مقالة منهجية

و

13.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/4166

⸱

أغسطس 15, 2012

 ,  ,  ,  , 
1Infectious Disease Research Center, CHUL (CHUQ), Quebec City, Quebec, Canada

في هذه المقالة

ملخص

لقد قمنا بتطوير في المختبر الملاريا HIV-1 المشاركة في عدوى نموذج لدراسة تأثير المتصورة المنجلية على دورة HIV-1 تنسخي في الإنسان الضامة الوحيدات المستمدة من الابتدائي. ويمكن بسهولة لهذا النظام تنوعا أن تتكيف مع غيرها من أنواع الخلايا الأساسية عرضة للعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1.

الملخص

المتصورة المنجلية، العامل المسبب الاكثر دموية شكل من الملاريا، وفيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 (HIV-1) هي من بين المشاكل الصحية الأكثر أهمية في جميع أنحاء العالم، بأنها مسؤولة عن ما مجموعه 4 ملايين حالة وفاة سنويا 1. ما زال يجهل الكثير بسبب تداخلها واسعة في المناطق النامية، ولا سيما في أفريقيا جنوب الصحراء، وشارك في الإصابات بمرض الملاريا، وفيروس نقص المناعة البشرية 1-شائعة، ولكن التفاعل بين هذين المرضين. وأشارت التقارير الوبائية أن عدوى الملاريا يعزز عابر HIV-1 ويزيد من تكرار الحمل HIV-1 الفيروسية في المشاركة في الأفراد المصابين 2،3. لأن هذا viremia يبقى عالية لعدة أسابيع بعد العلاج مع الأدوية المضادة للملاريا، ويمكن لهذه الظاهرة يكون لها تأثير على تطور المرض وانتقال العدوى.

وقد تم دراسة الآليات المناعية الخلوية وراء هذه الملاحظات نادرا فقط. القليلة في المختبر دراسات investigating تأثير الملاريا على HIV-1 أظهرت أن التعرض لمستضدات الملاريا قابل للذوبان يمكن أن تزيد من عدوى HIV-1 وإعادة تنشيط في الخلايا المناعية. ومع ذلك، وتستخدم هذه الدراسات مقتطفات خلية كاملة من بي. طفيليات المنجلية مرحلة المتقسمة والخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMC)، مما يجعل من الصعب فك أي مكون ملاريا (ق) كان مسؤولا عن الآثار الملحوظة وما الخلايا المضيف الهدف كان 4،5. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة التي تعرض من غير ناضجة الخلايا الجذعية المستمدة من الوحيدات في هيموزوين الصباغ ملاريا زيادة قدرتها على نقل HIV-1 لخلايا CD4 + T 6،7، ولكنها انخفضت عدوى HIV-1 من 8 الضامة. لتسليط الضوء على هذه العملية المعقدة، وتحليل منهجي للتفاعلات بين طفيلي الملاريا وHIV-1 في الإنسان ذات الصلة مجموعات سكانية مختلفة الخلية الأولية وهناك حاجة خطيرة.

عدة تقنيات للتحقيق في تأثير Hوقد وصفت IV-1 على البلعمة من الكائنات الحية الدقيقة وتأثير العوامل الممرضة مثل على النسخ المتماثل-1 فيروس نقص المناعة البشرية. نقدم هنا وسيلة للتحقيق في الآثار المترتبة على P. المنجلية المصابة كرات الدم الحمراء على تكرار HIV-1 في الإنسان الضامة الوحيدات المستمدة من الابتدائي. ويتم رصد تأثير التعرض للطفيلي على HIV-1 النسخي / متعدية أحداث باستخدام الفيروسات دورة واحدة في pseudotyped التي جين مراسل luciferase حلت محل الجينات إنفيرومنتل بينما يتحدد تأثير على كمية من فيروس صدر عن الضامة المصابة عن طريق قياس HIV-1 بروتين P24 قفيصة بواسطة ELISA في supernatants الخلية.

البروتوكول

ملاحظة: يجب إجراء التجارب مع HIV-1 و المنجلية في المختبرات المناسبة مستوى السلامة الأحيائية (BSL2 للطفيليات، وBSL3 عن HIV-1 والأمراض المشتركة)، ويجب اتخاذ الاحتياطات الخاصة عند استخدام الدم البشري المحتمل أن تكون مصابة.

1. الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMC) تنقية (استنادا إلى 8 و 9)

  1. تبدأ مع الدم البشري الطازج من المتبرعين الأصحاء (500 مل) تعامل مع مضادات التخثر (الهيبارين، سترات، سكر العنب حامض أو سيترات سيترات الدكستروز الفوسفات). استخدام سم داخلي المنشأ خالية من الكواشف عندما تنقية وعزل PBMC وخلال الفترة المتبقية من البروتوكول.
  2. تطهير كيس دم، بما في ذلك الأنبوب، مع الايثانول 70٪، وقطع الأنابيب ونقل بعناية الدم في قارورة T150.
  3. إعداد 16 الأنابيب مع 15 مل متوسط ​​فصل الخلايا اللمفاوية (Ficoll) في أنبوب 50 مل المخروطية (تأكد من أن Ficoll قد وصلت درجة حرارة الغرفة).مل بعناية طبقة 30 من دماء جديدة في القمة.
  4. الطرد المركزي في 400 XG لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية مع تقطع.
  5. أثناء الطرد المركزي، وإعداد 8 × 50 مل أنابيب مخروطية الشكل مع 25 مل من محلول هانك غرفة درجة الحرارة في سولت المتوازن (HBSS) في أنبوب.
  6. نقل بعناية الحلبة خلية غائم في واجهة (يحتوي على PBMC) إلى أنبوب 50 مل تحتوي على HBSS (خواتم تجمع الخلية 2 في أنبوب). استكمال وحدات تخزين تصل إلى 50 مل مع HBSS.
  7. الطرد المركزي في 150 XG لمدة 15 دقيقة عند 20 درجة مئوية مع وجود فواصل في.
  8. أثناء الطرد المركزي لحلقة خلية غائم، وجمع طبقة صفراء العلوي من الخطوة Ficoll، تجمع البلازما لملء أنبوب 50 مل مخروطي. تعطيل تكمل في البلازما عن طريق تسخين أنبوب 50 مل عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة و 10 دقيقة تدور في ز س 1800. إبقاء طاف (يحتوي على البلازما ذاتي المخفف التي يمكن استخدامها كمكمل المتوسطة في خطوات لاحقة).
  9. إزالة بعناية وطاف وresuspenد الخلية بيليه من الخطوة 1.7 في 25 مل من الكريات 2 HBSS وبركة لكل أنبوب 50 مل. تدور في 300 XG لمدة 8 دقائق في 20 درجة مئوية
  10. إزالة بعناية وطاف resuspend الكريات في HBSS مل (10) وتجمع في أنبوب واحد 50 مل.
  11. يأخذ قسامة، نفذ التريبان استبعاد الأزرق لتقييم الوفيات والاعتماد ثم PBMC.
  12. كاملة الحجم إلى 50 مل مع HBSS وتدور في 10 دقيقة ز × 300. إزالة طاف وresuspend الخلايا في RPMI 1640 في 5x10 6 خلية / مل (واحد وينبغي الحصول على حوالي 400-500 X PBMC 6 10 من 500 مل من الدم).

2. حيدات المستمدة من الضامة (MDM) التفاضل (واستنادا إلى 8 و 9)

  1. البذور حوالي 1.25 × 10 8 PBMC في أطباق 15 سم مع RPMI 1640 (25 مل / طبق).
  2. اسمحوا الخلايا الالتزام لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ جو 2 CO.
  3. نقل عدم الالتزام بها الخلايا في قارورة جديدة وغسل لوحة مع 15 مل مرتين في برنامج تلفزيوني سم داخلي المنشأ خالية من (5دقيقة، و 300 x ج). هذه الخلايا هي الالتزام حيدات معزولة.
  4. للسماح حيدات معزولة حديثا على التمايز إلى MDM، إضافة 20 مل من متوسط ​​1640 RPMI تستكمل مع البلازما ذاتي 5٪ (من الخطوة 1.8). إضافة الإنسان مستعمرة البلاعم عامل تحفيز المؤتلف (M-CSF، و 25 نانوغرام / مل) والبنسلين / الستربتومايسين عقار حل (PS و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / الستربتوميسين مل). احتضان لمدة 2 أيام، وتغيير والمتوسطة واحتضان 2-3 أيام إضافية بلغت 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
  5. إزالة متوسط ​​العمر، ويغسل مع الذيفان الداخلي خالية من مرة واحدة في برنامج تلفزيوني، إضافة PBS بلطف ونضح على الفور. لفصل MDM متباينة تماما، وعلاج الخلايا مع مل ~ Accutase 7 (Accutase، مزيج المتاحة تجاريا من البروتياز والنشاط كولاجين التي تسمح للانفصال من الخلايا من صحن البلاستيك) ل15-20 دقيقة في 37 درجة مئوية في ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 الغلاف الجوي، وموسيقى الروك بلطف في وقت منتصف العام القادم.
  6. إضافة 3-5 مل بلازما ذاتي (من الخطوة 1.8) في كل لوحة (للمساعدة على حماية الخلايا في حينالقشط).
  7. كشط بلطف خلايا التأكد من أن متوسط ​​يغطي الخلايا في جميع الأوقات، ونقل / تجمع في أنبوب 50 مل.
  8. شطف مع لوحات سم داخلي المنشأ خالية من برنامج تلفزيوني لاسترداد العديد من الخلايا ممكن.
  9. تدور 5 دقائق عند 200 XG، تجاهل طاف.
  10. Resuspend بيليه في 5 مل الثقافة المتوسطة MDM (RPMI 1640 تستكمل مع المصل الجنين بنسبة 10٪ مكملة-المعطل البقري (iFBS)، وتبسيط العمليات، HEPES 25 مم) وخلايا العد (MDM تسفر عادة 2-8٪ من مجموع PBMC). ملاحظة: يمكن اتخاذها 1 قسامة من MDM في هذه الخطوة لتقييم خلية نقاء السكان حسب التدفق الخلوي، وعادة ما يتم الحصول عليها من 99٪ من MDM صريحة CD14.
  11. البذور 1x10 5 MDM في 600 ميكروليتر من وسط ثقافة MDM لكل بئر في 24 وحات جيدة.
  12. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO 2 قبل العدوى.

