في هذا التقرير، إلا أننا شرح الخطوات تلطيخ وتحليل لفحص phenotyping أجريت على الدم الكامل الطازج تعداد السكان الرئيسية الكريات البيض الفطرية والتكيفية. نؤكد اعتبارات لأداء هذه الإجراءات في سياق محاكمة متعددة المراكز السريرية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تعداد خلايا الدم البيضاء الكبرى الطرفية بالسكان الدم للمحاكمات متعددة المراكز السريرية باستخدام الدم الكامل الفحص Phenotyping
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ويستخدم على نطاق واسع الحفظ بالتبريد من الكريات البيض في الدم المحيطي للحفاظ على خلايا لتقييم الاستجابة المناعية في التجارب السريرية وتوفر العديد من المزايا لسهولة وتوحيد المقررة المناعية، ولكن لوحظت آثار ضارة لهذه العملية على بعض مجموعات فرعية الخلية، مثل المحببة وخلايا B ، والخلايا الجذعية 1-3. يعاير الكريات البيض الطازج يعطي صورة أكثر دقة للدولة في الجسم الحي من الخلايا، ولكن في كثير من الأحيان من الصعب القيام بها في سياق التجارب السريرية الكبيرة. المقايسات الخلية الطازجة تعتمد على الالتزامات المتطوعين والأطر الزمنية، وإذا كان يستغرق وقتا طويلا، يمكن أن يكون تطبيقها غير عملي نظرا لساعات العمل المطلوبة من العاملين في المختبرات. وبالإضافة إلى ذلك، عندما يتم إجراء محاكمات في مراكز متعددة، قد لا المختبرات مع الموارد والتدريب اللازم لأداء فحوصات تكون موجودة على مقربة كافية لمواقع السريرية. لمعالجة هذه القضايا، لدينا جمعةتم تطويرها لتلطيخ الأجسام المضادة 11-لون لوحة التي يمكن استخدامها مع أنابيب Trucount (بيكتون ديكنسون، سان خوسيه، كاليفورنيا) لوالنمط الظاهري تعداد السكان الرئيسية الكريات البيض في الدم المحيطي، مما أسفر عن أكثر قوة من نوع الخلية معلومات محددة من فحوصات مثل عد الدم الكامل (CBC) أو المقايسات المتاحة تجاريا مع لوحات مصممة لأنابيب Trucount أن وصمة عار فقط لأنواع الخلايا قليلة. الإجراء تلطيخ بسيط، يتطلب سوى 100 ميكرولتر من الدم الكامل الطازج، ويستغرق حوالي 45 دقيقة، مما يجعل من الممكن لمعيار الدم تجهيز مختبرات لتنفيذ. أنها مقتبسة من الأنبوب Trucount BD رقة البيانات الفنية ( الإصدار 8/2010 ). ويمكن إعداد كوكتيل الضد تلطيخ مقدما بكميات كبيرة في مختبر الفحص المركزي وشحنها إلى معامل معالجة الموقع. يمكن ان تكون ثابتة أنابيب الملونوجمدت لشحنها إلى المختبر المركزي للفحص تدفق متعدد الألوان التحليل الخلوي. ويمكن استخدام البيانات الناتجة عن هذا الفريق تلطيخ لتعقب التغييرات في تركيزات الكريات البيض مع مرور الوقت فيما يتعلق التدخل ويمكن بسهولة مزيد من التطوير لتقييم الدول تفعيل أنواع معينة من الخلايا في المصالح. في هذا التقرير، علينا أن نبرهن للإجراءات التي استخدمها فنيي المختبرات تجهيز الدم لأداء تلطيخ على الدم الكامل الطازج والخطوات لتحليل هذه العينات في مختبر الملون مقايسة وسط دعم متعددة المراكز السريرية محاكمة. تفاصيل الفيديو الإجراء كما يتم تنفيذ ذلك في سياق محاكمة التعادل الدم السريرية في شبكة لقاح فيروس نقص المناعة البشرية المحاكمات (HVTN).
