مقالة منهجية

تتبع الخلية عن طريق البروتينات Photoconvertible خلال التنمية اسماك الزرد

DOI:

10.3791/4350

⸱

سبتمبر 28, 2012

 ,  , 
1Max Delbrück Center for Molecular Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم طريقة للتبديل المنشط ضوئيا للبروتينات الفلورية القابلة للتحويل الضوئي (PCFPs) في جنين الزرد الحي ومزيد من التتبع للبروتين المحول ضوئيا في نقاط زمنية محددة أثناء التطور. تسمح هذه المنهجية بمراقبة الأحداث البيولوجية للخلية الكامنة وراء العمليات التنموية المختلفة في كائن فقاري حي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embryogenesis هي عملية ديناميكية يتم دراستها بشكل أفضل باستخدام التقنيات التي تسمح بتوثيق التغيرات التنموية في الجسم الحي. أثبت استخدام بروتينات الفلورسنت المشفرة وراثيا أنه استراتيجية قيمة لتوضيح العمليات المورفوجينية الديناميكية عند حدوثها في الكائن الحي السليم. خلال العقد الماضي ، فتح تطوير بروتينات الفلورسنت القابلة للتنشيط الضوئي والقابلة للتحويل الضوئي إمكانية التحقيق في مصير المجموعات السكانية الفرعية المنفصلة للبروتينات الموسومة1. على عكس البروتينات القابلة للتنشيط الضوئي ، يتم تتبع البروتينات الفلورية القابلة للتحويل الضوئي (PCFPs) بسهولة وتصويرها في حالة انبعاثها الأصلية قبل تحويل الضوء ، مما يسهل تحديد المناطق وتحديدها عن طريق الفحص البصري. يمكن تحويل PCFPs ، مثل Kaede2 و KikGR3 و Dendra4 و EosFP5 ، من الأخضر إلى الأحمر عند التعرض للأشعة فوق البنفسجية أو الضوء الأزرق بسبب تسلسل ثلاثي الببتيد His-Tyr-Gly الذي يشكل كروموفور أخضر يمكن تحويله إلى لون أحمر عن طريق التخلص من β المحفز بالضوء والتمديد اللاحق لنظام مترافقπ 3. تعد PCFPs ومتغيرات أحادية اللون أدوات مفيدة لتتبع الخلايا6-10 ودراسة ديناميكيات البروتين11-14 ، على التوالي. خلال السنوات الأخيرة ، تم التعبير عن PCFPs في نماذج حيوانية مختلفة ، مثل سمك الزرد6 والدجاج7,8 والفأر9,10 لتتبع مصير الخلية. نبلغ هنا عن بروتوكول للتحويل الضوئي الخاص بالخلية ل PCFPs في جنين الزرد الحي ومزيد من التتبع للبروتينات المحولة ضوئيا في مراحل النمو اللاحقة. تسمح هذه المنهجية بدراسة الأحداث البيولوجية للخلية الكامنة وراء التشكل في النموذج الحيواني لسمك الزرد بطريقة خاصة بالنسجة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_title" >1. الحصول على الأجنة لمقايسة التحويل الضوئي

< p class = "jove_content" >عند تهجين أسماك الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن PCFP ، يتم اختيار ألمع الأجنة المتماثلة الزيجوت ، وتنمو عند 28.5 درجة مئوية حتى المرحلة الجنينيةالمرغوبة 15.

ملاحظة 1: سيسمح هذا الاختيار المسبق بمسح الأجنة بطاقة الليزر المنخفضة وبالتالي منع السمية الضوئية والتبييض الضوئي.

ملاحظة 2: نقترح استخدام الضوء منخفض الكثافة عند تصور الأجنة والحفاظ عليها في الظروف المظلمة بسبب الحساسية العالية ل PCFPs ، مثل Kaede و KikGR ، للتعرض للضوء بما في ذلك ضوء النهار.

2. التضمين

  1. في وعاء زجاجي به ماء بيض ، قم بإزالة الأجنة تحت المجهر المجسم باستخدام ملقط.
  2. تخدير الأجنة عن طريق نقل جنين مفصل التآكل إلى 0.16 مجم / مل محلول Tricaine (3-amino benzoic acidethylester ، Sigma-Aldrich) (40 ميكرولتر من محلول مخزون 4 مجم / مل في 1 مل من E3 متوسط 1X).

ملاحظة 1: نقل الأجنة بماصة زجاجية أو طرف مقطوع (P1000) لتقليل مخاطر إتلاف الأجنة.

