نقدم هنا طريقة للتبديل بالنشاط الضوئي للبروتينات الفلورية القابلة للتحويل الضوئي (PCFPs) في جنين سمكة الزيبرا الحي، مع تتبع لاحق للبروتين المتحول ضوئياً في نقاط زمنية محددة خلال مرحلة النمو. تتيح هذه المنهجية مراقبة الأحداث البيولوجية الخلوية التي تكمن وراء عمليات نمائية مختلفة في كائن فقاري حي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تتبع الخلية عن طريق البروتينات Photoconvertible خلال التنمية اسماك الزرد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعد عملية تكوين الجنين عملية ديناميكية يمكن دراستها بشكل أفضل باستخدام تقنيات تسمح بتوثيق التغيرات التنموية in vivo. وقد أثبت استخدام البروتينات الفلورية المشفرة جينياً أنها استراتيجية قيمة لتوضيح العمليات المورفوجينية الديناميكية أثناء حدوثها في الكائن الحي السليم. وخلال العقد الماضي، فتح تطوير البروتينات الفلورية القابلة للتنشيط الضوئي والقابلة للتحول الضوئي إمكانية استقصاء مصير مجموعات فرعية محددة من البروتينات المميّزة1. وبخلاف البروتينات القابلة للتنشيط الضوئي، يمكن تتبع وتصوير البروتينات الفلورية القابلة للتحول الضوئي (PCFPs) بسهولة في حالة انبعاثها الأصلية قبل التحول الضوئي، مما يسهل تحديد المناطق واختيارها عن طريق الفحص البصري. ويمكن تحويل البروتينات الفلورية القابلة للتحول الضوئي (PCFPs)، مثل Kaede2 وKikGR3 وDendra4 وEosFP5، من اللون الأخضر إلى اللون الأحمر عند التعرض للأشعة فوق البنفسجية أو الضوء الأزرق بسبب تسلسل ثلاثي الببتيد His-Tyr-Gly الذي يشكل كروموفوراً أخضر يمكن تحويله ضوئياً إلى كروموفور أحمر عن طريق حذف-β المحفز بالضوء والتوسع اللاحق لنظام π-conjugated3. وتعتبر البروتينات الفلورية القابلة للتحول الضوئي (PCFPs) ومتغيراتها أحادية القسيمة (monomeric) أدوات مفيدة لتتبع الخلايا6-10 ودراسة ديناميكيات البروتين11-14 على التوالي. وفي السنوات الأخيرة، تم التعبير عن PCFPs في نماذج حيوانية مختلفة، مثل سمك الزيبرا6 والدجاج7,8 والفأر9,10 لتتبع مصير الخلايا. ونحن نعرض هنا بروتوكولاً للتحول الضوئي لبروتينات PCFPs بشكل خاص في خلايا جنين سمك الزيبرا الحي، مع تتبع لاحق للبروتينات المتحولة ضوئياً في مراحل تنموية متأخرة. وتسمح هذه المنهجية بدراسة الأحداث البيولوجية الخلوية التي تكمن وراء المورفوجينية في نموذج حيوان سمك الزيبرا بطريقة متخصصة نسيجياً.
البروتوكول
1. الحصول على الأجنة من أجل مقايسة التحويل الضوئي
عند إجراء التهجين الداخلي لأسماك الزيبرا المعدلة وراثياً والتي تعبر عن PCFP، يتم اختيار الأجنة الأكثر سطوعاً وهي الأجنة متماثلة الزيجوت، وتُربى عند درجة حرارة 28.5 °C حتى الوصول إلى المرحلة الجنينية المطلوبة15.
ملاحظة 1: سيسمح هذا الاختيار المسبق بمسح الأجنة باستخدام طاقة ليزر منخفضة، مما يمنع التسمم الضوئي والبهتان الضوئي.
ملاحظة 2: نقترح استخدام ضوء منخفض الكثافة عند فحص الأجنة بصرياً والاحتفاظ بها في ظروف مظلمة نظراً للحساسية العالية لبروتينات PCFPs، مثل Kaede وKikGR، تجاه التعرض للضوء بما في ذلك ضوء النهار.