3. الإنتاج وتحديد الكميات من الأسهم HIV-1 الفيروسية

  1. إنتاج مخزونات الفيروسية باستخدام الكالسيوم ترنسفكأيشن الفوسفات في لون أسلو الخلايا HEK293Tجناح بروتوكول فورتين وآخرون. 10.
  2. من أجل الحصول على دورة واحدة تحتوي على الفيروسات الجينات مراسل luciferase ترميز، وخلايا HEK293T التعاون مع transfect إما ميكروغرام 20 من NL4.3 إنفيرومنتل + لوك - R + و 10 ميكروغرام من pHCMV-G، أو 15 ميكروغرام من NL4.3 لوك + إنفيرومنتل - R + و 15 ميكروغرام من الحياة الفطرية pJRFL. استخدم 30 ميكروغرام من NL4.3 إنفيرومنتل + لوك - R + لتوليد سيطرة بروتين سكري التي تعاني من نقص الفيروسات. للكشف عن الفيروس تنسخي تماما، استخدم 30 ميكروغرام من الحياة الفطرية NL4.3Bal. ناقلات pHCMV-G والحياة الفطرية pJRFL ترميز بروتينات سكرية مغلف من فيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV-G)، وعلى 1-فيروس نقص المناعة البشرية CXCR5-مدار (مختلفة من الحياة الفطرية NL4.3Bal)، على التوالي. ويمكن الحصول على معلومات إضافية عن البلازميدات في الفترة من 8. ويمكن الحصول على البلازميدات من خلال أبحاث الإيدز المعاهد الوطنية للصحة وبرنامج المرجعي (NIAID، المعاهد الوطنية للصحة).
  3. تحديد جميع المخزونات الفيروسية باستخدام ELISA للبروتين قفيصة HIV-1 P24 11، والتحقق من قدراتهم المعدية قبل استخدامها. نقيم العدوى من مخزونات فيروس لدينا من خلال استخدام خلايا مؤشر TZM BL-12.

4. ثقافة الطفيليات المنجلية (استنادا 13)

4.1 ثقافة العامة وصيانة طفيليات

  1. الحفاظ على P. المنجلية طفيليات 3D7 مرحلة اللاجنسي في كريات الدم الحمراء البشرية (فصيلة الدم O +) في الهيماتوكريت 4٪ في RPMI 1640 (مخزنة مع 25 HEPES ملم و 25 ملم NaHCO 3) تستكمل مع الثاني Albumax 0.5٪ (W / V)، و 25 ميكروغرام / مل جنتاميسين و370μM هيبوزانتين عند 37 درجة مئوية في خليط غاز الأكسجين بنسبة 1٪ / 5٪ ثاني أكسيد الكربون في النيتروجين.
  2. يمكن رصد تطفلن الدم عن طريق جعل مسحة رقيقة من ثقافة وتلطيخ مع حل بالغيمزا 15٪.
  3. تحافظ دائما على شخص لا يحمل العدوى خلايا الدم الحمراء (uRBC) طبق ثقافة في نفس الظروف الطفيليات لاستخدام عنصر تحكم.
    للحصول على مرحلة متأخرة parasitوفاق (النواشط / schizonts المبكر)، وتزامن الطفيليات على النحو التالي:

