الخلوي الجماعي: بروتوكول لضبط اليومية وعينات الخلايا تشغيل عداد الكريات الشامل على CyTOF

ملخص

يتم وصف الخطوات الضرورية لضبط اليومية والاستفادة المثلى من أداء عداد الكريات الشامل CyTOF. وتناقش التعليقات على إعداد العينات ومعدل التدفق الأمثل

الملخص

في السنوات الأخيرة، وتحليل السريع للخلايا واحدة وعادة أجريت باستخدام التدفق الخلوي والأجسام المضادة التي تحمل علامات fluorescently. ومع ذلك فقد حد مسألة التداخل الطيفي للانبعاثات fluorophore عدد من التحقيقات في وقت واحد. في المقابل، فإن كتلة CyTOF جديدة عداد الكريات من قبل الأزواج العلوم DVS السائل نظام إدخال وحيدة الخلية إلى ¹ ICP-MS. وبدلا من fluorophores، تقترن البوليمرات التي تحتوي على نظائر المعادن مخلبية عالي التخصيب إلى الأجسام المضادة أو تحقيقات أخرى محددة. ^2-5 بسبب نقاء المعدن والقرار الجماعي للعداد الكريات الشامل، وليس هناك "تداخل الأطياف" من النظائر المجاورة، وبالتالي لا حاجة للمصفوفات التعويض. بالإضافة إلى ذلك، ونظرا لاستخدام المعادن اللانثينيدات، وليس هناك خلفية البيولوجية وبالتالي لا يعادل تألق ذاتي. مع نافذة تمتد الشامل الكتلة الذرية 103-203، نظريا يمكن تمييز ما يصل الى 100 في وقت واحد التسميات. حاليا، أكثر من 35 قنوات متاحة باستخدام الكواشف مخلبية المتاحة من العلوم DVS، مما يسمح للتشريح لم يسبق لها مثيل من الملف المناعية من العينات. ^6-7

عيوب لكتلة الخلوي تتضمن شرط صارمة لنظائر المعادن منفصلة في التحقيق (لا يعادل مبعثر إلى الأمام أو الجانب)، وحقيقة أنها هي تقنية المدمرة (أي إمكانية لاستعادة الفرز). التكوين الحالي للعداد الكريات الشامل لديها أيضا معدل نقل خلية من خلايا فقط ~ 25٪، مما يتطلب إدخال عدد أكبر من الخلايا.

الأداء اليومي الأمثل للعداد الكريات الشامل يتطلب العديد من الخطوات. الهدف الأساسي من التحسين هو تعظيم قوة إشارة المقاسة من نظائر المعادن المطلوب (M) مع التقليل من تشكيل أكاسيد (M +16) التي من شأنها أن تقلل من شدة إشارة M وتتداخل مع أي إشارة المرجوة في M +16. الخطوة الأولى هي عملية الاحماء الجهاز بحيث ساخنة، وأنا مستقرةوقد أنشئت CP البلازما. الثانية، يجب أن يكون الأمثل للإعدادات الحالية والمكياج معدل تدفق الغاز على أساس يومي. خلال جمع العينات، ويقتصر هذا الحدث من قبل خلية الحد الأقصى لمعدل الكفاءة للكشف عن وسرعة المعالجة إلى 1000 خلية / ثانية. ومع ذلك، وهذا يتوقف على نوعية العينة، حدث تباطؤ معدل الخلية (300-500 خلية / ثانية) وعادة ما يكون من المرغوب فيه السماح أفضل قرار بين الأحداث الخلايا، وبالتالي تحقيق أقصى قدر من singlets سليمة أكثر من الحلل والحطام. وأخيرا، وتنظيف كافية للآلة في نهاية اليوم يساعد على التقليل من إشارة الخلفية بسبب معدنية مجانية.

