من قبل شطف مع هطول الأمطار واللاحقة SDS 2٪ مع الأسيتون 80٪.)
2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 16100 XG ° C. و 25 نقل إلى أنابيب supernatants جديدة مع حقنة هاميلتون 50-ميكرولتر.
3. إضافة 50 ميكرولتر العازلة للشطف الخرز، واستخدام شطف العازلة ال 50 ميكرولتر ليغسل الخرز التمسك حقنة هاميلتون وكرر الخطوات الحضانة والطرد المركزي 4.1 و 4.2، على التوالي. بركة eluates منها.
   (نقل 30 ميكرولتر من eluates لأنابيب إيبندورف الطازجة، إضافة 30 ميكرولتر 2 × SDS-عينة العازلة لكل لSDS-PAGE والتحليلات طخة مناعية.)
4. الجمع بين مزال رواسب من + /-ATP المعاملة، و ¹⁴ و ¹⁵ N-N-المسمى البروتينات القابلة للذوبان وغشاء على النحو التالي:
   120 ميكرولتر ¹⁵ N / ميكرولتر ATP و 120 + ¹⁴ N / ATP-
   120 ميكرولتر ¹⁴ N / + ATP و 120 ميكرولتر ¹⁵ N / ATP-
   120 ميكرولتر ¹⁵ N / ميكرولتر ATP و 120 + ¹⁴ N / ATP-<ر /> 120 ميكرولتر ¹⁴ N / + ATP و 120 ميكرولتر ¹⁵ N / ATP-
5. اضافة 1.5 ميكرولتر الطازجة 1 M DTT إلى تركيز النهائي من 6.5 مم إلى كل من اربع مجموعات للحد من السندات ثاني كبريتيد (بما في ذلك تلك الموجودة في crosslinker) واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 25 ° C.
6. إضافة ميكرولتر 10،5 الطازجة 0،6 M iodoacetamide إلى تركيز النهائي من 25 ملم إلى carboxymethylate على انخفاض ثيول واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 25 درجة مئوية في الظلام.
7. إضافة ميكرولتر 256 40 مم NH ₄ HCO ₃ و 4 ميكرولتر اليس C-(0.1 ميكروغرام / ميكرولتر)، وأنابيب الختم مع parafilm، واحتضان ما لا يقل عن 16 ساعة بين عشية وضحاها على عجلة دوران في 37 ° C.
8. إضافة ميكرولتر 20 ملي 470 NH ₄ HCO _{3 و} 10 ميكرولتر الأسيتونيتريل 100٪ (لتركيز النهائي من 1٪) و 8 حبات التربسين ميكرولتر، واحتضان على عجلة دوران لا يقل عن 16 ساعة في 37 ° C.
9. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 16100 XG و 4 ° C، ونقل supernatants جديدة حوض 2-إيبندورف ملوفاق. غسل أنابيب قديمة مع 50 ميكرولتر 20 مم ₄ HCO NH _3، حمض الخليك 0.5٪، وحمام سباحة بفندق في supernatants الأولى.
10. لتحلية، وإعداد محلية الصنع C _18-StageTips عن طريق الاستغناء عن قرصين من مادة Empore ₁₈ C بإبرة حقنة ووضعها في تلميح ماصة 200-ميكرولتر. وبهذه الطريقة إعداد أربعة ميكرولتر 200-نصائح. لكمة ثقوب في الأغطية من أربعة أنابيب إيبندورف 2-مل ونصائح إدراج.
11. الشرط المسبق للC _18-50 B StageTips مع الحل ميكرولتر (80٪ الأسيتونيتريل، وحامض الخليك 0.5٪). أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 800 غ و 25 ° C.
12. وتتوازن C _18-StageTips مع 100 ميكرولتر الحل A (حمض الخليك 0.5٪، الأسيتونيتريل 2٪). أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 800 غ و 25 ° C. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
13. تحميل 100 ميكرولتر من supernatants من الهضم تريبسيني (4.9) على StageTips _C-18 وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 800 غ و 25 ° C. كرر هذه الخطوة حتى تم تطبيق كامل لsupernatantsالأعمدة.
14. غسل C _18-StageTips مع 100 ميكرولتر حل جهاز طرد مركزي لمدة 3 دقائق A. في 800 غ و 25 ° C. كرر هذه الخطوة مرتين.
15. أزل الببتيدات تريبسيني في أنبوب إيبندورف الطازجة 1.5 مل مع 50 ميكرولتر الحل B. جهاز طرد مركزي لمدة 3 دقائق في 800 غ و 25 ° C. كرر هذه الخطوة مرة واحدة. الببتيدات الجافة على الانتهاء في سرعة بطالة.
16. اختياري: ختم أنابيب إيبندورف مع parafilm وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
17. إعادة تعليق على الببتيدات المجفف مع 20 ميكرولتر A ​​الحل واحتضان ما لا يقل عن 1 ساعة على الجليد، تقطعها حضانات دقيقة 15-اثنين في حمام sonicator. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في XG 16100 و 4 ° C، وتطبيق لطاف nano-LC-MS/MS.