4.2 الطفيلي تزامن

  1. في الصباح، وحصاد ثقافة طفيلي، وتدور 5 دقائق في 300 XG وتجاهل طاف.
  2. Resuspend بيليه في 5 مجلدات الخلية محملة 5٪ (W / V) D-سوربيتول واحتضان 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  3. تدور 5 دقائق في ز × 300، تجاهل طاف، resuspend بيليه في 30 مل المتوسطة والثقافة، ووضع مرة أخرى في الحاضنة.
  4. ما يقرب من 8 ساعات في وقت لاحق، كرر الخطوات من 4.2.1 إلى 4.2.3 من أجل الحصول على طفيليات متزامنة بإحكام. ويمكن بعد ذلك طفيليات المرحلة المتأخرة (النواشط / schizonts المبكر) أن تحصد في صباح اليوم التالي لإجراء التجربة. قبل التنقية، نفذ تلوين غيمزا لتأكيد مرحلة دورة الحياة.

4.3 المتصورة المنجلية المصابة خلايا الدم الحمراء (iRBC) تنقية

  1. تعقيم الفاصل VarioMacs (موقف والمغناطيس) مع الايثانول 70٪ و فالدانتيل تحت غطاء محرك السيارة البيولوجية.
  2. إصلاح محبس الثلاثية إلى أسفل العمود CS.
  3. قطع نهاية إبرة حامية من البلاستيك مع قطع Miltenyi استثنائية وتحدد الإبرة إلى أسفل محبس.
  4. قفل عمود في مغناطيس بعناية.
  5. إزالة جميع فقاعات الهواء في العمود ببطء عن طريق ضخ 10 مل من وسط ثقافة MDM مع المحقنة عدة المغلقة ثمل على الجانب الأيسر من محبس.
  6. غسل عمود مع متوسط ​​~ 20 مل ثقافة MDM.
  7. حصاد RBC من لوحة الثقافة، ويغسل مرة واحدة مع 10 مل المتوسطة MDM (300 XG، 5 دقائق) وبيليه على resuspend RBC في 12 مل MDM الثقافة المتوسطة. إضافة إلى العمود ببطء والسماح للتدفق من خلال تعليق (سيتم الاحتفاظ فقط إصابة خلايا الدم الحمراء التي تحتوي على طفيليات في أتروفة أو مرحلة المتقسمة بواسطة الحقل المغناطيسي للأرض بسبب وجود بلورات هيموزوين).
  8. يغسل مرة واحدة مع متوسط ​​20 مل، ووقف تدفق السائل عندما يصل إلى قرص أبيض في أعلى العمود.
  9. إزالة العمود من المغناطيس وiRBC أزل في أنبوب معقم نظيف مع 12 مل المتوسطة ثقافة MDM.
  10. تشويه 1 قسامة من iRBC تعافى وأداء تلوين غيمزا لتأكيد دورة المرحلة.
  11. عد iRBC استردادها باستخدام haemocytometer (RBC معزولة هي iRBC 100٪).
  12. خلايا بيليه (300 XG، 5 دقائق)، تجاهل طاف وعلاج الخلايا مع AB 500 الطازجة ميكرولتر + مصل الدم البشري (خطوة opsonisation 14).
  13. احتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO 2.
  14. يغسل مرة واحدة مع 10 مل المتوسطة ثقافة MDM (300 × ز، 5 دقائق)، وresuspend iRBC إلى تركيز المطلوب. عادة، وهي 10٪ تطفلن الدم ثقافة طبق 15 سم تقريبا يعطي ~ 0.5-1x10 8 iRBC متزامنة بإحكام.

5. تعرض MDM إلى المنجلية

  1. لفضح MDM إلى uRBC أو iRBC، يجب أن يكون معلق الخلايا في مستنبت MDM من أجل الحصول على نسبة من uRBC / iRBC: MDM من 75:1. في وقت سابقأعدت 24 جيد لوحات تحتوي على MDM، إضافة المناسبة حجم تعليق RBC إلى كل بئر. أداء جميع التجارب في ثلاث نسخ.
  2. شارك في احتضان الثقافات لمدة 4 ساعة على 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO 2.
  3. غسل الخلايا مع 600 ميكرولتر من الذيفان الداخلي خالية من 3 مرات في برنامج تلفزيوني، إضافة PBS بلطف ونضح على الفور.
  4. لليز في RBC الباقية، وغسل الآبار وذلك بإضافة 200 ميكروليتر من الماء المثلج معقم لمدة 20 ثانية، ونضح.
  5. إضافة 600 ثقافة MDM ميكرولتر المتوسطة واحتضان 24 ساعة على 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO 2.

