مقالة منهجية

Microgavage من يرقات اسماك الزرد

17.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/4434

⸱

فبراير 20, 2013

 , 
1Department of Cell and Molecular Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

في هذه المقالة

ملخص

نقدم طريقة مبتكرة للتغذية القسرية الدقيقة (microgavage) ليرقات سمك الزيبرا باستخدام معدات الحقن المجهري للأجنة والمجاهر الستيريوسكوبية القياسية. ونبين أن التغذية القسرية الدقيقة هي تقنية آمنة وفعالة ومفيدة لإيصال كميات محددة من مواد متنوعة بشكل خاص إلى التجويف المعوي ليرقات سمك الزيبرا.

الملخص

برزت سمكة الزيبرا (zebrafish) ككائن نموذجي قوي لدراسة تطور الأمعاء1-5، ووظائفها6-11، والأمراض12-16، والتفاعلات بين المضيف والميكروبات17-25. غالبًا ما تتطلب النهج التجريبية لدراسة بيولوجيا الأمعاء إدخال مواد مختارة in vivo إلى تجويف الأمعاء. وفي نموذج يرقات سمكة الزيبرا، يتم تحقيق ذلك عادةً عن طريق غمر الأسماك في محلول من المادة المختارة، أو عن طريق الحقن عبر جدار البطن. وباستخدام طريقة الغمر، يصعب مراقبة أو التحكم بدقة في مسار أو توقيت إيصال المادة إلى الأمعاء. لهذا السبب، يمكن أن يتسبب التعرض عن طريق الغمر في سمية غير مقصودة وتأثيرات أخرى على الأنسجة خارج المعوية، مما يحد من النطاق المحتمل لكميات المواد التي يمكن إيصالها إلى الأمعاء. كما أن كمية المادة التي يتم ابتلاعها أثناء التعرض بالغمر يمكن أن تختلف بشكل كبير بين اليرقات الفردية26. وعلى الرغم من أن هذه المشكلات لا تظهر أثناء الحقن المباشر عبر جدار البطن، إلا أن الحقن السليم أمر صعب ويتسبب في تلف الأنسجة الذي قد يؤثر على النتائج التجريبية. نحن نقدم طريقة للتغذية الأنبوبية الدقيقة (microgavage) ليرقات سمكة الزيبرا. والهدف من هذه الطريقة هو توفير وسيلة آمنة وفعالة ومتسقة لإيصال المواد مباشرة إلى تجويف الأمعاء الأمامية في يرقات سمكة الزيبرا بتوقيت مضبوط. تعتمد التغذية الأنبوبية الدقيقة على معدات الحقن المجهري للأجنة والمجهر الستيريوتكسي القياسية الشائعة في معظم المختبرات التي تجري أبحاثًا على سمكة الزيبرا. وبمجرد وضع الأسماك بشكل صحيح في ميثيل السليلوز، يمكن إجراء التغذية الأنبوبية بسرعة بمعدل يتراوح تقريبًا بين 7-10 أسماك/ دقيقة، وتقترب نسبة البقاء على قيد الحياة بعد العملية من 100% اعتمادًا على المادة المستخدمة. كما نبين أن التغذية الأنبوبية الدقيقة يمكن أن تسمح بتحميل تجويف الأمعاء بتركيزات عالية من المواد التي تكون قاتلة للأسماك عند التعرض لها عن طريق الغمر. ولإثبات فائدة هذه الطريقة، نقدم اختبار التغذية الأنبوبية الدقيقة باستخدام الديكستران الفلوري الذي يمكن استخدامه لقياس الانتقال من تجويف الأمعاء إلى المساحات خارج المعوية. يمكن استخدام هذا الاختبار للتحقق من التنفيذ السليم لإجراء التغذية الأنبوبية الدقيقة، كما يوفر اختبارًا جديدًا لسمكة الزيبرا لفحص سلامة الحاجز الظهاري المعوي تحت ظروف تجريبية مختلفة (على سبيل المثال التلاعب الجيني، أو العلاج الدوائي، أو التعرض لعوامل بيئية). علاوة على ذلك، نوضح كيف يمكن استخدام التغذية الأنبوبية لتقييم حركة الأمعاء عن طريق إعطاء كرات مجهرية فلورية ومراقبة انتقالها اللاحق. يمكن تطبيق التغذية الأنبوبية الدقيقة لإيصال مواد متنوعة مثل الكائنات الحية الدقيقة الحية، والعوامل/السموم الميكروبية المفرزة، والعوامل الدوائية، والمجسات الفسيولوجية. وبهذه الإمكانات، تمتلك طريقة التغذية الأنبوبية الدقيقة ليرقات سمكة الزيبرا القدرة على تعزيز نطاق واسع من المجالات البحثية التي تستخدم نظام سمكة الزيبرا النموذجي.