البروتوكول

يجب أن تكون ثابتة جميع العينات الخلية لCyTOF وpermeabilized. وهذا يتيح قدر أكبر من دخول intercalator DNA التي تحتوي على الإيريديوم، ويمنع أيضا تحلل الخلايا خلال غسل الماء MilliQ والخطوات إعادة تعليق على الفور من قبل عن طريق الحقن في عداد الكريات الشامل.

1. بدء قداس للعداد الكريات

1. فتح برنامج حاسوبي CyTOF. حدد إعداد الصك. على علامة التبويب بطاقة كيج، انتقل إلى الزاوية اليمنى السفلى وفوق سخان "ON" الزر. تشغيل المدفأة على الأقل 15 دقيقة قبل الوقت المطلوب لإتاحة الوقت الكافي ....

النتائج

وينبغي بعد بروتوكول أعلاه إنجاز أربعة أمور. أولا، سوف يسمح كافية الاحماء الوقت للعداد الكريات الشامل إنتاج الساخنة، والبلازما المستقرة اللازمة لإشارة الأمثل والحد الأدنى من تشكيل أكسيد. والثانية، وغسل كافية من المياه مع عداد الكريات الشامل MilliQ وDVS الحل اغسل (الشكل 9) يساعد على التقليل من امتصاص المعادن مستويات للأنابيب وأجزاء أخرى من الجهاز، مما يساعد على تقليل الخلفية أثناء اقتناء العينة (الشكل 8). وسوف يساعد أيضا إزالة أي الخلايا التي قد تتع.......

المناقشة

على مدى العقود القليلة الماضية، كان التدفق الخلوي مضان طريقة العمود الفقري لتحليل الخلايا واحدة، سواء من حيث التعبير والسطح في المقايسات الفنية. ومع ذلك فقد حد لقضايا التداخل الطيفي لصبغات الفلورسنت عدد علامات في وقت واحد. في حين تم الإبلاغ عن التجارب باستخدام أكثر من 12 علامات في وقت واحد، ومقدار التعويضات اللازمة يجعل هذا من الصعب من الناحية الفنية.

بدلا من fluorophores، رائدها الشامل الخلوي العلوم DVS يستخدم ا.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
CyTOF TM الشامل عداد الكريات	DVS العلوم
غسل الحل	DVS العلوم	201071	الهيدروفلوريك حمض 0.05٪ في الماء
ضبط الحل	DVS العلوم	201072	0.5 جزء في المليون لا، خدمات العملاء، السل، TM، الأشعة تحت الحمراء، تتبع حامض النيتريك
الخرز البوليسترين الاتحاد الأوروبي التي تحتوي على	DVS العلوم	201073	يحتوي الطبيعية وفرة النظائر الاتحاد الأوروبي؛ الخرز المقدمة في حوالي 1 مليون / مل
متعددة اللانثينيدات التي تحتوي على (لا / العلاقات العامة / السل / تيم / لو) - الخرز البوليسترين	DVS العلوم	لم المتاحة تجاريا	يحتوي الطبيعية وفرة النظائر من اللانثينيدات المدرجة
حمض النيتريك (مركزة)	فيشر العلمية	A467-500	أوبتيما تتبع معدن نقي ICP-MS الصف
البوليسترين جولة القاع أنبوب مع الخلية مصفاة متوسطة 5mL	BD	352235	تستخدم لتصفية عينات الخلايا قبل الحقن
وضع القواعد وJect tuberkulin حقنة-1ML	هينكه ساس وولف	4010-200V0	خالية من السيليكون، واللثي خالية
وضع القواعد وJect حقنة-3 مل	هينكه ساس وولف	4010.000V0	خالية من السيليكون، واللثي خالية
MilliQ المياه			18 MΩ المياه النقية، ويجب ألا تكون مخزنة في الزجاج أو زجاجات من البلاستيك التي تم غسلها بالمنظفات التجارية (بسبب مستويات عالية من الباريوم الحاضر).
الذكرranox	سيغما الدريخ	Z273236	حمض المنظفات
غاز الأرجون	PRAXAIR	AR-T 5.0UH	99.999٪ فائق النقاء