يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تصنيع وتطبيق روز البنغال، الشيتوزان أفلام في إصلاح الأنسجة ليزر

11.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/4158

⸱

أكتوبر 23, 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bioelectronics and Neuroscience (BENS) research group, University of Western Sydney, NSW Australia, 2Australian School of Advanced Medicine, Macquarie University, NSW Australia, 3School of Medicine, University of Siena, Italy

في هذه المقالة

ملخص

وهناك حاجة عادة لإصلاح الأنسجة الغرز أثناء العمليات الجراحية. ومع ذلك، يمكن أن يكون مشكلة تطبيقها كما هي الغازية، وربما تلف الأنسجة. وذكرت وسائل تلفيق هنا وتطبيق لاصقة الأنسجة الرواية. هذا الفيلم لاصقة والليزر وتنشيط لا تتطلب استخدام الخيوط الجراحية.

الملخص

الضوئية الرابطة الأنسجة (PTB) هي تقنية الغرز لإصلاح الأنسجة، والذي يتحقق من خلال تطبيق حل البنغال روز (RB) بين اثنين من حواف النسيج 1،2. والمشع ثم هذه بواسطة الليزر الذي يتم امتصاصه بشكل انتقائي من قبل RB. ردود الفعل الناتجة الضوئية تشعبي من المفترض أن ألياف الكولاجين في النسيج مع الحد الأدنى من الإنتاج التمهيدية 3. في هذا التقرير، وقد أدرج في أفلام RB الشيتوزان رقيقة لاصقة لصنع أنسجة الرواية التي هي الليزر تفعيلها. هي ملفقة الأفلام لاصقة، على أساس الشيتوزان وتحتوي على 0،1٪ بالوزن ~ RB، والمستعبدين من الأمعاء العجل والأعصاب الظنبوب الفئران بواسطة الليزر في الحالة الصلبة (λ = 532 نانومتر، فلوينس ~ 110 J / سم 2، حجم البقعة ~ 0.5 سم) . ويستخدم مقياس التوتر السطحي عمود واحد، وتفاعل مع أجهزة الكمبيوتر الشخصية، لاختبار قوة الترابط. وRB-الشيتوزان السندات لاصقة بقوة إلى الأمعاء مع قوة من 15 ± 6 كيلو باسكال، (ن = 30). قوة التصاق تنخفض إلى 2 ±، 2 كيلو باسكال (ن = 30) عندما لا يتم تطبيق الليزر للاصقة. ويمكن للمفاغرة الأعصاب الظنبوب الانتهاء أيضا من دون استخدام الخيوط الجراحية. وقد ملفقة A الشيتوزان رواية لاصقة أن السندات الضوئية إلى الأنسجة والخيوط الجراحية لا يتطلب.

