$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم استخدام طرق تغليف الموائع الدقيقة سابقا لالتقاط الخلايا في قطرات مائية أحادية التشتت على نطاق بيكوليتر ، مما يوفر حبسا من بيئة سائلة سائبة مع تطبيقات في فحص الإنتاجية العالية ، وقياس الخلايا ، وقياس الطيف الكتلي. نصف طريقة ليس فقط لتغليف الخلايا المفردة ، ولكن لالتقاط عدد محدد من الخلايا بشكل متكرر (نوضح هنا تغليف خلية واحدة واثنتين) لدراسة كل من العزل والتفاعلات بين الخلايا في مجموعات ذات أحجام خاضعة للرقابة. من خلال الجمع بين تقنيات توليد القطرات وترتيب الخلايا والجسيمات ، نعرض التغليف المتحكم فيه للجزيئات بحجم الخلية من أجل تغليف فعال ومستمر. باستخدام تعليق الجسيمات المائية وزيت الفلوروكربون غير القابل للامتزاج ، نقوم بتوليد قطرات مائية في الزيت باستخدام فوهة تركيز التدفق. معدل التدفق المائي مرتفع بما يكفي لإنشاء ترتيب للجسيمات التي تصل إلى الفوهة بترددات متعددة صحيحة لتردد توليد القطرة ، مما يؤدي إلى تغليف عدد متحكم فيه من الخلايا في كل قطرة. للحصول على نتائج تمثيلية ، يتم استخدام جزيئات البوليسترين 9.9 ميكرومتر كبدائل للخلايا. تظهر هذه الدراسة كفاءة تغليف جسيم واحد Pk = 1 من 83.7٪ وكفاءة تغليف الجسيمات المزدوجة Pk = 2 من 79.5٪ مقارنة بكفاءات بواسون الخاصة بكل منهما بنسبة 39.3٪ و 33.3٪ على التوالي. ثبت أن تأثير التركيز المتسق للخلايا والجسيمات له أهمية كبيرة للتغليف الفعال ، كما يتم تناول التنقيط إلى انتقالات النفث.
مقدمة
تشترك معلقات الخلايا المائية المستمرة في بيئة سائلة مشتركة تسمح للخلايا بالتفاعل بالتوازي وتجانس أيضا تأثيرات خلايا معينة في القياسات من الوسائط. يؤدي تغليف الخلايا عالي الإنتاجية في قطرات مقياس بيكوليتر إلى تقييد العينات لحماية القطرات من التلوث المتبادل ، وتمكين قياس التنوع الخلوي داخل العينات ، ومنع تخفيف الكواشف والمؤشرات الحيوية المعبر عنها ، وتضخيم الإشارات من منتجات المفاعلات الحيوية. توفر القطرات أيضا القدرة على إعادة دمج القطرات في عينات مائية أكبر أو مع قطرات أخرى لدراسات الإشارات بين الخلايا. 1،2 ينطوي الانخفاض في التخفيف على إشارات كشف أقوى لقياسات عالية الدقة بالإضافة إلى القدرة على تقليل أحجام العينات والكواشف التي يحتمل أن تكون مكلفة. 3 تم استخدام تغليف الخلايا في قطرات لتحسين الكشف عن تعبير البروتين ، 4 أجسام مضادة ، 5،6 إنزيمات ، 7 ونشاط التمثيل الغذائي8 لفحص الإنتاجية العالية ، ويمكن استخدامها لتحسين قياس الإنتاجية العالية. 9 تقدم دراسات إضافية تطبيقات في الرش الكهربائي الحيوي للخلايا المحتوية على قطرات لقياس الطيف الكتلي10 وطلاء الخلايا السطحية المستهدفة. 11 ومع ذلك ، فقد كانت بعض التطبيقات محدودة بسبب عدم القدرة على التحكم في عدد الخلايا المغلفة في قطرات. نقدم هنا طريقة للتغليفالمرتبة 12 والتي تزيد من كفاءات التغليف المثبتة لخلية واحدة وخلية واحدة ويمكن استقراءها لتغليف عدد أكبر من الخلايا.