2. الطمر
- في وعاء زجاجي يحتوي على مزيج من البيض والماء، قم بإزالة غشاء الكوريون (dechorionate) من الأجنة تحت المجهر المجسم باستخدام الملاقط.
- قم بتخدير الأجنة عن طريق نقل الجنين منزوع غشاء الكوريون إلى محلول Tricaine (3-amino benzoic acidethylester, Sigma-Aldrich) بتركيز 0.16 mg/ml (بإضافة 40μl من المحلول المخزون بتركيز 4 mg/ml إلى 1 ml من وسط E3 medium 1X).
ملاحظة 1: انقل الأجنة باستخدام ماصة زجاجية أو ماصة ذات طرف مقطوع (P1000) لتقليل مخاطر إتلاف الأجنة.
ملاحظة 2: يجب عدم تعريض الأجنة الصغيرة منزوعة الغشاء الكوريائي (dechorionated) للهواء أو رفعها إلى السطح الفاصل بين الماء والهواء، لأن البيوض تتمزق بسهولة عند تعرضها للإجهاد الميكانيكي.
- انقل الجنين المخدر إلى غطاء طبق زراعة وحافظ على الجنين ضمن أصغر حجم ممكن من الوسط الغذائي.
- انقل الجنين إلى الآغاروز عن طريق سحب الجنين باستخدام آغاروز منخفض درجة حرارة الانصهار بنسبة 1% (LMA, Lonza) عند 30 °C يحتوي على 0.16 mg/ml Tricaine، وضعه على الغطاء الزجاجي لطبق زراعة ذي قاع زجاجي (MatTek Corp. Ashland MA USA). بعد ذلك، قم بتوجيه الجنين بمساعدة طرف بلاستيكي ناعم (على سبيل المثال طرف ماصة Microloader مقصوص، Eppendorf)، وعندما يتصلب الـ LMA، غطِّ الآغاروز بمحلول Tricaine بتركيز 0.16 mg/ml.
ملاحظة 1: قم بصهر 1% LMA عند 60 °C وحافظ على الأجاروز المصهور عند 30 °C.
3. التحويل الضوئي
- باستخدام مجهر بؤري مقلوب (inverted confocal microscope) مجهز بمصادر ليزر بأطوال موجية 405 نانومتر و488 نانومتر و561 نانومتر، مثل جهاز Zeiss LSM 710، يتم تصوير العينة عن طريق مسح مكدس محور زي (z-Stack scan) يغطي البنية الكاملة للعينات المراد تحويلها ضوئياً وتتبعها لاحقاً باستخدام ليزر 488 نانومتر (أي أن، وليزر الأرجون (Ar laser) بقدرة 30 ميجاوات، بكثافة تتراوح بين 5-7%، مع ضبط الكاشف عند 493-540 نانومتر) وليزر 561 نانومتر (أي، أو بمعنى آخر، وليزر DPSS 561 بقدرة 10 ميجاوات، وبكثافة تتراوح بين 7-9%، مع ضبط الكاشف عند 587-651) لمسح النسيج/العضو بحثاً عن الفلورة الخضراء والحمراء للبروتينات القابلة للتحويل الضوئي، على التوالي.
ملاحظة 1: بالنسبة لعملية المسح قبل التحويل الضوئي، استخدمنا عدسة شيئية من نوع Plan Apochromat 20x/NA 0.8.
ملاحظة 2: قم دائمًا بالمسح بحثًا عن الفلورة الحمراء قبل التجربة لاستبعاد وجود أي PCFP محول إلى اللون الأحمر تم إنتاجه عن طريق الخطأ.
- حدد أداة Time series واضبطها على دورتين بدون فاصل زمني (واحدة لما قبل التحويل الضوئي وأخرى لما بعده).
- حدد أداة Regions وعرّف منطقة اهتمام (ROI) واحدة أو أكثر لعملية التحويل الضوئي.