البروتوكول

1. الشيتوزان لاصق إعداد

  1. مسحوق قابل للذوبان في الشيتوزان حل حامض الخليك، وبالنسبة للإعداد محلول المخزون من حمض الخليك (2٪ V / V)، إضافة 10 مل حامض الخليك الجليدية إلى المياه مل 490 منزوع الأيونات (DI-H 2 O).
  2. لإعداد محلول المخزون البنغال روز (RB) (0.01٪ W / V) في حامض الخليك، وتزن 5 ملغ من RB في قارورة ملفوفة بورق الألمنيوم لتجنب photobleaching. إضافة 0.5 مل من O 2 DI-H بحل مسحوق ثم إضافة 49،5 مل من حمض الحل الأسهم الخليك (موضح في القسم 1.1).
  3. لإعداد حل الشيتوزان (1.7٪ ث / ت)، تزن 0،85 غرام من مسحوق الشيتوزان (MW المتوسطة، ودرجة 85٪ من أستلة) وإضافة إلى 50 مل من محلول حامض الخليك RB. تم إعداد التحكم عن طريق إذابة الشيتوزان في حل حامض الخليك دون RB.
  4. النمام المغناطيسي إضافة إلى خليط الشيتوزان ويقلب في درجة حرارة الغرفة. لضمان حل كامل للمكونات، تحريك الشيتوزانفي حامض الخليك + RB لمدة أسبوعين والشيتوزان في حامض الخليك لمدة 5 أيام (التحكم). عندما يذوب الشيتوزان، ودرجة الحموضة حل يزيد من ~ ~ 2.6 إلى 3.9. لاحظ أن RB قابل للذوبان ضعيفة في الرقم الهيدروجيني الحمضية ويتطلب زيادة في الرقم الهيدروجيني من الحل وتمديد الوقت التحريك إلى حل.
  5. أجهزة الطرد المركزي في الحلول 3270 x ج لمدة 1 ساعة وجمع طاف به، على سبيل المثال، حقنة معقمة 10 مل. تأكد من عدم تعكير صفو بيليه النجاسة. خلال هذه الخطوة، يتم تنظيف حل من الشوائب والمواد غير القابلة للذوبان العيانية.
  6. حقن الحل الشيتوزان (بالطرد المركزي) على لوح مسطح perpex باستخدام محقنة معقمة. سمك الفيلم المجففة يعتمد على النسبة بين كمية من الاستغناء الحل ومساحة السطح الذي ينتشر على الحل. تأكد من أن الحل هو خال من فقاعات الهواء وتنتشر بالتساوي على بلاطة. للحصول على أفلام رقيقة بسمك ~ ميكرومتر 13، حقن ~ الحل 1 مل أكثر من 12 السطح 2 سممنطقة (أبعاد الطول ~ 3X4، الشكل 1A).
  7. بلاطة تغطية البرسبيكس مع شاشة مصنوعة من رقائق الألومنيوم على سبيل المثال، لتجنب photobleaching من الحل. ضمان أن يتم ضمان ما يكفي من التهوية لتجف الحل تحت الشاشة.
  8. ترك الحل لتجف في درجة حرارة الغرفة (25 ° C) والضغط (1 ATM) حتى الفيلم الناتج غير قابل للذوبان في الماء وتنتفخ لا macroscopically. ويتحقق هذا عادة في 2 أسابيع.
  9. فصل الأفلام بعناية باستخدام ملعقة رقيقة ومسطحة: يمكن هذه الأفلام مقشر بسهولة قبالة لوح البرسبيكس دون تعرضها للتلف.
  10. قياس سمك الأفلام باستخدام ميكرومتر.
  11. قطع لاصقة في شرائط مستطيلة مع مقص حاد نظيفة ووضعها بين الشرائح زجاجية معقمة للحفاظ على شكلها مسطح. التفاف الشرائح في رقائق الألومنيوم التدريع للضوء وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. تسمية لاصقة مع أو بدون RB باسم "ارتفع لاصقة" أو "adhes الشيتوزانإيف "على التوالي.
  12. ارتفع يمكن تعقيم باستخدام الايثانول الأفلام لاصقة (90٪)، أو مع أشعة جاما (0.1 كيلو جراى / ساعة لمدة 24 ساعة) 4،5.

2. التوهين البصرية اللاصقة

  1. إصلاح لاصقة روز داخل كوفيت الكوارتز.
  2. تسجيل الطيف الموهن في نطاق 400 - 800 نانومتر باستخدام الطيف ثنائي الحزمة 4.
  3. على افتراض صحة قانون بير، حساب طول توهين لاصقة على النحو التالي: I = I 0 البريد الفأس حيث كنت 0 هو كثافة شعاع الحادث، 1 / A هو طول توهين، وx هو سمك الفيلم.
  4. كرر الخطوات 2،1 حتي 2،3 لاصقة الشيتوزان لتكون بمثابة السيطرة.