البروتوكول

نستخدم البروتوكولات المنشورة لتربية وصيانة أسماك الزيبرا القياسية للحصول على اليرقات من أجل التغذية القسرية الدقيقة (microgavage)27. نعتمد بشكل أساسي على التكاثر الطبيعي لإكثار الأسماك، ويتم الاحتفاظ بها في دورة ضوئية تبلغ 14 ساعة ضوء/10 ساعات ظلام. لقد تم تحسين هذا البروتوكول لعملية التغذية القسرية الدقيقة ليرقات أسماك الزيبرا في اليوم السادس إلى السابع بعد الإخصاب (dpf). ونتوقع أن تكون هذه الطرق قابلة للتطبيق عموماً على مراحل نمو أصغر أو أكبر مع إجراء تعديلات طفيفة. وما لم يُذكر خلاف ذلك، فقد استخدمنا سلالة أسماك الزيبرا البرية TL في اليوم السادس بعد الإخصاب، ولم يتم إطعام الأسماك. أُجريت جميع التجارب في مياه النظام التي تم الحصول عليها من منشأة تربية أسماك الزيبرا التقليدية لدينا؛ ومع ذلك، يمكن استخدام أي وسط مناسب لأسماك الزيبرا (مثل وسط الأجنة أو وسط أسماك الزيبرا الغنوتوبايوتيك (GZM)28). وفي هذا البروتوكول، نشير إلى "أوساط أسماك الزيبرا" لتمثيل الوسط الذي يختاره المستخدم.

1. تحضير ميثيل السليلوز، وقالب التغذية القسرية، وتصنيع إبر التغذية القسرية الدقيقة

قبل التجربة بيوم واحد أو في وقت مبكر من يوم إجراء التجربة، قم بتحضير ميثيل السليلوز، وقالب الآجاروز لتثبيت اليرقات، وإبر التغذية القسرية الدقيقة.

  1. أذب 3 g من الميثيل سليلوز (methylcellulose) في 100 ml من الماء المعقم منزوع الأيونات أو وسط تربية أسماك الزيبرا (حسب طبيعة تطبيقك) لتحضير محلول بتركيز 3%. أضف قضيب تحريك مغناطيسي إلى الزجاجة، وسخّن الماء حتى يقترب من درجة الغليان، ثم ضع الزجاجة على لوح تحريك تحت حرارة عالية. وأثناء التحريك، رش الميثيل سليلوز ببطء لضمان عدم تكتله. قلل سرعة التحريك ودرجة حرارة لوح التحريك تدريجياً على مدار اليوم حتى يصل المحلول إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. استمر في التحريك ببطء طوال الليل حتى يذوب الميثيل سليلوز تماماً. يمكن تخزين المحلول في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر في وعاء محكم الإغلاق.
  3. حضّر قالباً من هلام الأغاروز (agarose gel) بتركيز 3% في طبق بتري بقطر 10 cm باستخدام قالب بلاستيكي (Adaptive Science Tools, TU-1) وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. أغلق الطبق بفيلم البارافيلم (parafilm) واحفظه في درجة حرارة 4 °C حتى وقت الاستخدام لمنع الجفاف. ارفع درجة حرارته إلى درجة حرارة الغرفة أو 28 °C قبل بدء التجربة. يمكن بشكل عام إعادة استخدام قوالب الأغاروز عدة مرات.
  4. اسحب عدة إبر للتغذية القسرية (gavage needles) باستخدام شعيرات زجاجية من البوروسيليكات، وجهاز سحب الماصات الدقيقة Flaming Brown المزود بفتيلة تسخين ذات مجرى واسع (FT330B). البرامج التي نستخدمها لتصنيع الإبر هي كما يلي:
نوع الإبرةالضغطالحرارةالسحبالسرعةالوقت
إبرة جنينية50031510050200
إبرة تغذية أنبوبية50031512575200