ملاحظة 1: نوصي أولاً بتحديد مدى الدقة التي تتطابق بها المنطقة التي تم تحويلها ضوئياً بالفعل بواسطة الليزر الماسح في منطقة الاهتمام (ROI) مع منطقة الاهتمام المختارة في البرنامج، وذلك عن طريق قياس مساحة الأنسجة/الخلايا التي تم تحويلها ضوئياً في جميع الاتجاهات الثلاثة (اتجاهات xy و z) في عينة ثابتة حيث لا يُتوقع حدوث حركة للخلايا أو البروتينات. بالنسبة للإعدادات الموضحة في هذا التطبيق، تطابقت منطقة الاهتمام (ROI) مع المنطقة التي تم تحويلها ضوئياً بدقة عالية، ولكن هذا يعتمد على العدسة الشيئية المستخدمة وكمية الليزر المطبقة للتحويل الضوئي. يمكن تقليل حجم منطقة الاهتمام (ROI) إلى حجم خلية واحدة اعتماداً على الفتحة العددية للعدسة الشيئية، وعامل التكبير، وكمية ضوء الليزر المستخدمة للتحويل الضوئي.
- اختر أداة Bleaching واضبط البدء في عملية التبييض بعد المسح 1 من 2. لقد استخدمنا ليزر ديود بقدرة 30 mW وطول موجي 405 nm للتحويل الضوئي، وتم تحسين الإعدادات بدقة للوصول إلى الحد الأدنى من ضوء الليزر اللازم لإتمام عملية التحويل الضوئي، وهو ما تحقق بشكل أساسي من خلال تغيير شدة ضوء الليزر، وعدد تكرارات المسح لمنطقة الاهتمام (ROI)، ووقت البكسل (أي سرعة المسح).
ملاحظة 1: استخدمنا عدسة شيئية Plan Apochromat 20x/NA 0.8 لعملية التحويل الضوئي.
ملحوظة 2: يجب تحديد قدرة الليزر وعدد التكرارات تجريبياً لكل إعداد تجريبي، ويجب التأكد من إتمام التحويل الضوئي لبروتين PCFP من اللون الأخضر إلى الأحمر ضمن منطقة الاهتمام (ROI) بأقل كمية ممكنة من ضوء الليزر لتقليل السمية الضوئية. نوصي ببدء الاختبارات باستخدام قدرة ليزر منخفضة (على سبيل المثال 3%، وهو ما يعادل 0.03 mW في مستوى الشيئية) مع عدد تكرارات منخفض (على سبيل المثال 20)، ثم زيادة قدرة الليزر تدريجياً حتى يتم تحقيق التحويل الضوئي الكامل، وهو ما تم في تجاربنا عند قدرة ليزر بلغت 10% (ما يعادل 0.1 mW في مستوى الشيئية). وفي ظل هذه الظروف، نجت جميع الأجنة المختبرة من خطة المعالجة. ومع ذلك، لاحظنا أن غشاء المح (yolk membrane) حساس لنبضات الليزر ويمكن أن يتضرر بسهولة، مما يؤدي إلى موت الجنين. لهذا السبب، قد تحدث وفيات للأجنة بعد التحويل الضوئي إذا كان موقع النسيج المستهدف قريباً من جسم المح.
- قم بمسح العينة باستخدام z-Stack بواسطة ليزرات بطول موجي 488 nm و561 nm لتصور أي فلورة خضراء متبقية والفلورة الحمراء الناتجة عن التحويل الضوئي لـ PCFP.
ملاحظة 1: بالنسبة للمسح الذي تم بعد التحويل الضوئي، استخدمنا عدسة Plan Apochromat 20x/NA 0.8.
4. إزالة الجنين من الآجاروز
- تخلص من المحلول وأخرج الجنين بعناية من محلول LMA بتركيز 1% باستخدام إبرة أو طرف بلاستيكي أملس.
- احتفظ بالجنين في ماء البيض في الظلام عند درجة حرارة 28.5 °C حتى الوصول إلى المرحلة التطورية المطلوبة.