ملاحظة 2: لا ينبغي أن تتعرض الأجنة الصغيرة المتكللة للهواء أو رفعها إلى واجهة الماء / الهواء ، لأن البويضات تتمزق بسهولة عند تعرضها للإجهاد الميكانيكي.

  1. انقل الجنين المخدر إلى غطاء طبق المزرعة وحافظ على الجنين ضمن أصغر حجم ممكن من الوسط.
  2. انقل الجنين إلى الاغاروز عن طريق سحب الجنين بدرجة حرارة انصهار منخفضة بنسبة 1٪ (LMA ، Lonza) عند 30 درجة مئوية تحتوي على 0.16 مجم / مل من التريكايين ، وضعه على غطاء زجاج طبق ثقافة ذو قاع زجاجي (MatTek Corp. Ashland MA USA). بعد ذلك ، قم بتوجيه الجنين بمساعدة طرف بلاستيكي أملس (على سبيل المثال ، طرف ماصة Microloader مقطوع ، Eppendorf) ، وعندما يتم بلمرة LMA ، قم بتغطية agarose بمحلول Tricaine 0.16 مجم / مل.

ملاحظة 1: قم بإذابة 1٪ LMA عند 60 درجة مئوية والحفاظ على الاغاروز المذاب عند 30 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >3. تحويل الصور
  1. على مجهر متحد البؤر المقلوب المجهز بمصدر ليزر 405 نانومتر و 488 نانومتر و 561 نانومتر ، مثل Zeiss LSM 710 ، تصور العينة عن طريق مسح z-Stack يغطي الهيكل الكامل للعينة ليتم تحويلها وتتبعها لاحقا باستخدام ليزر 488 نانومتر (أي ليزر Ar 30 ميجاوات ، بكثافة 5-7٪ ، كاشف مضبوطة على 493-540 نانومتر) وليزر 561 نانومتر (أي، ليزر 10 ميجاوات DPSS 561 ، بكثافة 7-9٪ ، ضبط الكاشف على 587-651) لمسح الأنسجة / العضو بحثا عن التألق الأخضر والأحمر للبروتينات القابلة للتحويل الضوئي ، على التوالي.

ملاحظة 1: بالنسبة للمسح قبل تحويل الصور ، استخدمنا هدف Plan Apochromat 20x / NA 0.8.

ملاحظة 2: ابحث دائما عن التألق الأحمر قبل التجربة لاستبعاد وجود أي PCFP أحمر تم إنشاؤه عن طريق الخطأ.

  1. حدد أداة السلسلة الزمنية واضبطها على دورتين بدون فاصل زمني (واحدة لمرحلة ما قبل التحويل الضوئي والأخرى لما بعد التحويل).
  2. حدد أداة المناطق وحدد منطقة اهتمام واحدة أو أكثر (ROI) لتحويل الصور.

ملاحظة 1: نوصي أولا بتحديد الدقة التي تتطابق بها المنطقة المحولة فعليا بواسطة ليزر المسح الضوئي في عائد الاستثمار مع عائد الاستثمار المحدد في البرنامج عن طريق قياس مساحة الأنسجة / الخلايا المحولة ضوئيا في الثلاثة (اتجاه xy و z) في عينة ثابتة حيث لا يتوقع حدوث حركة خلية أو بروتين. بالنسبة للإعدادات الموضحة في هذا التطبيق ، تطابق عائد الاستثمار مع المنطقة المحولة ضوئيا بدقة كبيرة ولكن هذا يعتمد على الهدف المستخدم وكمية الليزر المطبقة لتحويل الضوء. يمكن تقليل حجم عائد الاستثمار إلى حجم خلية واحدة اعتمادا على الفتحة العددية للهدف وعامل التكبير وكمية ضوء الليزر المستخدمة في تحويل الصور.

  1. حدد أداة التبييض واضبطها لبدء التبييض بعد المسح الضوئي 1 من 2. استخدمنا ليزر 30 ميجاوات 405 نانومتر لتحويل الصور وتم تحسيننا بعناية للحد الأدنى من ضوء الليزر اللازم لتحويل الضوء الكامل والذي يتم تحقيقه في الغالب عن طريق تغيير شدة ضوء الليزر وتكرارات المسح الضوئي لعائد الاستثمار ووقت البكسل (أي سرعة المسح).

ملاحظة 1: لتحويل الصور ، استخدمنا هدف Plan Apochromat 20x / NA 0.8.