3 في المختبر التطبيق:. الأنسجة الرابطة ليزر على الأمعاء

  1. الحصاد الأمعاء العجل مباشرة بعد القتل الرحيم الحيوانية وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  2. قبل الاستخدام، وتذويب هيدرات منظمة الشفافية الدوليةssue بغمر في O 2 DI-H لمدة 10 دقيقة.
  3. تقسم إلى أقسام الأنسجة (2 × 1 سم) باستخدام شفرة رقم 10 تحت مجهر التشغيل (X10). الحفاظ على أقسام رطبة باستخدام DI-H 2 O.
  4. جعل شق جذوعها قريبة من بعضها البعض (النهاية إلى النهاية). مسح الماء الزائد من على السطح باستخدام نصائح القطن.
  5. وضع لاصق قطاع روز (10 × 6 مم) عبر شق في طبقة المصلية مع microforceps ضمان الاتصال الكاملة مع الأمعاء (الشكل 2).
  6. يتم تنشيط التصاق الأنسجة من قبل لاصقة روز الصمام الثنائي ضخ الليزر في الحالة الصلبة، وهو مضافا إلى الألياف البصرية والمتعدد (الأساسية قطر 200 ميكرومتر) 4.
  7. تعيين مستوى قوة الليزر إلى 180 ميغاواط وأشرق لاصقة لحد أدنى 6 ~ مع شعاع حجم البقعة من 5 مم ~، وذلك باستخدام المعلمات المدرجة في الجدول 1. بقعة أشرق لاصقة ضمان المشع كل بقعة لمدة 5 ثوان قبل أن ينتقل ~ شعاع الى مكان الحادث المجاورة. Tالإجراء يضمن له شعاع الليزر بمسح كامل مساحة عدة مرات لاصقة.
  8. لتقييم قوة الترابط الأنسجة، المشبك عينة إلى مقياس التوتر السطحي عمود واحد معايرة (INSTRON، MA، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام قبضة الميكانيكية. نقل السيطرة على 22 مم / دقيقة حتى جذوعها الأنسجة منفصلين 4.
  9. وضع لاصق روز على النسيج كما هو موضح في الخطوة 3.5. لا أشرق العينة وقياس قوة الترابط الأنسجة كما هو موضح في الخطوة 3.8. هذه العينة بمثابة السيطرة.

4 في فيفو التطبيق:. التحام العصب قصبي

  1. رزين ويستار الفئران مع خليط 2 isoflurane / O (4٪ خلال التعريفي، بعد ذلك 2٪) 5. حقن تحت الجلد Buprenex (0.03 ملغم / كغم) لتوفير المنطوق النشاط داخل مسكن وتخفيف الألم أو عدم الراحة الممكنة.
  2. يجب أن يتم تنفيذ الإجراء التالي الجراحية تحت المجهر التشغيل (X10). جعل الجلد المائلشق حوالي 3 سم طويلة في الجزء الجانبي من ظهراني الفخذ الأيمن وفضح العصب الظنبوبي مع نهج العضلات من خلال تقسيم عضلات الألوية 2.
  3. تشريح جزئيا وتقليم البرانية للعصب الظنبوبي باستخدام مقص مستقيم الدقيقة وامتصاص الماء الزائد مع شاش معقم أو نصائح القطن.
  4. قطع العصب الظنبوبي مع الدقيقة مقص.
  5. موقف العقيمة الشيتوزان قطاع (5 × 4 أبعاد ملم) تحت العصب الظنبوبي باستخدام ملقط الصغيرة.
  6. تقريب جذوعها العصب نهاية إلى نهاية الدقيقة مع ملقط على قطاع اصقة الورد.
  7. قطاع تلتزم بشكل كامل في العصب تشكيل طوق، التي يمكن أن تساعد مع تناوب العصب أشعة الليزر خلال القطاع.
  8. تفعيل ارتفع لاصقة مع الليزر كما هو موضح في الخطوات 3.6) و 3.7).
  9. تقليم لاصقة زائدة ارتفع من ذوي الياقات البيضاء من العصب تعمل.
  10. إغلاق العضلات والجلد مع خمسة الغرز 3-0 5.
  11. وينبغي اتباع إجراءات الاسترداد القياسية بعد الجراحة بما في ذلك التفتيش اليومية لتفزر أو تشكيل القيح وإدارة مسكن، إذا لزم الأمر.