5. ممثل النتائج

كما هو مبين exemplarily لمقتطفات الخلية ^N-14 المسمى في الشكل 2A، وعلى وجه الحصر تقريبا مترجمة HSP70B وCGE1 إلى جزء القابل للذوبان، مستقلة عن الدولة ATP. فييتم ترجمة النقيض من ذلك، CF1β لكسور قابلة للذوبان والغشاء اليورانيوم، والمقصات صوتنة جزءا منها من غشاء تقع _س CF، ويخدم بالتالي السيطرة والتحميل لكل من الكسور. وكما هو مبين في الشكل 2B، عجلت كميات مماثلة من HSP70B مع الأجسام المضادة المقاومة للHSP70B من ¹⁴ N-N-و ¹⁵ وصفت مقتطفات القابلة للذوبان، مستقلة عن الدولة ATP. في المقابل، كان عجلت HSP70B إلا القليل من الكسور الغشاء مع كميات أكبر قليلا من الكسور الناشئة غشاء ATP-المنضب مقارنة الكسور ATP تزخر، وبالتالي مؤيدة النتائج السابقة ^9. وقد لا يشارك في CGE1 عجل مع HSP70B في ATP-تزخر كسور قابلة للذوبان أو الغشاء، بينما كميات كبيرة من CGE1 شارك في عجلت من الكسور مع HSP70B ATP-المنضب القابل للذوبان، والقليل من الكسور غشاء ATP-المنضب.

ويلاحظ أيضا تفاعل مع CGE1 HSP70B فقط في الدولة في ADPMS تحليل: في الشكل 3، الممثل MS1 أطياف HSP70B وCGE1 الببتيدات من رواسب ولدت مع مصل ضدي HSP70B من مقتطفات الخلية القابلة للذوبان وترد. في التجربة هو مبين في الشكل 3A، كانت رواسب من خليط من عصائر ^N-14 المسمى تفتقر ATP و ¹⁵ N-صفت مقتطفات تحتوي على ATP. في حين تم الكشف عن النموذج المسمى الثقيلة والخفيفة من الببتيد في HSP70B شدة متساوية، تم العثور فقط على شكل ضوء المسمى من الببتيد CGE1 (ATP-مقتطفات من). في الشكل 3B يتم عرض الببتيدات من نفس الراسب مكافحة HSP70B المستمدة من خليط من الخلايا المسمى بالتبادل مقتطفات القابلة للذوبان. وفقا لذلك، وهذه المرة فقط تم الكشف عن النموذج المسمى الثقيلة من الببتيد CGE1 (ATP-مقتطفات من)، في حين كان هذا مرة أخرى هو الحال بالنسبة لضوء، والثقيلة على حد سواء الببتيدات HSP70B المسمى.