ملاحظة 2: يجب تحديد قوة الليزر وعدد التكرارات تجريبيا لكل إعداد تجريبي ويجب ضمان التحويل الضوئي الكامل من PCFP الأخضر إلى الأحمر ضمن عائد الاستثمار مع الحد الأدنى من الكمية اللازمة من ضوء الليزر لتقليل السمية الضوئية. نوصي ببدء الاختبارات باستخدام طاقة ليزر منخفضة (على سبيل المثال 3٪ ، أي ما يعادل 0.03 ميجاوات في الخطة الموضوعية) جنبا إلى جنب مع أعداد منخفضة من التكرارات (على سبيل المثال 20) ، وبالتالي زيادة طاقة الليزر حتى يتم تحقيق التحويل الضوئي الكامل الذي كان في أيدينا بنسبة 10٪ من طاقة الليزر (المقابلة ل 0.1 ميجاوات في الخطة الموضوعية). في ظل هذه الظروف ، نجت جميع الأجنة التي تم اختبارها من خطة العلاج. ومع ذلك ، لاحظنا أن غشاء الصفار حساس لنبضات الليزر ويمكن أن يتلف بسهولة مما يتسبب في موت الجنين. لهذا السبب ، قد يحدث فتك الجنين بعد التحويل الضوئي إذا كان موضع النسيج المستهدف قريبا من جسم الصفار.

  1. امسح العينة ضوئيا بواسطة z-Stack باستخدام الليزر لمسافة 488 نانومتر و 561 نانومتر لتصور أي لون أخضر متبقي ومضان أحمر محول ضوئيا ل PCFP.

ملاحظة 1: للمسح الضوئي بعد تحويل الصور ، استخدمنا خطة Apochromat 20x / NA 0.8.

< p class = "jove_title" >4. إزالة الجنين من Agarose
  1. تخلص من المحلول وقم بإزالة الجنين بعناية من LMA بنسبة 1٪ بمساعدة إبرة أو طرف بلاستيكي أملس.
  2. الحفاظ على الجنين في ماء البيض في الظلام عند 28.5 درجة مئوية حتى مرحلة النمو المرغوبة.

ملاحظة 1: من المهم أن تستمر الأجنة في نموها في ماء البيض ، خاصة خلال الأيام الأولى من التطور أثناء تمديد الجسم الجنيني. في الواقع ، تغير بعض الأنسجة / الأعضاء الجنينية مواضعها أثناء التطور ، وبالتالي تتطلب توجيهات محددة أثناء التضمين والتي تعتمد على الأنسجة / العضو المعين المعني ومرحلة التحليل التنموية المرغوبة.

5. إعادة التضمين

  1. تابع كما هو الحال في النقطة 2.) من هذا البروتوكول.
< p class = "jove_title" >6. تتبع الأنسجة المحولة ضوئيا في المراحل الجنينية اللاحقة
  1. مسح منطقة الاهتمام (z-Stack) باستخدام الليزر لإشارات الفلورسنت الخضراء والحمراء ، على التوالي.

ملاحظة 1: بالنسبة للمسح الضوئي x ساعات بعد تحويل الصور ، استخدمنا خطة Apochromat 20x / NA 0.8.

ملاحظة 2: نظرا لأن هذا البروتوكول لا يؤثر على التطور الطبيعي للجنين ، فمن الممكن مراقبة الجنين المحول ضوئيا في مراحل لاحقة من التطور (لهذا ، تابع كما هو موضح في النقاط 4-6).