ملاحظة 1: من المهم أن تستمر الأجنة في نموها في ماء البيض، لا سيما خلال الأيام الأولى من التطور أثناء استطالة جسم الجنين. وبالفعل، تغير بعض الأنسجة/الأعضاء الجنينية مواقعها أثناء التطور، وبالتالي تتطلب توجيهات محددة أثناء عملية الطمر، وهو ما يعتمد على النسيج/العضو المعني ومرحلة التطور المطلوبة للتحليل.
5. إعادة الطمر
- استكمل الخطوات كما هو موضح في النقطة 2.) من هذا البروتوكول.
6. تتبع الأنسجة التي خضعت للتحويل الضوئي في المراحل الجنينية اللاحقة
- مسح المنطقة ذات الاهتمام (z-Stack) باستخدام ليزر بطول موجي 488 nm و 561 nm للإشارات الفلورية الخضراء والحمراء، على التوالي.
ملاحظة 1: بالنسبة للمسح الذي أُجري بعد x ساعة من التحويل الضوئي، استخدمنا عدسة Plan Apochromat 20x/NA 0.8.
ملاحظة 2: بما أن هذا البروتوكول لا يؤثر على التطور الطبيعي للجنين، فمن الممكن مراقبة الجنين المحول ضوئياً في مراحل تطورية لاحقة (وللقيام بذلك، اتبع الخطوات الموضحة في النقاط 4 - 6).
7. النتائج النموذجية
يظهر مثال على مقايسة التحويل الضوئي في الشكل 1. لقد تتبعنا الخلايا البطانية أثناء نمو سمكة الزيبرفيش (لمراجعة التشريح الوعائي لسمكة الزيبرفيش النامية انظر 16). وبناءً على ذلك، استخدمنا خط مراسل لسمكة الزيبرفيش Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 يعبر عن بروتين KikGR داخل النوى البطانية17. تم تربية الأجنة متماثلة الزيجوت ذات التعبير القوي عند 28.5 °C حتى 48 ساعة بعد الإخصاب (hpf). بعد إزالة الغشاء الكوريوني، تم تخدير الأجنة وتثبيتها في LMA مع توجيه الجانب الظهري الأمامي للجنين نحو غطاء الشريحة لتحسين رؤية أوعية الرأس. نستخدم مجهراً بؤرياً مقلوباً (Zeiss LSM 710 Meta) مزوداً بليزر يعمل عند 405 nm و 488 nm و 561 nm، وعدسة شيئية Plan Apochromat 20x/NA 0.8 لإجراء مقايسة التحويل الضوئي والتتبع اللاحق للبروتين الذي تم تحويله ضوئياً. كما يظهر في الشكل 1A، قبل التحويل الضوئي، كان KikGR يُعبر عنه داخل النسيج البطاني وكان قابلاً للكشف فقط كفلورة خضراء باستخدام ليزر Argon بطول موجي 488 nm. ولم تكشف عمليات المسح الضابطة باستخدام ليزر DPSS 561-10 بطول موجي 561 nm للفلورة الحمراء عن أي بروتين KikGR محول ضوئياً قبل عملية التحويل (الشكل 1A). لاحقاً، تم تحويل منطقة الاهتمام (ROI) ضوئياً بالكامل باستخدام ليزر Diode بطول موجي 405 nm (بشدة 10%، و 20 تكراراً)، وتم مسح أوعية الرأس مرة أخرى باستخدام ليزر 488 nm و 561 nm (الشكل 1B). وكما يظهر في الشكل 1B، تحول KikGR الأخضر بالكامل إلى اللون الأحمر داخل منطقة الاهتمام. بعد مقايسة التحويل الضوئي، تمت إزالة الجنين من الأجاروز وتربيته عند 28.5 °C في ماء البيض. وأخيراً، تمت ملاحظة الجنين مرة أخرى بعد 24 ساعة من التحويل الضوئي، أي حوالي 72 hpf، لتتبع الخلايا البطانية المحولة ضوئياً في مراحل لاحقة (الشكل 1C). وبذلك، تم تثبيت الجنين في LMA، وأعيد مسح العينة باستخدام ليزر 488 nm و 561 nm. وكما يظهر في الشكل 1C، لوحظ داخل النسيج البطاني الناشئ من منطقة الاهتمام المحولة ضوئياً وجود بروتينات KikGR المحولة وغير المحولة ضوئياً معاً، وذلك بسبب استقرار بروتين KikGR المحول ضوئياً ذي الفلورة الحمراء وإعادة تخليق بروتين KikGR أخضر جديد غير محول ضوئياً.