بما أن الخيوط قد تختلف بين الأجهزة، يجب تسجيل وقت التصاعد (وقت التسخين النشط). يتراوح وقت التصاعد لدينا بين 8.57-8.79 ms لهذا البرنامج. ينتج هذا البرنامج إبراً أقصر وأكثر سمكاً من إبر الحقن المجهري التقليدية (الشكل 1). قد تتطلب هذه الإعدادات تحسيناً عند استخدامها في أجهزة سحب الماصات الدقيقة المختلفة.

2. قص وتعبئة ومعايرة إبر التغذية القسرية الدقيقة

ملاحظة*: يعد قص الإبرة خطوة حاسمة في هذا البروتوكول. كما أن طرق تحميل الإبرة ومعايرتها تختلف باختلاف نوع وحدة الحقن المجهري المستخدمة. لقد قمنا بتحسين هذا البروتوكول باستخدام محاقن Drummond II المجهرية، ولكننا نتوقع أن يكون هذا البروتوكول قابلاً للتطبيق أيضاً على أدوات الحقن المجهري الأخرى مع إجراء تعديلات طفيفة. ونظراً لأن منصات الحقن وسحابات الإبر تختلف من مختبر لآخر، فمن المهم قياس/معايرة أحجام الحقن (راجع القسم 2.8).

  1. يتم قص الإبر تحت مجهر ستيريوسكوبي. نستخدم مجهر ستيريوسكوبي Leica S6E مضبوطاً على تكبير 2.5x. عند هذا الضبط، يكون طول مقياس العدسة العينية المكون من 100 قسم 2 mm.
  2. قم بمحاذاة طرف الإبرة مع نهاية مسطرة المقياس (علامة القسم 100)، ثم قص الإبرة باستخدام ملقط ساعات دقيق الطرف عند مسافة ~1 mm تقريباً من الطرف (علامة القسم 48-50) (الشكل 1A).
  3. يجب أن يكون قطر الإبرة ~27-30 μm وتكون غير حادة. افحص أطراف الإبر عند تكبير 100x. تؤدي الإبر الحادة أو المسننة إلى احتمالية أكبر لحدوث تلف أثناء عملية التغذية القسرية (gavage) ويجب تجنبها إن أمكن.
  4. بدلاً من ذلك، وعند توفرها، يمكن استخدام جهاز الصهر الدقيق (microforge) للتحكم بشكل أفضل في نقطة قص الإبرة ولصقل أطراف الإبرة بالنار لإزالة الحواف الحادة (الشكل 1B).
  5. قم بتحضير محلول التغذية القسرية. بالنسبة لمعظم التطبيقات، نقوم بتحضير المحلول مع إضافة تخفيف بنسبة 1:10 من محلول phenol red بتركيز 0.5% في محلول Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) (شركة Sigma-Aldrich) لضمان إمكانية رؤية المحلول تحت المجهر الستيريوسكوبي لمراقبة الأداء السليم للمحقن الدقيق ووضع محلول التغذية القسرية في البصلة الأمامية. لم يتم تقييم أصباغ تحميل أخرى غير phenol red ولكن يمكن استخدامها.
  6. قم بتجهيز إبرة التغذية القسرية عن طريق ملئها بالزيت المعدني باستخدام سرنجة سعة 1 ml مع إبرة 25G 5/8. ثبت الإبرة على وحدة الحقن الدقيق Nanoject II.
  7. قم بتغطية طبق بتري بلاستيكي سعة 10 cm بورق البارافيلم لتوفير سطح مسطح ومقاوم للماء، وضع كمية ~2 μl من محلول التغذية القسرية على البارافيلم. قم بملء إبرة التغذية القسرية يدوياً من الخلف مع الحرص على تجنب تكوين فقاعات هوائية في الزيت المعدني.
  8. لاختبار وظيفة المحقن الدقيق ومعايرة حجم القذف، املأ طبق بتري سعة 3 cm بالزيت المعدني واحقن في الزيت حتى تصبح القطرات متسقة في الحجم. قم بقياس قطر القطرات باستخدام المقياس أو وظيفة القياس في المجهر الستيريوسكوبي، إن وجدت. احسب حجم القطرة (المعادلة: V=4/3πr3). يتم رسم اتساق الحجم بين الإبر (الشكل 1C).
  9. اشطف طرف الإبرة عن طريق الغمر المتكرر في وسط نظيف لأسماك الزيبرا لإزالة بقايا الزيت المعدني قبل بدء التغذية القسرية. الزيت المعدني كثيف جداً وقد يسبب تلفاً في الأنسجة الطلائية إذا لم يتم غسله من طرف الإبرة.