7. النتائج التمثيلية

يظهر مثال على مقايسة التحويل الضوئي في الشكل 1. قمنا بتتبع الخلايا البطانية أثناء تطور الزرد (لمراجعة تشريح الأوعية الدموية لأسماك الزرد النامية انظر16). وفقا لذلك ، استخدمنا خط مراسل أسماك الزرد Tg (kdrl: nlsKikGR) hsc7 يعبر عن KikGR داخل النوى البطانية17. تم رفع الأجنة متماثلة اللواقح والتعبير الزاهي عند 28.5 درجة مئوية حتى 48 ساعة بعد الإخصاب (HPF). عند إزالة الأجنة ، تم تخدير الأجنة ودمجها في LMA لوضع الجانب الأمامي الظهري للجنين باتجاه زجاج الغطاء من أجل تصور أفضل لأوعية الرأس. نستخدم مجهر متحد البؤر مقلوب (Zeiss LSM 710 Meta) مزودا بالليزر الذي يعمل عند 405 نانومتر و 488 نانومتر و 561 نانومتر ، وهدف Plan Apochromat 20x / NA 0.8 لمقايسة التحويل الضوئي وتتبع البروتين المحول ضوئيا. كما هو موضح في الشكل 1 أ ، قبل التحويل الضوئي ، تم التعبير عن KikGR داخل الأنسجة البطانية ولم يكن من الممكن اكتشافه إلا على أنه مضان أخضر باستخدام ليزر الأرجون 488 نانومتر. لم تكتشف عمليات المسح الضابط باستخدام ليزر 561 نانومتر DPSS 561-10 للتألق الأحمر أي KikGR محول ضوئيا قبل التحويل الضوئي (الشكل 1 أ). بعد ذلك ، تم تحويل عائد الاستثمار بالكامل باستخدام ليزر 405 نانومتر (بكثافة 10٪ ، 20 تكرارا) وتم مسح الأوعية الرئيسية مرة أخرى باستخدام ليزر 488 نانومتر و 561 نانومتر (الشكل 1 ب). كما هو موضح في الشكل 1 ب ، تحول KikGR الأخضر تماما إلى اللون الأحمر داخل عائد الاستثمار. بعد فحص التحويل الضوئي ، تمت إزالة الجنين من الاغاروز ورفعه عند 28.5 درجة مئوية في ماء البيض. أخيرا ، لوحظ الجنين مرة أخرى بعد 24 ساعة من التحويل الضوئي ، حوالي 72 hpf ، لتتبع الخلايا البطانية المحولة ضوئيا في مراحل لاحقة (الشكل 1 ج). وهكذا ، تم تضمين الجنين في LMA ، وأعيد مسح العينة باستخدام ليزر 488 نانومتر و 561 نانومتر. كما هو موضح في الشكل 1 ج ، داخل الأنسجة البطانية الناشئة عن عائد الاستثمار المحول ضوئيا ، لوحظت كل من بروتينات KikGR غير المحولة والمحولة ضوئيا بسبب استقرار KikGR الفلوري الأحمر المحول ضوئيا وإعادة تخليق KikGR الأخضر الجديد غير المحول ضوئيا.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >figure-protocol-1
الشكل 1. التحويل الضوئي ل KikGR أثناء تطور أسماك الزرد. (أ ، ب) تم تحويل منطقة معينة من الأوعية الدموية للرأس البطاني بمعدل 48 حصانا في الأجنة المعدلة وراثيا Tg (kdrl: nlsKikGR) hsc7 و (C) لوحظت مرة أخرى بعد 24 ساعة من التحويل الضوئي (حوالي 72 HPF). يتم عرض تألق KikGR (الأخضر) ، KikGR المحول ضوئيا (الأحمر) والقنوات المدمجة. تظهر الدوائر المنقطة عائد الاستثمار قبل وبعد وبعد تحويل الصور على مدار 24 ساعة. الصور عبارة عن مناظر ظهرية لجنين الزرد ، من الأمام إلى الأسفل. قضبان المقياس: 50 ميكرومتر. البروتين (اختصار) السابق (نانومتر) Em (نانومتر) إي سي كيو واي الهيكل الرباعي وضح تطبيق الرقم المرجعي Kaede_G 508 ريال 518 99 0.9 تترامير 259 ح. تتبع الخلية 2،6 Kaede_R 572 580 ريال 60 0.3 تترامير 59 KikGR_G 507 ريال 517 54 0.7 تترامير 112 تتبع الخلية 3،6،8-10 KikGR_R 583 593 35 0.6 تترامير 68 mKikGR_G 505 ريال 515 ريال 49 0.7 مونومر 101 ريال التتبع الديناميكي صور فائقة الدقة 13 mKikGR_R 580 ريال 591 28 0.6 مونومر 53 EosFP_G 506 ريال 516 72 0.7 تترامير 150 حيا تتبع الخلية 5,20 EosFP_R 571 ريال 581 ريال 41 0.5 تترامير 67 tdEos_G 506 ريال 516 34 0.7 ثنائي ترادفي 165 صور فائقة الدقة 12،14،21 tdEos_R 569 ريال 581 ريال 33 0.6 ثنائي ترادفي 59 mEos2_G 506 ريال 519 56 0.7 مونومر 140 حيا التتبع الديناميكي صور فائقة الدقة 11,18 mEos2_R 573 م 584 46 0.7 مونومر 90 Dendra2_G 490 ريال 507 ريال 45 0.5 مونومر 67 التتبع الديناميكي صور فائقة الدقة 4,11 Dendra2_R 553 573 م 35 0.55 مونومر 57 < p class = "jove_content" > الجدول I. خصائص البروتينات الفلورية القابلة للتحويل الضوئي. جنبا