لتحقيق توليد قطرة أحادية التشتت ، يتيح "تركيز التدفق" الموائع الدقيقة إنشاء قطرات بحجم يمكن التحكم فيها لسائل واحد (خليط خلية مائية) داخل سائل آخر (طور زيت مستمر) باستخدام فوهة تتلاقى عندها التيارات. 13 بالنسبة لهندسة فوهة معينة ، يمكن تغيير تردد توليد السقوط f وحجم القطرة عن طريق ضبط معدلات التدفق المائي للزيت Q و Qaq. مع زيادة معدلات التدفق ، قد تنتقل التدفقات من توليد القطرات إلى النفث غير المستقر للسائل المائي من الفوهة. 14
< p class = "jove_content">عندما يحتوي المحلول المائي على جزيئات معلقة ، تصبح الجسيمات مغلفة ومعزولة عن بعضها البعض عند الفوهة. لتوليد القطرات باستخدام تعليق الخلايا المائية الموزع عشوائيا ، يتم إملاء متوسط جزء القطرات Dk التي تحتوي على k خلايا بواسطة إحصائيات بواسون ، حيث Dk = λk exp (-λ) / (k!) و λ هو متوسط عدد الخلايا لكل قطرة. يتم حساب جزء الخلايا التي ينتهي بها المطاف في القطرات المغلفة "بشكل صحيح" باستخدام Pk = (k x Dk) / Σ (k' x Dk'). يتمثل الاختلاف الدقيق بين المقياسين في أن Dk يتعلق باستخدام السائل المائي وكمية فرز القطرات التي يجب إكمالها بعد التغليف ، ويتعلق Pk باستخدام عينة الخلية. على سبيل المثال ، يمكن للمرء استخدام معلق الخلية المخفف (منخفض λ) لتغليف القطرات حيث تحتوي معظم القطرات التي تحتوي على خلايا على خلية واحدة فقط. في حين أن مقياس الكفاءة Pk سيكون مرتفعا ، فإن غالبية القطرات ستكون فارغة (Dk منخفضة) ، مما يتطلب آلية فرز لإزالة القطرات الفارغة ، مما يقلل أيضا من الإنتاجية. 15
يوفر الجمع بين توليد الإسقاط والترتيب بالجمود القدرة على تغليف القطرات بأعداد أكثر قابلية للتنبؤ بها من الخلايا لكل قطرة وإنتاجية أعلى من التغليف العشوائي. تم اكتشاف التركيز بالقصور الذاتي لأول مرة بواسطة Segre و Silberberg16 ويشير إلى ميل الجسيمات ذات الحجم المحدود إلى الهجرة إلى مواضع التوازن الجانبي في تدفق القناة. يشير الترتيب بالقصور الذاتي إلى ميل الجسيمات والخلايا إلى التنظيم السلبي في قطارات متباعدة ومتداخلة وثابتة السرعة. يتطلب كل من التركيز والترتيب معدلات تدفق عالية بما فيه الكفاية (رقم رينولدز مرتفع) وأحجام الجسيمات (رقم رينولدز الجسيمات العالي). 17،18 هنا ، رقم رينولدز Re = uDh / ν ورقم رينولدز الجسيم Rep = Re (a / Dh) 2 ، حيث u هي سرعة تدفق مميزة ، Dh [= 2wh / (w + h)] هو القطر الهيدروليكي ، ν هو اللزوجة الحركية ، a هو قطر الجسيمات ، w هو عرض القناة ، و h هو ارتفاع القناة. من الناحية التجريبية ، يتناقص الطول المطلوب لتحقيق القطارات المرتبة بالكامل مع زيادة Re و Rep. لاحظ أن متطلبات Re و Rep العالية (لهذه الدراسة في حدود 5 و 0.5 ، على التوالي) قد تتعارض مع الحاجة إلى الحفاظ على معدلات التدفق المائي منخفضة لتجنب النفث في فوهة توليد السقوط. بالإضافة إلى ذلك ، تؤدي معدلات التدفق العالية إلى ضغوط قص أعلى على الخلايا ، والتي لم يتم تناولها في هذا البروتوكول. أظهرت دراسة التغليف السابقة المرتبة أن أكثر من 90٪ من خلايا HL60 المغلفة منفردة في ظل ظروف تدفق مماثلة لتلك الموجودة في هذه الدراسة حافظت على سلامة غشاء الخلية. 12 ومع ذلك ، يجب النظر بعناية في تأثير الحجم والمقاييس الزمنية لضغوط القص عند الاستقراء لأنواع الخلايا المختلفة ومعلمات التدفق. يوفر تداخل ترتيب الخلايا ، وتوليد القطرات ، وقيود معدل التدفق المائي لبقاء الخلية نظاما تشغيليا مثاليا للتغليف المتحكم فيه للخلايا المفردة والمتعددة.
< p class = "jove_content">نظرا لأن عددا قليلا جدا من الدراسات تتناول تباعد القطارات بين الجسيمات ، فإن تحديد التباعد يتم بسهولة تجريبية وسيعتمد على هندسة القناة ومعدل التدفق وحجم الجسيمات وتركيز الجسيمات. ومع ذلك ، فإن التباعد الجانبي المتساوي بين القطارات يعني أن الخلايا تصل إلى فترات زمنية متسقة يمكن التنبؤ بها. عندما يحدث توليد القطرة بنفس المعدل الذي تصل به الخلايا المرتبة إلى الفوهة ، تصبح الخلايا مغلفة داخل القطرة بطريقة خاضعة للرقابة. تم استخدام هذه التقنية لتغليف الخلايا المفردة بإنتاجية في حدود 15 كيلو هرتز،12 وهو تحسن كبير مقارنة بالدراسات السابقة التي أبلغت عن معدلات التغليف في حدود 60-160 هرتز.4،15 في أعمال التغليف الخاضع للرصد، احتوت أكثر من 80٪ من القطرات على خلية واحدة واحدة فقط، وهو تحسن كبير في الكفاءة مقارنة بإحصاءات بواسون (العشوائية). الذي يتنبأ بكفاءة أقل من 40٪ في المتوسط. 12
في أعمال التغليف الخاضعة للرقابة السابقة ، 12 تم ضبط متوسط عدد الجسيمات لكل قطرة λ لتوفير تغليف أحادي الخلية. نفترض أنه من خلال ضبط معدلات التدفق ، يمكننا تغليف أي عدد من الخلايا بكفاءة لكل قطرة عندما تكون λ مساوية أو قريبة من عدد الخلايا المطلوبة لكل قطرة. في حين أن تغليف الخلية المفردة ذو قيمة في تحديد استجابات الخلية الفردية من المحفزات ، فإن التغليف متعدد الخلايا يوفر معلومات تتعلق بتفاعل الأعداد وأنواع الخلايا الخاضعة للرقابة. نقدم هنا بروتوكولا ونتائج تمثيلية باستخدام كريات البوليسترين المجهرية ، ومناقشة للتغليف المتحكم فيه لخلايا متعددة باستخدام قناة ترتيب بالقصور الذاتي السلبية وفوهة توليد الإسقاط.