3. تخدير ويرقات سمك الزيبرا وتثبيتها وإجراء التغذية الأنبوبية لها

  1. قم بتدفئة قالب الأجاروز في درجة حرارة الغرفة أو عند 28 °C قبل بدء التجربة.
  2. قم بتجهيز قالب الأجاروز لعملية التغذية القسرية عن طريق تغطية 3 أخاديد بمادة ميثيل سليلوز بتركيز 3%. استخدم كمية من الميثيل سليلوز تكفي لتغطية الأخاديد وتثبيت الأسماك، ولكن لا تكون قليلة لدرجة تجعلها تجف بسرعة.
  3. في طبق نظيف مكون من 6 آبار، قم بتوزيع يرقات سمك الزيبرفيش الخاصة بكل مجموعة تجريبية في آبار منفصلة، بحيث يحتوي كل بئر على 3.5-4.0 ml من وسط نمو سمك الزيبرفيش.
  4. قم بتحضير محلول تريكاين بتركيز 3x (بنسبة 0.05% w/v) في وسط نمو سمك الزيبرفيش المناسب. قم بتخدير الأسماك بئرًا تلو الآخر عن طريق خلط حجم مساوٍ من التريكاين 3x في البئر الذي يحتوي على اليرقات للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1.5x (بنسبة 0.025%)، ثم حرك البئر بلطف.
  5. بمجرد توقف أسماك الزيبرفيش عن الحركة، انقلها من البئر باستخدام ماصة باستور زجاجية واسعة الفوهة ومضخة ماصة، وضعها واحدة تلو الأخرى فوق الميثيل سليلوز بحيث تكون رؤوسها عند زاوية 45° للأخدود وذيولها ممتدة نحو زاوية 90° للأخدود. اضغط عليها بلطف داخل الميثيل سليلوز باستخدام مسبار تشريح غير حاد لتثبيت وضعيتها.
  6. قم بضبط جهاز الحقن المجهري Nanoject II بحيث تكون الإبرة مائلة بزاوية ضحلة تكون موازية تقريبًا لزاوية 45° لقالب الأجاروز. تأكد من أن نطاق تمدد الإبرة سيكون كافيًا للوصول إلى ما بعد قاع بئر القالب لتقليل عدد التعديلات المطلوبة بمجرد وضع الأسماك.
  7. اضبط وحدة الحقن المجهري لإطلاق 4.6 nl (كحد أقصى) على إعداد الحقن البطيء (23 nl/sec). عند هذه الإعدادات، يجب أن يملأ الحجم المحقون البصلة الأمامية للأمعاء فقط دون أن يتسرب من المريء أو المذرق. يمكن استخدام أحجام أصغر اعتمادًا على الغرض من التجربة.
  8. استخدم يدًا واحدة لإجراء تعديلات طفيفة على الطبق الذي يحتوي على اليرقات المثبتة، بينما تستخدم اليد الأخرى في الوقت ذاته للتحكم في ذراع تشغيل وحدة الحقن المجهري.
  9. قم بتوجيه إبرة التغذية القسرية بلطف إلى فم الأسماك المخدرة، وعبر المريء، واضغط قليلاً على المصرة المريئية لإدخال طرف إبرة التغذية القسرية داخل البصلة المعوية الأمامية مباشرة (Figure 2، الخطوتان 1-2، a&b).
  10. بمجرد وصول الإبرة إلى داخل البصلة الأمامية، اضغط بلطف على دواسة القدم أو زر الحقن لإعطاء المادة. اسحب الإبرة بسرعة وسلاسة مع الحرص على عدم إطلاق كميات كبيرة من المادة في المريء (Figure 2، الخطوتان 3-4).
  11. بعد التغذية القسرية، استخدم ماصة باستور زجاجية واسعة الفوهة ومضخة ماصة لنقل يرقات سمك الزيبرفيش بلطف إلى وسط نمو جديد. املأ الماصة بالماء حتى مسافة 1 inch تقريبًا فوق انحناء العنق، واصنع جيبًا مائيًا صغيرًا في الميثيل سليلوز بجانب رأس اليرقة لتحريرها، وارفع الرأس بلطف إلى فوهة الماصة، ثم اسحب اليرقة من الميثيل سليلوز. أفرغ السمكة وجميع المياه من الماصة بلطف في طبق يحتوي على وسط نمو جديد.
  12. اشطف اليرقات في وسط نمو جديد عن طريق السحب والطرد بالماصة بلطف أو غمرها بالوسط عدة مرات لإزالة الميثيل سليلوز وإفاقة اليرقات من التخدير. انقل اليرقات إلى طبق بتري أو طبق مكون من 6 آبار حتى يحين موعد التصوير والتحليل اللاحقين.