إلى جنب مع الاسم الشائع و / أو الاختصار لكل PCFPs ، يتم عرض الأطوال الموجية لذروة الإثارة (Ex) والانبعاث (Em) ، ومعاملات الانقراض المولي (EC ، 10-3 M-1 cm-1) ، والعائد الكمي (QY) ، والهيكل الرباعي ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية ، والسطوع النسبي (كنسبة مئوية من EGFP) ، والتطبيق ، والمراجع موضحة في الجدول. جدول مقتبس من داي وديفيدسون ، 20101. PCFP الخطوط المعدلة وراثيا لسمك الزرد مصدر Kaede Tg (elavl3: Kaede) rw0130a مختبر أوكاموتو Tg(EPV. TP1-Mmu.Hbb: Kaede)   Tg (الداخلات: Kaede)   Tg (isl1: Gal4-VP16،14xUAS: Kaede)   Tg (lhx5: Kaede) b1204 /+ زيرك Tg (myl7: kaede)   Tg (olig2: Kaede)   Tg (UAS-E1b: Kaede) s1999t زيرك Tg (UAS: Kaede) rk8 زيرك Tg(vsx2:Kaede)nns2 مختبر هيغاشيجيما KikGR Tg (kdrl: nlsKikGR)   Tg (krt4: NTR-KikGR)   Tg (myl7: nlsKikGR)   Tg (sox10: KikGR)   Tg (UAS: KikGR)   EosFP Tg (sox10: EosFP)   Tg (sox10: nlsEosFP)   Dendra Tg (-8 ميجا بكسل: Dendra2)   Tg (UAS: Dendra-kras)   < p class = "jove_content" > الجدول الثاني. الخطوط المعدلة وراثيا لأسماك الزرد التي تعبر عن PCFPs. البيانات التي تم الحصول عليها في قاعدة بيانات الكائنات الحية النموذجية لأسماك الزرد (ZFIN ، http://zfin.org/). يشار إلى توافر الخطوط في المركز الدولي لموارد أسماك الزرد (ZIRC ، http://zebrafish.org/zirc/).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في السنوات الأخيرة ، تم إنشاء نماذج حيوانية معدلة وراثيا للتعبير عن البروتينات القابلة للتحويل الضوئي مثل Kaede أو KikGR. تتطور هذه بشكل طبيعي ، مما يشير إلى أن هذه البروتينات ليس لها آثار سامة على التطور الجنيني. تم إجراء التقرير الأول حول مقايسة التحويل الضوئي لتتبع الخلايا في الأجنة الحيوانية من قبل حتا والمتعاونين عنه عن طريق حقن mRNA أو الحمض النووي المشفر Kaede في أجنة الزرد أحادية الخلية للتعبير في كل مكان ، أو عن طريق التعبير عن Kaede و KikGR في الأنسجة العصبية باستخدام نظام Gal4-UAS6. كانوا قادرين على...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور إيان سي سكوت على التفضل بتزوير خط Tg (kdrl: nlsKikGR) hsc7 في مستشفى الأطفال المرضى ، تورنتو ، كندا. نشكر المرفق الأساسي للفحص المجهري متحد البؤر و 2 الفوتون (مركز ماكس ديلبروك للطب الجزيئي) والدكتور. Zoltan Cseresnyes ، للمساعدة الفنية الممتازة ودعم التصوير الشامل. س. س. مدعومة بزمالة هايزنبرغ من المدرسة الألمانية (DFG). تم دعم هذا العمل من خلال منحة DFG SE2016 / 7-1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المواد: < / strong>
مجهر مجسمLeicaLecia MZ6 مجهر مجسممزود بالليزر يعمل بالليزر 488 نانومتر
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤرZeiss ZeissLSM 710NLO مزود بأشعة ليزر تعمل عند 488 نانومتر و 561 نانومتر و 405 نانومتر
كتلة تسخين
زوج من ملقط
طبق ثقافة ذو قاع زجاجيMatTek CorpAshland MA الولايات المتحدة الأمريكية
Microloader نصائح الماصةEppendorf
Vortex
الإبر
الكواشف: < / strong>
بيض ماء متوسط< / em>
60 & mu; جم / مل أملاح البحر المحيطية الفورية في ddH 2 < / sub > O
5 ملي كلوريد
0.17 ملي كلوريد الصوديوم
ملي كلوريد الكالسيوم < الفرعي >2< / الفرعي >
0.33 ملي مولار MgSO4< / sub>
0.00001٪ (وزن / حجم) الميثيلين الأزرق
4 مجم / مل محلول مخزون التريكايين < / م >
400 مجم تريكايين (3-أمينو بنزويك حمض إيثيلستر)سيجما ألدريتش
97.9 مل ddH 2< / sub>O
2.1 مل 1M Tris (pH9) ضبط
عند درجة الحموضة 7 ، aliquot وتخزين -20 & درجة ؛ C
1٪ LMA (درجة حرارة انصهار منخفضة ، Lonza) < / em >
1g LMA / 100 مل E3 متوسط 1X
Aliquot وتخزينه في 4 درجات ؛ ج
< td colspan = "4" > المعدات اللازمة لتربية الأسماك وجمع البيض (انظر كتاب الزرد 22 للحصول على التفاصيل).Dumont # 5 < td colspan = "4" >< > E3 متوسط < / م >الصوديوم0.33