6. عدوى من MDM مع تنسخي بالكامل HIV-1

  1. من أجل تقييم أثر بي. المنجلية على النسخ المتماثل-1 فيروس نقص المناعة البشرية في MDM، إضافة، وفقا للمخطط المبين في الشكل 1A، 10 نانوغرام من P24 (في 300 ميكروليتر من وسائل الإعلام MDM) من فيروسات الحياة الفطرية NL4.3Bal في الآبار الملائمة؛ إضافة المتوسطة فقط MDM في آبار المراقبة .
  2. احتضان 2 ساعة على 37 درجة مئوية في 5ثاني أكسيد الكربون بنسبة 2٪ الغلاف الجوي.
  3. غسل الخلايا مع الذيفان الداخلي خالية من 3 مرات في برنامج تلفزيوني، إضافة PBS بلطف ونضح على الفور. إضافة 600 ميكرولتر من متوسط ​​MDM جديدة لكل بئر.
  4. احتضان في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO 2.
  5. في أيام 3 و 6 و 9 و 12 بعد بدء العدوى الفيروسية، حصاد 200 ميكرولتر من كل طاف، مضيفا 200 ميكرولتر من متوسط ​​MDM جديدة بعد ذلك. الحفاظ على supernatants حصادها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لتحديد الكميات من البروتين HIV-1 الرئيسية P24 قفيصة بواسطة ELISA بعد فورتين وآخرون. 10.

7. عدوى من MDM واحدة مع دورة فيروس luciferase المراسل ترميز

  1. من أجل تحديد تأثير الطفيلي على HIV-1 التعبير الجيني في MDM، إضافة، وفقا للمخطط المبين في الشكل 1B و 10 نانوغرام P24 (في 300 ميكروليتر من وسط MDM) إما NL4.3 إنفيرومنتل + لوك - R + ( VSV-G)، NL4.3 لوك + إنفيرومنتل - R + (JRFL الحياة الفطرية) أو لوك NL4.3 +الحياة الفطرية - R + الفيروسات في الآبار ذات الصلة.
  2. احتضان 2 ساعة على 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO 2.
  3. غسل الخلايا مع 600 ميكرولتر من الذيفان الداخلي خالية من 3 مرات في برنامج تلفزيوني، إضافة PBS بلطف ونضح على الفور. إضافة 600 ميكرولتر من متوسط ​​MDM جديدة لكل بئر.
  4. احتضان في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO 2.
  5. إزالة المتوسطة عدوى ساعة التالية ال 72 وإضافة 200 ميكرولتر من تحلل العازلة 1X (المرفق مع عدة فحص luciferase المراسل). السماح للخلايا ليز في درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف. مخزن عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  6. ذوبان الجليد لوحة ونقل 40 ميكرولتر من المحللة إلى لوحة luminometer 96-جيدا، إضافة 100 ميكرولتر من الركيزة luciferase المراسل (المرفق مع عدة فحص luciferase المراسل) وقياس luciferase المراسل (اليراع luciferase المراسل) النشاط في luminometer باتباع تعليمات الشركة المصنعة.

8. ممثل النتائج

باستخدام تعاوننا عدوى نموذج، وتبين لنا أن exposur(ه) من بي. المنجلية إلى MDM يقلل من تعرضها للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1. في الواقع، شهدت انخفاضا كبيرا (P <0.05، 2 طريقة ANOVA، يوم 12) ويلاحظ في الافراج عن الجسيمات الفيروسية، مقاسا HIV-1 بروتين P24 قفيصة في طاف، في MDM سابقة التجهيز مع الطفيليات (الشكل 2A). ويؤكد هذه الملاحظة في الخلايا المصابة بالفيروسات ترميز الجين-luciferase المراسل الصحفي. MDM العدوى الناجمة عن فيروسات مثل ايواء إما خارجية VSV-G أو بروتينات سكرية HIV-1 يؤدي إلى حد كبير (ف <0.05، والطالب اختبار t) إنتاج أقل luciferase المراسل في الخلايا المعرضة للP. المنجلية (الشكل 2B). من الجدير بالذكر أن VSV-G-pseudotyped الفيروسات أسفرت luciferase النشاط أكبر بكثير من نظرائهم JRFLenv، وهذا يرجع إلى كفاءة أكبر من عدوى VSV-G الجسيمات pseudotyped 15. نظرا إلى أن طفيلي معرض للآثار MDM كلا النوعين من الفيروسات، وهذا يشير إلى أنه يؤثر على بعض خطوة في السابق الجين الفيروسيpression (الشكل 2B). من المهم أيضا أن نذكر لم تتأثر أن بقاء الخلية من قبل معرض MDM إلى iRBC (لا تظهر البيانات)، مشيرا الى ان تثبيط لوحظ غير محددة، وليس بسبب وفيات الخلية.