4. مقايسة الديكستران لاختبار سلامة التغذية القسرية وسلامة الحاجز المعوي

يمكن استخدام التغذية القسرية الدقيقة (Microgavage) لإيصال مواد متنوعة إلى الأمعاء. وعلى سبيل المثال، نقدم أدناه بروتوكولاً للتغذية القسرية لـ 10 kD dextran مقترن بـ Texas Red لتحليل سلامة الحاجز الظهاري المعوي. يوجد مساران محتملان على الأقل للنفاذية بين الخلايا، مع وجود اختلافات في الانتقائية بناءً على شحنة المذابات وحجمها، ويُطلق عليهما مسارات "المسام" (pore) أو "التسرب" (leak)29. وبما أن هذا الـ dextran كبير جداً بحيث لا يمكن امتصاصه عبر الظهارة المعوية من خلال مسار المسام بين الخلايا (حد الحجم ~4Å، بينما 10kD dextran= ~23Å)9,30-32، فإنه يجب أن يبقى داخل اللمعة إذا كانت سلامة الحاجز المعوي غير متضررة. وعلى الرغم من إمكانية نقل 10 kD dextran عبر مسار التسرب بين الخلايا، إلا أن هذا المسار يتميز بسعة أقل وحركية أبطأ29,33، وبالتالي، فمن غير المرجح أن يحدث ذلك ضمن الإطار الزمني لهذا الفحص. ويتم توفير معالجة "ضابطة موجبة" لتعطيل سلامة الحاجز من خلال إدراج EDTA الذي يعمل على تفكيك الموصلات المحكمة الظهارية34,35. يمكن استخدام فحص التغذية القسرية بـ dextran هذا كاختبار لمراقبة الجودة لإثبات أن إجراء التغذية القسرية يتم تنفيذه بأمان دون إلحاق ضرر غير مقصود بالأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا الفحص لاختبار سلامة الحاجز المعوي كدالة للنمط الجيني أو المعالجة.