الشكل 1. التحويل الضوئي لـ KikGR أثناء نمو سمك الزيبرا. (A,B) تم إجراء تحويل ضوئي لمنطقة محددة من الأوعية الدموية البطانية في الرأس عند 48 hpf في أجنة متحولة جينياً من نوع Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 و(C) تمت ملاحظتها مجدداً بعد 24 ساعة من التحويل الضوئي (حوالي 72 hpf). تظهر الصور فلورية KikGR (باللون الأخضر)، وKikGR المحول ضوئياً (باللون الأحمر)، والقنوات المدمجة. تشير الدوائر المنقطة إلى منطقة الاهتمام (ROI) قبل التحويل الضوئي، وبعده، وبعد 24 ساعة من العملية. الصور عبارة عن مناظر ظهرية لجنين سمك الزيبرا، حيث يكون الطرف الأمامي للأسفل. أشرطة المقياس: 50 μm.
| البروتين (الاختصار) | الإثارة (nm) | الانبعاث (nm) | معامل الانطفاء (EC) | المردود الكمي (QY) | البنية الرباعية | السطوع | التطبيق | المرجع |
| Kaede_G | 508 | 518 | 99 | 0.9 | رباعي القسيمات (tetramer) | 259 | تتبع الخلايا | 2,6 |
| Kaede_R | 572 | 580 | 60 | 0.3 | رباعي القسيمات (tetramer) | 59 | ||
| KikGR_G | 507 | 517 | 54 | 0.7 | رباعي القسيمات (tetramer) | 112 | تتبع الخلايا | 3,6,8-10 |
| KikGR_R | 583 | 593 | 35 | 0.6 | رباعي القسيمات (tetramer) | 68 | ||
| mKikGR_G | 505 | 515 | 49 | 0.7 | أحادي القسيمات (monomer) | 101 | التتبع الديناميكي وصور فائقة الدقة | 13 |
| mKikGR_R | 580 | 591 | 28 | 0.6 | أحادي القسيمات (monomer) | 53 | ||
| EosFP_G | 506 | 516 | 72 | 0.7 | رباعي القسيمات (tetramer) | 150 | تتبع الخلايا | 5,20 |
| EosFP_R | 571 | 581 | 41 | 0.5 | رباعي القسيمات (tetramer) | 67 | ||
| tdEos_G | 506 | 516 | 34 | 0.7 | ثنائي ترادفي (tandem dimer) | 165 | صور فائقة الدقة | 12,14,21 |
| tdEos_R | 569 | 581 | 33 | 0.6 | ثنائي ترادفي (tandem dimer) | 59 | ||
| mEos2_G | 506 | 519 | 56 | 0.7 | أحادي القسيمات (monomer) | 140 | التتبع الديناميكي وصور فائقة الدقة | 11,18 |
| mEos2_R | 573 | 584 | 46 | 0.7 | أحادي القسيمات (monomer) | 90 | ||
| Dendra2_G | 490 | 507 | 45 | 0.5 | أحادي القسيمات (monomer) | 67 | التتبع الديناميكي وصور فائقة الدقة | 4,11 |
| Dendra2_R | 553 | 573 | 35 | 0.55 | أحادي القسيمات (monomer) | 57 |
الجدول I. خصائص البروتينات الفلورية القابلة للتحول الضوئي. يوضح الجدول الاسم الشائع و/أو الاختصار لكل PCFPs، وأطوال موجات ذروة الإثارة (Ex) والانبعاث (Em)، ومعاملات الامتصاص المولية (EC, 10-3 M-1 cm-1 )، والحصيلة الكمية (QY)، والبنية الرابعة ذات الصلة الفسيولوجية، والسطوع النسبي (كنسبة مئوية من EGFP)، والتطبيق، والمراجع. تم اقتباس الجدول من Day and Davidson, 20101.
