مقالة منهجية

1 F O أتباز إعداد الحويصلة وتقنية لإجراء التسجيلات المشبك التصحيح من أغشية الحويصلة Submitochondrial

DOI:

10.3791/4394

⸱

مايو 4, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Yale University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ووصف طريقة لعزل الحويصلات submitochondrial المخصب في F1FO ATP مجمعات سينسيز من دماغ الفئران. هذه الحويصلات تسمح دراسة النشاط من مجمع أتباز F1FO والتشكيل وذلك باستخدام أسلوب التصحيح تسجيل المشبك.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتشارك الميتوكوندريا في العديد من الوظائف الخلوية الهامة بما في ذلك التمثيل الغذائي، والبقاء على قيد الحياة 1، والتنمية، والكالسيوم مما يشير 2. ترتبط اثنين من وظائف الميتوكوندريا الأكثر أهمية بالنسبة للكفاءة الإنتاج من ATP، والعملة الطاقة للخلية، من خلال الفسفرة التأكسدية، والوساطة من إشارات لموت الخلية المبرمج 3.

الإنزيم المسؤول في المقام الأول لإنتاج ATP هو سينسيز ATP-F1FO، وتسمى أيضا ATP سينسيز 4-5. في السنوات الأخيرة، تلقت دور الميتوكوندريا في موت الخلايا أفكارك ونخرية اهتماما كبيرا. في موت الخلايا أفكارك، BCL-2 البروتينات الأسرة مثل باكس دخول الغشاء الخارجي الميتوكوندريا، oligomerize وpermeabilize الغشاء الخارجي، والإفراج عن العوامل الموالية لأفكارك في العصارة الخلوية 6. في موت الخلايا نخرية الكلاسيكية، مثل تلك التي ينتجها نقص التروية أو التحفيز الزائدة في الخلايا العصبية، تأه، وزيادة سيئة التنظيم في مصفوفة الكالسيوم يساهم في افتتاح مسام الغشاء الداخلي، والميتوكوندريا نفاذية المسام الانتقال أو MPTP. هذا depolarizes الغشاء الداخلي ويسبب تحولات ناضح، والمساهمة في تمزق غشاء الخارجي، وإطلاق سراح من العوامل الموالية لأفكارك، وضعف التمثيل الغذائي. العديد من البروتينات بما في ذلك بي سي إل XL 7 التفاعل مع F1FO ATP سينسيز، تحوير وظيفتها. BCL-XL يتفاعل مباشرة مع الوحيدات بيتا من F1FO ATP سينسيز، وهذا التفاعل يقلل من تصرف تسرب داخل F1FOATPasecomplex، وزيادة صافي النقل من H + من قبل F1FO خلال F1FO ATPase النشاط 8 وبالتالي زيادة كفاءة الميتوكوندريا. لدراسة النشاط والتشكيل من سينسيز ATP، ونحن عزل من القوارض الدماغ الحويصلات submitochondrial (SMVs) التي تحتوي على F1FO أتباز. وSMVs الإبقاء على السلامة الهيكلية والوظيفية للF1FO أتباز كما هو مبين في علويان وآخرون. هنا، نحن تصف طريقةالتي استخدمناها بنجاح لعزل SMVs من دماغ الفئران، ونحن ترسيم تقنية المشبك التصحيح لتحليل نشاط قناة (أيون تصرف تسرب) من SMVs.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الدماغ الميتوكوندريا العزلة (مقتبس من براون MR آخرون. 9)

  1. التضحية الفئران باستخدام أساليب وافقت عليها اللجنة استخدام المؤسسات ورعاية الحيوان (IACUC).
  2. قطع رأس الحيوان عن طريق قطع الرأس، وقطع الجلد وفضح الجمجمة.
  3. فتح الجمجمة بلطف عن طريق قطع مع مقص أو مقراض. إزالة الدماغ.
  4. اللحم المفروم ناعما الدماغ من دون المخيخ في العزلة عازلة (انظر الجدول 1) وتحويلها إلى 5 مل زجاج / تفلون الخالط (انظر قائمة المعدات).
  5. التجانس الأنسجة بلطف 10 مرات (أي فقاعات)، حوالي 5 دقائق.
  6. أجهزة الطرد المركزي لعينة في 1،500 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي.
  7. حفظ طاف (الميتوكوندريا وsynaptosomes) وتجاهل بيليه (المواد النووية والحطام الخلية). الطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي.
  8. نبذطاف وإعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولتر من الاحتياطي العزلة. تعطيل synaptosomes مع سفينة تمزيق الخلايا (انظر قائمة المعدات). تطبيق الضغط من 1،200 رطل لمدة 10 دقيقة، تليها إزالة الضغط السريع.
  9. طبقة الخليط على Ficoll التدرجات (انظر الجدول 2)، ومكان في SW-50.1 الدوار وأجهزة الطرد المركزي في 126،500 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في نابذة فائقة السرعة (انظر قائمة المعدات). بيليه هو تنقية الميتوكوندريا، وطبقة بين كثافات مختلفة من Ficoll هو synaptosomes undisrupted.
  10. غسل بيليه بواسطة الطرد المركزي في العزلة عازلة في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي.