figure-protocol-1
الشكل 1. أ) مخطط خماسي للعدوى بفيروس MDM تنسخي تماما موك: الخلايا غير المصابة. uRBC: الخلايا غير المصابة عرضة لخلايا الدم الحمراء. iRBC: الخلايا المنجلية عرضة للخلايا المصابة المتصورة الدم الحمراء. بال: الخلايا المصابة NL4.3Bal ENV بال / uRBC: الخلايا تتعرض لuRBC والمصابين NL4.3Bal ENV بال / iRBC:. الخلايا تتعرض لiRBC والمصابة مع NL4.3Bal الحياة الفطرية ب) مخطط خماسي للعدوى مع MDM دورة واحدة luciferase المراسل ترميز فيروس موك: الخلايا غير المصابة. uRBC: الخلايا غير المصابة عرضة لخلايا الدم الحمراء. iRBC: الخلايا تتعرض لالمتصورة المنجلية-Infected خلايا الدم الحمراء. Δenv: الخلايا المصابة NL4.3 إنفيرومنتل + لوك - R + JRFL: الخلايا المصابة مع NL4.3 إنفيرومنتل + لوك - R + (JRFL الحياة الفطرية). VSV الجميع: الخلايا المصابة NL4.3 إنفيرومنتل + لوك - R + (VSV-G) Δenv / uRBC:. الخلايا تتعرض لuRBC والمصابين NL4.3 لوك + ENV-R Δenv + / iRBC: الخلايا تتعرض لiRBC والمصابين NL4.3 إنفيرومنتل + لوك - R + JRFL / uRBC: الخلايا تتعرض لuRBC والمصابين NL4.3 إنفيرومنتل + لوك - R + (JRFL الحياة الفطرية). JRFL / iRBC: الخلايا تتعرض لiRBC والمصابين NL4.3 إنفيرومنتل + لوك - R + (JRFL الحياة الفطرية). vsv-g/uRBC: تعرضت لuRBC والمصابين NL4.3 إنفيرومنتل + لوك الخلايا - R + (VSV-G) vsv-g/iRBC: الخلايا تتعرض لiRBC والمصابين NL4.3 إنفيرومنتل + لوك - R + (VSV-G).

figure-protocol-2
الشكل 2. وتعرضت) تأثير المنجلية على الإنتاج-1 فيروس نقص المناعة البشرية الفيروسية في MDM MDM إلى uRBC أو iRBC في نسبة 75:1 (uRBC / iRBC: MDM) لمدة 4 ساعة ويغسل على نطاق واسع. أصيب الخلايا مع 10ng من الحياة الفطرية NL4.3Bal P24 لمدة 2 ساعة. الانتاج الفيروسية تم رصد بواسطة ELISA لHIV-1 P24 في زنزانة خالية من طاف في نقاط زمنية مختلفة بعد العدوى الفيروسية الأولية. ويرد تجربة ممثل ب) تأثير المنجلية في النسخ-1 فيروس نقص المناعة البشرية الفيروسية في MDM MDM أصيبوا مع uRBC أو iRBC في نسبة 75:1 (uRBC / iRBC:. MDM). أصيب ثم الخلايا مع 10ng من P24 من فيروس دورة واحدة (إما NL4.3 لوك + إنفيرومنتل - R +، NL4.3 لوك + إنفيرومنتل - R + (JRFL الحياة الفطرية) أو NL4.3 لوك + إنفيرومنتل - R + (VSV، ز)). تم تقييم التعبير luciferase المراسل في الخلية lysates 72 ساعة بعد الاصابة بعدوى الفيروس الأولي. ويرد تجربة تمثيلية.

المناقشة

وقد بينت لنا هنا نهجين مختلفين لتحليل الآثار المترتبة على طفيل الملاريا في دورة HIV-1 الفيروسية، أي إما عن طريق تحليل التعبير الجيني الفيروسي أو ذرية إنتاج فيروس وتكرارها في الوحيدات المشتقة من البلاعم. وقد استخدمت أساليب مماثلة لغيرها من فيروس نقص المناعة البشرية-1-طفيلي شارك في التهابات 16. ومع ذلك، فإن هذه البيانات الجديدة هي خطوة إلى الأمام في التحقيق في الملاريا HIV-1 المشاركة في الالتهابات. وفي الواقع، Diou وآخرون درس (8) وتأثير هيموزوين، طفيليات لا يعيش، على HIV-1 تكرارها؛ بالاتفاق مع نتائجنا، لاحظوا أن هيموزوين كان في حد ذاته كافيا لكبح الانتاج الفيروسية من قبل أطباء العالم، وليس MDMs.