| PCFP | سلالات أسماك الزيبر المحدثة جينيًا | يرجى تقديم النص المصدر لكي أتمكن من ترجمته إلى اللغة العربية وفقاً للمعايير والتعليمات المذكورة. |
| Kaede | Tg(elavl3:Kaede)rw0130a | مختبر أوكاموتو |
| Tg(EPV.TP1-Mmu.Hbb:Kaede) | ||
| Tg(ins:Kaede) | ||
| Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede) | ||
| Tg(lhx5:Kaede)b1204/+ | ZIRC | |
| Tg(myl7:kaede) | ||
| Tg(olig2:Kaede) | ||
| Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t | زيرك (ZIRC) | |
| Tg(UAS:Kaede)rk8 | ZIRC | |
| Tg(vsx2:Kaede)nns2 | مختبر Higashijima | |
| KikGR | Tg(kdrl:nlsKikGR) | |
| Tg(krt4:NTR-KikGR) | ||
| Tg(myl7:nlsKikGR) | ||
| Tg(sox10:KikGR) | ||
| Tg(UAS:KikGR) | ||
| بروتين EosFP الفلوري | Tg(sox10:EosFP) | |
| Tg(sox10:nlsEosFP) | ||
| Dendra | Tg(-8mpx:Dendra2) | |
| Tg(UAS:Dendra-kras) |
الجدول II. سلالات أسماك الزيبرا المعدلة وراثياً والتي تعبر عن PCFP. البيانات مستمدة من قاعدة بيانات كائن أسماك الزيبرا النموذجي (ZFIN، http://zfin.org/). تم توضيح مدى توفر السلالات في المركز الدولي لموارد أسماك الزيبرا (ZIRC، http://zebrafish.org/zirc/).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في السنوات الأخيرة، تم تطوير نماذج حيوانية معدلة وراثياً للتعبير عن بروتينات قابلة للتحول الضوئي مثل Kaede أو KikGR. وتنمو هذه الحيوانات بشكل طبيعي، مما يشير إلى أن هذه البروتينات ليس لها آثار سامة على التطور الجنيني. وقد أجرى Hatta ومعاونوه أول تقرير حول مقايسة التحول الضوئي لتتبع الخلايا في أجنة الحيوانات عن طريق حقن mRNA أو DNA الذي يشفر Kaede في أجنة أسماك الزيبرا ذات الخلية الواحدة لتحقيق تعبير شامل، أو عن طريق تعبير Kaede و KikGR في الأنسجة العصبية باستخدام نظام Gal4-UAS6. وقد تمكنوا من تصور حركات الخلاي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نتوجه بالشكر للدكتور Ian C. Scott على تزويدنا بسلالة أسماك الزيبرا المعدلة وراثياً Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 من مستشفى الأطفال المرضى (Hospital for Sick Children) في تورونتو، كندا. كما نشكر مرفق المجهر البؤري ومجهر الفوتونين (Max-Delbrueck-Center for Molecular Medicine) والدكتور Zoltan Cseresnyes، على المساعدة التقنية الممتازة والدعم الشامل في التصوير. يحظى S.A.-S. بدعم من زمالة Heisenberg المقدمة من مؤسسة البحوث الألمانية (Deutsche Forschungsgemeinschaft - DFG). كما تم دعم هذا العمل من خلال منحة DFG رقم SE2016/7-1.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| المواد: | |||
| المعدات اللازمة لتربية الأسماك وجمع البيض (راجع Zebrafish Book22 للتفاصيل). | |||
| مجهر ستيريوسكوبي | Leica | Lecia MZ6 Stereomicroscope | مزود بليزر يعمل عند 488 nm |
| مجهر مسح ليزري بؤري | Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | مزود بأجهزة ليزر تعمل عند 488 nm و561 nm و405 nm |
| كتلة تسخين | |||
| زوج من ملاقط Dumont #5 | |||
| طبق زراعة بقاع من غطاء زجاجي | MatTek Corp | Ashland MA USA | |
| رؤوس ماصات Microloader | Eppendorf | ||
| جهاز فورتكس (Vortex) | |||
| إبر | |||
| الكواشف: | |||
| وسط المياه المخصص للبيض | |||
| 60 μg/ml من أملاح البحر Instant Ocean في ddH2O | |||
| وسط E3 | |||
| 5 mM NaCl | |||
| 0.17 mM KCl | |||
| 0.33 mM CaCl2 | |||
| 0.33 mM MgSO4 | |||
| 0.00001% (w/v) ميثيلين الأزرق | |||
| محلول Tricaine المخزن بتركيز 4 mg/ml | |||
| 400 mg Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | ||
| 97.9 ml ddH2O | |||
| 2.1 ml 1M Tris (pH9) | |||
| يُضبط عند pH 7، ويُقسم إلى حصص ويُخزن عند -20 °C | |||
| 1% LMA (أجاروز منخفض درجة حرارة الانصهار، Lonza) | |||
| 1g LMA/100 ml من وسط E3 بتركيز 1X | |||
| يُقسم إلى حصص ويُخزن عند 4 °C |
المراجع
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem. Soc. Rev. 38, 2887-2921 (2009).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 12651-12656 (2002).