الشكل 1. وصفت عملية الأيض التجريبية سير العمل. خلايا مع ¹⁴ N وN ¹⁵ لا يقل عن 10 أجيال، وتحصد المتوفرة مع أو تقلص من ATP. بعد المجمعات الخلية البروتين قد يكون اختياريا تحلل crosslinked (X الارتباط) مع DSP. ثم يتم فصل الخلايا lysed في ذوبان (سول) والغشاء الكسور التخصيب (PEL). البروتينات المستهدفة (هنا HSP70B) وبروتين التحكم (هنا CF1β) وimmunoprecipitated مع الأجسام المضادة لبروتين معين بالإضافة A الخرز sepharose و (السوداء). بعد الغسيل، وعجلت مزال البروتينات وتحليلها إما مباشرة من قبل immunoblotting، أو كل ¹⁴ N-N-و ¹⁵ وصفت الكسور في ATP + و-ATP. يتم تجميع الدول، هضمها وتحليلها بواسطة nano-LC-MS/MS في حالة المثال المعروض هنا وفي الوقت نفسه تقلصت الكسر ¹⁵ N-صفت من ATP. وفقا لذلك، فإن نسبة شدة الثقيلة (الألوان الداكنة) المسمى الضوء المسمى (ألوان الضوء) الببتيد من البروتين السيطرة(CF1β)، والبروتين المستهدف (HSP70B) وغير على وجه التحديد، ينبغي أن تكون متجهة نحو الملوثات واحد، في حين من المتوقع أن تكون هذه النسبة عالية جدا للبروتينات التفاعل مع البروتين على وجه التحديد الهدف (CGE1). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 2. تم استخراج تحليل للمدخلات للمناعي HSP70B. البروتين للذوبان من إجمالي (سول) والغشاء التخصيب (PEL) الكسور المنضب سواء من ATP (-ATP) أو تستكمل مع ATP وتجديد نظام ATP (+ ATP). تم فصل 0.01٪ من البروتين مقتطفات على هلام SDS-بولكرلميد 10٪، وجرى تحليل مستويات البروتين HSP70B وCGE1 نسبة إلى CF1β التحكم التحميل من immunoblotting. B تحليل immunoprecipitates. وimmunoprecipitated HSP70B من ¹⁴ وN-¹⁵ N-صفت القابلة للذوبان وغشاء الخلية التخصيب تتضمن مقتطفات أو تفتقر إلى ATP. تم فصل البروتينات المناظرة إلى 3.3٪ من immunoprecipitates على هلام SDS-بولكرلميد 10٪ ومستويات HSP70B والنسبية CGE1 لتحميل تم تحليل CF1β سيطرة immunoblotting. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 3. immunoprecipitates أجريت أطياف الشامل ممثل HSP70B وCGE1 الببتيدات المضادة من HSP70B على الكسور المختلطة القابلة للذوبان ⁽¹⁴ N-ATP / ¹⁵ N + ATP). كامل أطياف MS ¹⁴ N ¹⁵ N الببتيدات وصفت، المقابلة لATP و+ وتظهر ATP الدول، على التوالي، من HSP70B وCGE1 شارك في immunoprecipitated. يتوجب دفع ثلاثة أسباب كل الببتيد، الببتيد يحتوي على ذرات النتروجين HSP70B 22، pept CGE1IDE 19، الموافق تحول كتلة 7،33 6،33 وم / ض، على التوالي. الشامل الممثل B أطياف من التجربة المتبادلة ⁽¹⁴ N + ATP / ¹⁵ N-ATP). وتظهر كامل أطياف MS N ¹⁴ نفس والببتيدات ¹⁵ N المسمى الموافق هنا إلى ATP + و-ATP الدول، على التوالي، من HSP70B وCGE1 شارك في immunoprecipitated. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

Discussion

لقد قدمنا ​​مؤخرا اثنين من التحسينات على نهج QUICK: خطوة يشابك لالتقاط عابرة البروتين البروتين التفاعلات (QUICK-X)، وهطول الأمطار السيطرة على تطبيع لهطول الأمطار الكفاءة غير المتساوية ^6. هنا نقدم بروتوكول تحتوي على اثنين من مزيد من التحسينات QUICK: أولا، نستبدل SILAC ^{5 ل15} N وضع العلامات الأيضية. المزايا هي أن ¹⁵ N وضع العلامات الأيضية أرخص بكثير من SILAC، إذا تم تقديم ¹⁵ N وملح غير عضوي بسيط. وعلاوة على ذلك، يمكن مع ¹⁵ N التمثيل الغذائي يمكن تطبيق وضع العلامات السريع لبدئية لجميع الكائنات الحية الأحماض الأمينية، مثل الفطريات والبكتيريا ومعظم النباتات. وأخيرا، أرجينين إلى البرولين interconversion الأصيل في SILAC ^5،6 لا يشكل مشكلة بالنسبة الكمي من ¹⁵ N المسمى الببتيدات. أمثلة لأدوات مناسبة لتقييم كمية البيانات البروتيوميات من ¹⁵ هي ¹² N MSQUANT أو IOMIQS ^13.