استخدام تخطيط صفها التجريبية، لاحظنا أن P. المنجلية يمارس تأثيرات واضحة ضارة على دورة HIV-1 تنسخي في الضامة: لوحظ تثبيط كبير من الانتاج الفيروسية في الضامة مسبقا يتعرضون للطفيليات (الارقام ..ويتضح ه 2A)، ولها تأثير محدد للطفيل في النسخ الفيروسية في الشكل 2B. ومع ذلك، لا يمكننا أن نترك أي آثار إضافية للطفيل على دخول الفيروس أو الانصهار (decapsidation)، أو في مرحلة ما بعد الاندماج آليات، مثل تخليق البروتين أو فيروسي الجمعية الجسيمات والناشئين. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن أن يتم الحصول على تأثير مختلف على HIV-1 تكرارها إذا أضيفت طفيلي إما في نفس الوقت أو بعد الإصابة MDM مع الفيروس.

لدينا في نموذج التعاون عدوى المختبر يوفر أداة قوية لإجراء تحقيقات مفصلة من HIV-1 / P. المنجلية التفاعلات في الخلية المضيفة. على سبيل المثال، فإن الجمع بين هذا التصميم التجريبي مع تقنيات أخرى مثل كمية PCR الوقت الحقيقي، والتي يمكن استهدافها وتحديد خطوات محددة في retrotranscription الفيروسية والفيروسية التكامل الجينوم إلى المضيف جينوم الخلية، ممكنة جدا، وينبغي أن تسفر عن مزيد من الإعلاميينghts في الآليات التي تشارك في الأمراض المشتركة. وعلاوة على ذلك، فحوصات محددة لتقييم الخطوات في وقت مبكر من دورة الفيروسي (فيروسي الانصهار، وتحديد الكميات decapsidation دخول،) ويمكن تطبيق هذا البروتوكول إلى الأساسية لتحليل مزيد من التأثير على تكاثر الفيروس. هذه التعديلات تظهر مدى مرونة هذا البروتوكول والمتعلقة HIV-1 تحديد الكميات والكشف: في الواقع، حتى معيار تحديد الكميات المنتسخة HIV-1 العكسي فحوصات باستخدام التريتيوم المسمى النيوكليوتيدات يمكن أن تحل محل تصور لإليسا لفيروس نقص المناعة البشرية 1-P24. بالإضافة إلى MDM، ونحن نتوقع أن يكون لدينا نظام للتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى ذات الصلة لفيروس نقص المناعة البشرية-1-الملاريا التفاعلات، مثل وحيدات الخلايا الجذعية. حقيقة أن MDM هي خلايا ملتصقة يسهل التلاعب بهم، والسماح لغسل سهلة للخروج من iRBC التي لم تؤخذ في، أو التي هي على اتصال مع أطباء العالم، دون أن يلغي أي الضامة. وهذه ميزة لا ينطبق على الخلايا الجذعية وحيدات، والتي يتم تربيتها في التعليق، تعقيد حد ذاتهاparation من iRBC uRBC والحرة مع مثل هذه الخلايا، ونحن نعالج هذه المسألة حاليا. يمكن أن نظامنا يكون من المفيد أيضا لدراسة التفاعلات أكثر تعقيدا مثل آثار الخلايا المشتقة من الوحيدات المتصورة للتعرض على الدورة HIV-1 فيروسي في الخلايا المناعية الأخرى مثل CD4 إيجابية الخلايا التائية في المشاركة في ثقافة التجارب. أخيرا، يمكن أن لدينا بروتوكول تكون مناسبة لتجارب تبحث في تأثير P. iRBCs المنجلية في تنشيط-1 فيروس نقص المناعة البشرية في PBMC للأفراد HIV-1 المصابة.