5. ممثل النتائج

الأفلام التي يتم الحصول مشرقة ارتفعت في اللون، رقيقة ولها سطح أملس (الشكل 1). كما أنها مرنة ويمكن دخلت أنابيب ذات قطر صغير من دون دموع مما تسبب في أضرار أخرى أو أي الظاهر (1B الشكل). لاصقة روز وقمم امتصاص اثنين في 530 و 562 نانومتر، والليزر الأخضر وبالتالي يمتص بقوة لاصقة وطول المقابلة في توهين 532 نانومتر ~ 12 ميكرون هو (الشكل 3). في المقابل، الشيتوزان الأفلام دون RB خفف ضعيفة ليزر (1/162 ميكرومتر ~ A)، من المحتمل بسبب تشتت. ويبدو من مؤامرة الأطياف التي لم تجميع كبيرة من RB يحدث في الأفلام.

ارتفعت السندات لاصقة بقوةإلى الأمعاء عند تشعيع الليزر (الشكل 2) تحقيق الحمل الأقصى نموذجية في عدم قدره 0.9 ± 0.4 N (N = 30). وقدرت قوة لاصقة والحمل الأقصى مقسوما على مساحة سطح لاصقة، وهما، 15 ± 6 كيلو باسكال (ن = 30). لاصقة روز غير المشع المستعبدين أقل بكثير للأنسجة (2 ± 2 كيلو باسكال، N = 30، ر المفردة للتجارب ع <10 6). وقد تحقق بنجاح مفاغرة في الجسم الحي من العصب الظنبوبي بعد تطبيق، وارتباط لاصقة من ردة بالاشتراك مع ليزر خضراء. أسبوع واحد بعد العمل الجراحي، وكان العصب تعمل في استمرارية وقوة إصلاح هو 17 ± 9 كيلو باسكال (ن = 10).

figure-protocol-1
الشكل 1. ومسبوكة A) والحل RB-الشيتوزان على سمك البرسبيكس (لوح مسطح لوح ~ 5 مم). يتم وضع ورقة الرسم تحت لوح لتسهيل الخطوة الجافة الصب. وو المياه غير قابلة للذوبانيتم الحصول على ILM أسبوعين بعد الصب. B) وردة لاصقة مرنة ويمكن دخلت اسطوانة صغيرة.

figure-protocol-2
الشكل 2. والمستعبدين وردة لاصقة الأمعاء العجل بعد التشعيع بالليزر. يتم تطبيق التشعيع موحدة بشأن لاصقة RB خلال الأنسجة الرابطة، وتظهر البقع اختيار ولكن في هذه الصورة لتوضيح تأثير الصورة تبيض ليزر على لاصق.

figure-protocol-3
الشكل 3. وطيف الامتصاص (في وحدات التعسفي) من روز لاصقة تبين قمتين بنحو 530 و 562 نانومتر. ليزر أخضر (λ = 532 نانومتر) وبالتالي يمتص بقوة لاصقة أثناء التعرض ليزر. الشيتوزان لاصقة دون RB يمتص شعاع الليزر سيئة.

ن المساحة (مم 2) السلطة (W) مرة (مرات) فلوينس (J / سم 2) I (W / سم 2) الحمولة القصوى / منطقة (كيلو باسكال)
لاصق ليزر + 30 60 ± 10 0.18 ± 0.03 365 ± 5 ~ 110 ~ 0،9 15 ± 1
لاصق 30 60 ± 10 NA NA NA NA 2 ± 2