الثانية، ونحن نقدم تقارب التشكيل كوسيلة للحد من وجه التحديد كمية البروتينات التي تتفاعل مع بروتين هدف معين في عينة واحدة مقابل أخرى. مزايا هذا النهج هي أن تلتف بناء المسوخ ضربة قاضية، لبعض الأنظمة التي يصعب نموذج لتوليد أو لا يمكن إنشاؤها على الإطلاق في حالة البروتينات المستهدفة الأساسية. وعلاوة على ذلك، فإنه يتجنب تفسيرات خاطئة بسبب التعبير البروتين الفرق التي تحدث كرد فعل يحتمل من الخلية إلى يطرق إلى أسفل بروتين الهدف: إذا البروتينات الأخرى أسفل التنظيم وكذلك ومع مصل ضدي تستخدم لعبور مناعي رد فعل من شأنه أن يكون تفسيرها كشركاء التفاعل الحقيقي للبروتين الهدف. في الماضي، تقارب تعديل يلغي الحاجة لإيجاد الأجسام المضادة المناسبة إلى نسبة المستضد.

على الرغم من أننا لدينا لتطبيق بروتوكول reinhardtii المتلحفة والنموذج الحي، فإنه يمكن بسهولة أن تتكيف مع أي كائن الأخرى التي يمكن زراعتها في المزارع الخلوية وقادرة على استخدام نترات الأمونيوم أو كمصدر للنتروجين. قد تقارب مباشرة التشكيل مجمعات البروتين بواسطة ATP / ADP تطبيقها على المحرمين الأخرى التي تفاعل مع ركائز والبروتينات الفوج يعتمد على حالة ATP، مثل أنظمة كوصي أو GroEL/HSP60/Cpn60 HSP90 ^14،15، أو من أين أي نظام آخر الانتماءات الملزمة هي عن طريق التضمين ATP. وينبغي أيضا العمل تقارب التشكيل في الحالات التي يتم تغيير الانتماءات بين التفاعلات البروتين بواسطة أدوية محددة، مثل radicicol أو geldanamycin في حالة HSP90 نظم ^15.

وجود قيود واضحة لدينا من البروتوكول هو أنه يتطلب تقارب-تنقية أجسام مضادة ضد بروتين الهدف من المعروف أن الحساسة إلى علاج محدد / المخدرات التي ينظم تفضيله للبروتينات الشريكة. ولذلك، فليس من طريقة عالية الإنتاجية.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	التعليقات (اختياري)
ProteinA sepharose و	سيغما الدريخ	P3391
DMP (ثنائي ميثيل pimelimidate)	سيغما الدريخ	D8388	تخزين المجفف في -20 درجة مئوية، ويحل مباشرة قبل استخدام
البروتيني المثبط (كاملة، EDTA خالية)	روش العلوم التطبيقية	11873580001
ATP (Adenosin-5'-triphosphat)	كارل روث	K054
الكرياتين فوسفات	سيغما الدريخ	27920
الكرياتين فسفوكيناز	سيغما الدريخ	C7886	؛
DSP Dithiobis [succinimidyl بروبيونات]	Sientific الحرارية	22585	تخزين المجفف في 4 درجات مئوية
15 NH 4 الكلورين	كامبريدج النظائر المختبرات وأندوفر، MA	NLM-467
LYS-C (Endoproteinase LYS-C)	روش العلوم التطبيقية	11047825001
الخرز التربسين (Poroszyme مشلول التربسين)	النظم البيولوجية التطبيقية	2-3127-00	مزيج بقوة مباشرة قبل استخدام
Empore القرص C 18 47 ملم	فاريان	12145004