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem. Soc. Rev. 38, 2887-2921 (2009).
  2. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 12651-12656 (2002).
  3. Tsutsui, H., Karasawa, S., Shimizu, H., Nukina, N., Miyawaki, A. Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter. EMBO Rep. 6, 233-238 (2005).
  4. Gurskaya, N. G., Verkhusha, V. V., Shcheglov, A. S., Staroverov, D. B., Chepurnykh, T. V., Fradkov, A. F., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).
  5. Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., Oswald, F., Schmitt, F., Rocker, C., Salih, A., Spindler, K. D., Nienhaus, G. U. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15905-15910 (2004).
  6. Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat. Protoc. 1, 960-967 (2006).
  7. Stark, D. A., Kulesa, P. M. An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev. Dyn. 236, 1583-1594 (2007).
  8. Kulesa, P. M., Teddy, J. M., Stark, D. A., Smith, S. E., McLennan, R. Neural crest invasion is a spatially-ordered progression into the head with higher cell proliferation at the migratory front as revealed by the photoactivatable protein, KikGR. Dev. Biol. 316, 275-287 (2008).
  9. Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC Dev. Biol. 9, 49(2009).
  10. Griswold, S. L., Sajja, K. C., Jang, C. W., Behringer, R. R. Generation and characterization of iUBC-KikGR photoconvertible transgenic mice for live time-lapse imaging during development. Genesis. 49, 591-598 (2011).
  11. Baker, S. M., Buckheit, R. W. 3rd, Falk, M. M. Green-to-red photoconvertible fluorescent proteins: tracking cell and protein dynamics on standard wide-field mercury arc-based microscopes. BMC Cell Biol. 11, 15(2010).
  12. Watanabe, S., Punge, A., Hollopeter, G., Willig, K. I., Hobson, R. J., Davis, M. W., Hell, S. W., Jorgensen, E. M. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).
  13. Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944(2008).
  14. Fang, Z., Takizawa, N., Wilson, K. A., Smith, T. C., Delprato, A., Davidson, M. W., Lambright, D. G., Luna, E. J. The membrane-associated protein, supervillin, accelerates F-actin-dependent rapid integrin recycling and cell motility. Traffic. 11, 782-799 (2010).
  15. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  16. Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Dev. Biol. 230, 278-301 (2001).
  17. Lazic, S., Scott, I. C. Mef2cb regulates late myocardial cell addition from a second heart field-like population of progenitors in zebrafish. Dev. Biol. 354, 123-133 (2011).
  18. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).
  19. Godinho, L. Live imaging of zebrafish development. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 770-777 (2011).
  20. Curran, K., Lister, J. A., Kunkel, G. R., Prendergast, A., Parichy, D. M., Raible, D. W. Interplay between Foxd3 and Mitf regulates cell fate plasticity in the zebrafish neural crest. Dev. Biol. 344, 107-118 (2010).
  21. Nienhaus, G. U., Nienhaus, K., Holzle, A., Ivanchenko, S., Renzi, F., Oswald, F., Wolff, M., Schmitt, F., Rocker, C., Vallone, B., Weidemann, W., Heilker, R., Nar, H., Wiedenmann, J. Photoconvertible fluorescent protein EosFP: biophysical properties and cell biology applications. Photochem. Photobiol. 82, 351-358 (2006).
  22. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Confocal MicroscopyPhoto ConversionFluorescent ProteinsTissue Specific ExpressionLow Melting Temperature AgaroseEgg Water MaintenanceEndothelial Cell Tracking

مقالات ذات صلة