الجدول 1. أسطورة. ن، عدد العينة؛ المنطقة، المساحة السطحية لللاصقة روز (يعني ± الخطأ كحد أقصى)؛ مرن، ليزر الطاقة (يعني ± الخطأ كحد أقصى)؛ الوقت، الوقت التشعيع (يعني ± الخطأ كحد أقصى)؛ فلوينس، متوسط ​​فلوينس الليزر، وأنا، يقدر معدل العائد الداخليadiance؛ الحمولة القصوى / المنطقة، الحمولة القصوى في فشل إصلاح الأنسجة مقسوما على مساحة سطح لاصق، (يعني ± SE).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ارتفع يستند لاصقة على تلفيق عملية الصب الجاف بسيطة، على الرغم من أن حل RB في الرقم الهيدروجيني الحمضية يتطلب اثارة طويلة من الشيتوزان الحل. من المهم السماح للحل تجف حتى يصبح فيلم غير قابلة للذوبان بالماء. يحدث هذا عندما يكون محتوى الماء الوزن هو ~ 10٪ في الفيلم المجففة 6. ويتم الحصول على عادة الأفلام غير قابلة للذوبان 2 أسابيع بعد الصب الجاف في الظروف القياسية لدرجة الحرارة والضغط (~ 25 ° C و~ 1 ATM). آلية الترابط الأنسجة ليست واضحة حتى الآن، على الرغم من أنه لوحظ أن ين...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل منحة بحثية UWS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
روز البنغال سيغما الدريخ 632-69-9
الشيتوزان (المتوسطة MW) سيغما الدريخ 10318AJ
حمض الخليك الجليدية سيغما الدريخ 08050051 2٪ ت / ت في المياه DI
النمام المغناطيسي Heidolph MR-هيي ميكس S
نبذ بيكمان كولتر X-12R أليجرا
الطيف فاريان كاري 4000 UV-المرئية
الليزر CNI الليزر MGL-532
جهاز لقياس الابعاد الصغيرة جدا ميتوتويو سلسلة 227
المجهر الجراحي زايس OPMI

المراجع

  1. O'Neill, A. C., Winograd, J. M. Microvascular anastomosis using a photochemical tissue bonding technique. Lasers Surg. Med. 39, 716-722 (2007).
  2. Yao, M., Yaroslavsky, A. Phototoxicity is not associated with photochemical tissue bonding of skin. Lasers Surg. Med. 42, 123-131 (2010).
  3. Lauto, A., Mawad, D. Photochemical Tissue Bonding with Chitosan Adhesive Films. Biomedical Engineering OnLine. 9, 47(2010).
  4. Chan, B. P., Kochevar, I. E. Enhancement of porcine skin graft adherence using a light-activated process. J. Surg. Res. 108, 77-84 (2002).
  5. Lauto, A., Faster, L. J. Sutureless nerve repair with laser-activated chitosan adhesive: a pilot in vivo study. Photomed. Laser Surg. 26, 227-234 (2008).
  6. Lauto, A., Hook, J. Chitosan adhesive for laser tissue repair: in vitro characterization. Lasers Surg. Med. 36, 193-201 (2005).
  7. Au, V., Madison, S. A. Effects of singlet oxygen on the extracellular matrix protein collagen: oxidation of the collagen crosslink histidinohydroxylysinonorleucine and histidine. Arch. Biochem. Biophys. 384, 133-142 (2000).
  8. Encinas, M. V., Rufs, A. M. Xanthene dyes/amine as photoinitiators of radical polymerization: A comparative and photochemical study in aqueous medium. Polymer. 13, 2762-2767 (2009).
  9. Pini, R., Rossi, F. A new technique for the closure of the lens capsule by laser welding. Ophtalmic Surgery Lasers & Imaging. 39, 260-2626 (2008).
  10. Wieken, K., Angioi-Duprez, K., Lim, A. Nerve anastomosis with glue: comparative histologic study of fibrin and cyanoacrylate glue. J. Reconstr. Microsurg. 19, 17-20 (2003).
  11. Menovsky, T., Beek, J. F. Laser, fibrin glue, or suture repair of peripheral nerves: a comparative functional, histological, and morphometric study in the rat sciatic nerve. J. Neurosurg. 95, 694-699 (2001).
  12. García, P., Jorge, H. E. Comparative study of the mechanical behavior of a cyanoacrylate and a bioadhesive. J. Mater. Sci. Mater. Med. 15, 109-115 (2004).
  13. Lauto, A. Integration of extracellular matrix with chitosan adhesive film for sutureless tissue fixation. Lasers Surg. Med. 41, 366-371 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تصنيع وتطبيق روز البنغال، الشيتوزان أفلام في إصلاح الأنسجة ليزر
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.