- Tsutsui, H., Karasawa, S., Shimizu, H., Nukina, N., Miyawaki, A. Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter. EMBO Rep. 6, 233-238 (2005).
- Gurskaya, N. G., Verkhusha, V. V., Shcheglov, A. S., Staroverov, D. B., Chepurnykh, T. V., Fradkov, A. F., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).
- Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., Oswald, F., Schmitt, F., Rocker, C., Salih, A., Spindler, K. D., Nienhaus, G. U. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15905-15910 (2004).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat. Protoc. 1, 960-967 (2006).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev. Dyn. 236, 1583-1594 (2007).
- Kulesa, P. M., Teddy, J. M., Stark, D. A., Smith, S. E., McLennan, R. Neural crest invasion is a spatially-ordered progression into the head with higher cell proliferation at the migratory front as revealed by the photoactivatable protein, KikGR. Dev. Biol. 316, 275-287 (2008).
- Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC Dev. Biol. 9, 49(2009).
- Griswold, S. L., Sajja, K. C., Jang, C. W., Behringer, R. R. Generation and characterization of iUBC-KikGR photoconvertible transgenic mice for live time-lapse imaging during development. Genesis. 49, 591-598 (2011).
- Baker, S. M., Buckheit, R. W. 3rd, Falk, M. M. Green-to-red photoconvertible fluorescent proteins: tracking cell and protein dynamics on standard wide-field mercury arc-based microscopes. BMC Cell Biol. 11, 15(2010).
- Watanabe, S., Punge, A., Hollopeter, G., Willig, K. I., Hobson, R. J., Davis, M. W., Hell, S. W., Jorgensen, E. M. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944(2008).
- Fang, Z., Takizawa, N., Wilson, K. A., Smith, T. C., Delprato, A., Davidson, M. W., Lambright, D. G., Luna, E. J. The membrane-associated protein, supervillin, accelerates F-actin-dependent rapid integrin recycling and cell motility. Traffic. 11, 782-799 (2010).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Dev. Biol. 230, 278-301 (2001).
- Lazic, S., Scott, I. C. Mef2cb regulates late myocardial cell addition from a second heart field-like population of progenitors in zebrafish. Dev. Biol. 354, 123-133 (2011).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).
- Godinho, L. Live imaging of zebrafish development. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 770-777 (2011).
- Curran, K., Lister, J. A., Kunkel, G. R., Prendergast, A., Parichy, D. M., Raible, D. W. Interplay between Foxd3 and Mitf regulates cell fate plasticity in the zebrafish neural crest. Dev. Biol. 344, 107-118 (2010).
- Nienhaus, G. U., Nienhaus, K., Holzle, A., Ivanchenko, S., Renzi, F., Oswald, F., Wolff, M., Schmitt, F., Rocker, C., Vallone, B., Weidemann, W., Heilker, R., Nar, H., Wiedenmann, J. Photoconvertible fluorescent protein EosFP: biophysical properties and cell biology applications. Photochem. Photobiol. 82, 351-358 (2006).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