البروتوكول
ملاحظة: لحماية الأجسام المضادة، مترافق fluorophore من الضوء، نفذ جميع الخطوات في خزانة السلامة البيولوجية مع قبالة الضوء.
1. إعداد الأجسام المضادة لوحة تلوين
- ويمكن الاطلاع على لوحة تلوين الأجسام المضادة في الجدول 1. وينبغي تحديد تركيز الأجسام المضادة من الدم الكامل مع المعايرة واستخدام التدفق الخلوي نفس المعدات والإجراءات التي سيتم استخدامها للحصول على عينات phenotyping الملون.
- مرة واحدة يتم تحدي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا التقرير، نقدم طريقة حبة المستندة إلى تعداد السكان لالكريات البيض في الدم الكامل الطازج بنسبة تغطية التدفق الخلوي والمعلمات الضرورية لاستخدامها في محاكمة متعددة المراكز السريرية مع تحليل عينة مركزية. هذا الأسلوب يعتمد على ويحسن بروتوكول Trucount BD وتمكن استخدامها موثوقة في محاكمة متعددة المراكز السريرية الإعداد. الفحص بسيط وتلطيخ يستغرق حوالي 45 دقيقة لأداء، مما يجعل من الممكن لفنيي المختبر تجهيز الدم لأداء ذلك وتجميد وشحن عينات إلى مختبر فحص المركزية لتحليلها. الفحص يتطلب .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر جيسيكا جونز، إيريكا كلارك، Ducar كونستانس، دونا سميث، لويس روي، Apedaile ليلى، يزنر جوان، آدمز ديفين، McBain كوري وVoght ستيفن لمساعدتها في تطوير هذه المخطوطة، وطريقة والفيديو.
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة بيل وميليندا غيتس CAVD منحة 38645 (MJM) والمعاهد الوطنية للصحة منح UM1 AI068618 وAI069481 U01 (MJM). EA-N. معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح T32 AI007140. نشكر الاستئماني جيمس بندلتون B. الخيرية للتبرع السخي من المعدات.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كاشف اسم | شركة | كتالوج رقم | |
| Trucount المطلق أنابيب عد | BD العلوم البيولوجية | 340334 | |
| FACS 10X Lysing الحل | BD العلوم البيولوجية | 349202 | |
| الفئة B & إعفاء نظام الشحن، معزول | SAF-T-باك | STP-320 | |
| CD45 AmCyan الأجسام المضادة أحادية المنشأ | BD العلوم البيولوجية | 339192 | |
| CD3 الأجسام المضادة أحادية المنشأ FITC | BD العلوم البيولوجية | 349201 | |
| CD8 PerCp-CY 5،5 الأجسام المضادة أحادية المنشأ | BD العلوم البيولوجية | 341051 | |
| CD4 اليكسا فلور 700 antibo وحيدة النسيلةDY | BD العلوم البيولوجية | 557922 | |
| HLA-DR ECD الأجسام المضادة أحادية المنشأ | بيكمان كولتر | IM3636 | |
| CD14 الأجسام المضادة أحادية المنشأ V450 | BD العلوم البيولوجية | 560349 | |
| CD19 PE الأجسام المضادة أحادية المنشأ | BD العلوم البيولوجية | 555413 | |
| CD16 APC-H7 الأجسام المضادة وحيدة النسيلة | BD العلوم البيولوجية | 560195 | |
| PE-CD56 Cy7 الأجسام المضادة أحادية المنشأ | BD العلوم البيولوجية | 335791 | |
| CD11c APC الأجسام المضادة أحادية المنشأ | BD العلوم البيولوجية | 559877 | |
| PE-CD123 Cy5 الأجسام المضادة أحادية المنشأ | BD العلوم البيولوجية | 551065 |
المراجع
- Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing. Cryobiology. 27, 269-278 (1990).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