بيان الأخلاق

وقد تم الحصول على الإنسان PBMC من الدم من المتبرعين الأصحاء، وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات علم الأحياء في مركز Hospitalier دي مركز أبحاث جامعة L'لافال. تم الحصول على موافقة خطية من جميع المتبرعين بالدم.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة من خلال محفز المشارك العدوى ومنح المشارك حالة مرضية مختلفة. وقدم كرات الدم الحمراء الإنسان من قبل Hospitalier مركز دي بنك جامعة لافال L'الدم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة فهرس العدد تعليقات
RPMI 1640 Multicell 350-000-CL
PBS، الذيفان الداخلي مجانا سيغما D8662
FBS Wisent 080-150 حرارة المعطل في 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة
Accutase eBiosciences 00-4555-56
Albumax الثاني Gibco 11021-037 الذائبة في RPMI 1640، فلتر معقم
اللمفاويات فصل المتوسطة Multicell 305-010-CL
لوحات بيضاء luminometer Promega Z3291
CS بالاعمال فصل columms Miltenyi في مجال التكنولوجيا الحيوية 130-041-305
VarioMacs الفاصل Miltenyi في مجال التكنولوجيا الحيوية 130-090-282
البنسلين / الستربتومايسين عقار حل Wisent 450-201-EL
D-السوربيتول سيغما الدريخ S1876
مكشطة الخلية (25 سم) Sarstedt 83،1830
24 حسنا لوحات خلية الثقافة دينار بحريني الصقر 353047
150 × 20 مم طبق ثقافة Sarstedt 83.1803.003
M-CSF Genscript Z02001
HEPES سيغما الدريخ H4034
الإنسان مصل الدم AB + وادي الطبية الحيوية HP1022
HBSS Wisent 311-505-CL
جنتاميسين سيغما الدريخ G1397
هيبوزانتين سيغما الدريخ H9636
NaHCO 3 سيغما الدريخ S5761
luciferase المراسل فحص النظام Promega E1500
خلايا الدم الحمراء حصل بنك الدم النقي من شول.

المراجع

  1. WHO. World Malaria Report. , (2005).
  2. Kublin, J. G., Patnaik, P., Jere, C. S. Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study. Lancet. 365, 233-240 (2005).
  3. Cuadros, D. F., Branscum, A. J., Crowley, P. H. HIV-malaria co-infection: effects of malaria on the prevalence of HIV in East sub-Saharan Africa. Int. J. Epidemiol. 40, 931-939 (2011).
  4. Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha. J. Infect. Dis. 177, 437-445 (1998).
  5. Froebel, K., Howard, W., Schafer, J. R. Activation by malaria antigens renders mononuclear cells susceptible to HIV infection and re-activates replication of endogenous HIV in cells from HIV-infected adults. Parasite Immunol. 26, 213-217 (2004).
  6. Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. Dendritic cells derived from hemozoin-loaded monocytes display a partial maturation phenotype that promotes HIV-1 trans-infection of CD4+ T cells and virus replication. J. Immunol. 184, 2899-2907 (2010).
  7. Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. Malaria hemozoin modulates susceptibility of immature monocyte-derived dendritic cells to HIV-1 infection by inducing a mature-like phenotype. Cell Microbiol. 12, 615-625 (2010).
  8. Diou, J., Gauthier, S., Tardif, M. R. Ingestion of the malaria pigment hemozoin renders human macrophages less permissive to HIV-1 infection. Virology. 395, 56-66 (2009).
  9. Davies, J. Q., Gordon, S. Isolation and culture of human macrophages. Methods Mol. Biol. 290, 105-116 (2005).
  10. Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity. J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).
  11. Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J. Virol. 76, 1004-1014 (2002).
  12. Wei, X., Decker, J. M., Liu, H. Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).
  13. Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193, 673-675 (1976).
  14. Turrini, F., Ginsburg, H., Bussolino, F., Pescarmona, G. P., Serra, M. V., Arese, P. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected human red blood cells by human monocytes: involvement of immune and nonimmune determinants and dependence on parasite developmental stage. Blood. 80, 801-808 (1992).
  15. Akkina, R. K., Walton, R. M., Chen, M. L., Li, Q. X., Planelles, V., Chen, I. S. High-efficiency gene transfer into CD34+ cells with a human immunodeficiency virus type 1-based retroviral vector pseudotyped with vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G. J. Virol. 70, 2581-2585 (1996).
  16. Zhao, C., Papadopoulou, B., Tremblay, M. J. Leishmania infantum enhances human immunodeficiency virus type-1 replication in primary human macrophages through a complex cytokine network. Clinical Immunol. 113, 81-88 (2004).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

البلعميات المشتقة من الخلايا الوحيدةمقايسة تضاعف فيروس نقص المناعة البشرية-1كشف p24 بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيمنظام لوسيفيريز المراسلالتعرض لخلايا الدم الحمراء المصابةطريقة عزل خلايا VEACحصاد الطافي الفيروسيتقدير كمية اللوسيفيريز
و
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.