2. Submitochondrial الحويصلات (SMV) العزلة (مقتبس من تشان وآخرون. 10)

  1. اعادة تعليق الميتوكوندريا في 200 ميكرولتر العازلة عزل جنبا إلى جنب مع حجم مساو من 1٪ ديجيتونين والسماح للجلوس على الجليد لمدة 15 دقيقة.
  2. إضافة المزيد من العزلة بوفإيه وأجهزة الطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي. القيام بذلك مرتين.
  3. اعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر العازلة عزل وإضافة 2 ميكرولتر من 10٪ Lubrol PX (C12E9). خلط والسماح للجلوس على الجليد لمدة 15 دقيقة.
  4. خليط طبقة عازلة على العزلة، مكان في SW-50.1 الدوار وأجهزة الطرد المركزي في 182،000 × غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  5. غسل النهائي بيليه بواسطة الطرد المركزي في جهاز للطرد المركزي المنضدي في العزلة عازلة في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.

3. تسجيل الكهربية

  1. يتضمن الكهربية تلاعب نموذجي مكبر للصوت، وجهاز كمبيوتر PC مجهزة Digidata 1440A تحويل واجهة التناظرية إلى الرقمية بالتعاون مع pClamp10.0 البرمجيات، والمتلاعبين، المجهر، جدول العزلة الاهتزاز، قفص فاراداي.
  2. تندس البورسليكات أنابيب زجاجية الشعرية إلى يلهب / براون مجتذب micropipette نموذج P-87. هو الأمثل برنامج ماصة مجتذب إلىتوليد ماصات مع المقاومة بين 80-100 MΩ.
  3. توضع SMVs في حل داخل الخلايا الفسيولوجية (يضاف ATP في الوقت المناسب أثناء التسجيل) (الجدول 3). تمتلئ ماصات المشبك التصحيح مع نفس الحل (لا ATP). يتم إجراء التسجيلات من خلال تشكيل ختم جيجا أوم على SMVs في درجة حرارة الغرفة. الحويصلات هي تصور بواسطة المجهر المرحلة على النقيض مع نيكون أو زايس مجهر مقلوب.
  4. يتم الحفاظ على غشاء المحتملة في الفولتية التي تتراوح بين -100 بالسيارات إلى + 100 بالسيارات لفترات من 10 ثانية. يتم تصفيتها التسجيلات في 5 كيلو هرتز باستخدام الدوائر مكبر للصوت. مستوى الضجيج الكهربائي أو غير محددة الضالة من أقل من 1 باسكال تكون مرغوبة للتسجيل ناجحة.
  5. ويتم تحليل البيانات مع Clampfit 10.0 البرمجيات على سبيل المثال لتحديد التردد والسعة من الأحداث قناة واحدة. يتم تحديد الاعتماد التيار الكهربائي من خلال التآمر علاقة الجهد الحالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوة الأولى من بروتوكول لدينا يسمح لعزل الميتوكوندريا تنقيته كما هو موضح من قبل لطخة غربية في الشكل 1. في الشكل 2 يظهر مثال على الدماغ المستمدة submitochondrial حويصلة تسجيل التصحيح. باستخدام التكوين التصحيح من الداخل إلى الخارج ونحن لشرح نشاط قناة عن طريق التضمين ATP. عنصر التحكم (CTL) تسجيل (يسار) ويظهر نشاط قناة متعدد تصرف مع تصرف الذروة من 600 PS في المتوسط. الذي انخفض فور إضافة 1 ملم ATP إلى الحمام. التأثير الكلي للاعبي التنس المحترفين هو ل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفت وسائل تمكين هنا عزلة الميتوكوندريا نقية في نهاية الخطوة 1 والحويصلات submitochondrial (SMVs) بعد الخطوة 2 من الدماغ كله دون تمييز من خلية phenotypes.SMVspurified بواسطة هذه الطريقة هي مجانية أساسا من التلوث بواسطة العضيات التحت خلوية أخرى كما هو مبين في الشكل (1) والعمل السابق لدينا (علويان KN وآخرون. 8) والمحافظة على سلامتها الهيكلية والوظيفية قبل التجميد. بعد تجميد والذوبان، عزل الميتوكوندريا أو تستخدم SMVs للتسجيلات وفحوصات البيوكيميائي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مطحنة مناديل Potter-Elvehjem مع PTFEPestleKrackeler Scientific، Inc.1-7725T-5
جهاز طرد مركزي Eppendorf 5424 Eppendorf5424 000.410
4639 سفينة تعطيل الخليةParr Instrument Company4639
FicollSigma-AldrichF5415
أنابيب الطرد المركزي من البولي كربوناتBeckman CoulterP20314
SW-50.1 الدوار Beckman Coulter
L8-70M أجهزة الطرد المركزي الفائقةبيكمان كولتر
ديجيتونينسيجما ألدريتشD5628
لوبرول PX (C12E9) كالبيوكيم205534
أكسوباتش 200B أدوات محورية
Digidata 1440A الجهاز
pClamp10.0الجهاز
مناورأداة Sutter
زجاج البورسليكات الشعريةأدوات الدقة1308325
مشتعل / براون مجتذب ماصة دقيقة نموذج P-87أداة Sutter
الجزيئيالجزيئي العالمية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
  2. Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).
  3. Lemasters, J. J. Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism. J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).
  4. Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit. Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).
  5. Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits. Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).
  6. Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).
  7. Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis. Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).
  8. Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).
  9. Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
  10. Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities. J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).
  11. Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. Mitochondrial ATP Synthasomes. J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ATP

مقالات ذات صلة