  1. قم بتحضير محاليل التغذية القسرية (gavage) التالية: 1% dextran/1x PBS/0.05% phenol red، و1% dextran/20 mM EDTA/1x PBS/0.05% phenol red (كعينة ضابطة موجبة). يُخزن المخزون المركز من 5% dextran في ddH2O على شكل حصص قدرها 50 μl عند درجة حرارة -20 °C لتقليل عدد دورات التجميد والإذابة. كما يتم تحضير محلول تغذية قسرية وهمي يتكون من 1x PBS/0.05% phenol red.
    ضابط موجب (EDTA)بدون EDTA
 المخزونالنهائيعامل التخفيف10 μl10 μl
EDTA, pH 8200 mM20 mM1010
ديكستران5%1%522
PBS10x1x1011
أحمر الفينول0.50%0.05%1011
   المجموع الفرعي:54
   ddH2O:56
   الإجمالي:1010
  1. استخدم البروتوكول الموضح في القسم 3 لإجراء التغذية القسرية (gavage) لمجموعات تتكون من 10-20 يرقة من أسماك zebrafish لكل حالة تجريبية. كرر هذه العملية على مجموعات مكررة مرتين أو ثلاث مرات إذا أمكن.
  2. بعد التغذية القسرية، استعد اليرقات من التخدير واتركها تسبح بحرية في وسط غذائي جديد.
  3. في غضون 18-20 دقيقة بعد التغذية القسرية، أعد تخدير اليرقات كما في الخطوة 3.3. ضع اليرقات في مادة methylcellulose بتركيز 3% فوق كتلة من agarose بتركيز 3% (يقلل هذا من توهج الخلفية أثناء التصوير).
  4. صوّر اليرقات باستخدام مجهر ستيريو فلوري (على سبيل المثال، Leica M205C) ومجموعة مرشحات Texas Red عند تكبير يظهر اليرقات من المخطم وصولاً إلى المنطقة الواقعة خلف نهاية المذرق مباشرة.
  5. التقط جميع الصور باستخدام نفس إعدادات التعريض الضوئي بحيث يمكن قياسها ومقارنتها لاحقاً. سيكون الفلورسنت مكثفاً في لمعة الأمعاء لجميع اليرقات التي حُقنت بالدكستران، ولكن يتم تقييم وظيفة الحاجز من خلال مستوى الدكستران الذي يظهر في الأنسجة خارج الأمعاء (أي الجذع والأوعية الدموية) (الشكل 5). اضبط التعريض الضوئي على إعدادات تسمح برؤية الفلورسنت في الجذع حتى لو أدى ذلك إلى تعريض زائد لفلورسنت اللمعة.
  6. نسق أوقات التغذية القسرية بحيث تقضي كل مجموعة تقريباً نفس القدر من الوقت في التعافي بعد التغذية القسرية، ويتم تصويرها في نفس الوقت التقريبي بعد التغذية القسرية. في هذه التجربة، تستغرق كل مجموعة حوالي 1 ساعة لإكمالها من قبل شخص واحد. يتم تخدير الأسماك في غضون 18-20 دقيقة بعد التغذية القسرية، ويستغرق التصوير حوالي 1-2 دقيقة لكل سمكة.
  7. استخدم برنامجاً لتحليل الصور مثل ImageJ لقياس متوسط كثافة الفلورسنت النسبية في منطقة من الجذع تعلو الأمعاء مباشرة. قم بتنظيم هذه القيم عن طريق طرح قياس الخلفية المأخوذ من منطقة في الصورة خارج جسم السمكة.
  8. مثّل البيانات الناتجة عن تحليل الصور بيانياً وحللها باستخدام برنامج GraphPad Prism أو برنامج إحصائي مشابه.

5. مقايسة الكريات المجهرية الفلورية لاختبار حركية الأمعاء

يوفر التغذية القسرية (Gavage) تحكماً معززاً في توقيت وكمية المواد التي يتم إيصالها إلى الأمعاء، مما يجعلها طريقة بديلة مثالية لدراسات الحركية المعوية. وتشمل التقنيات المنشورة سابقاً لقياس الحركية المعوية في يرقات zebrafish الملاحظة المباشرة لانقباضات وموجات الأمعاء باستخدام المجهر1,21,36، أو تغذية اليرقات بطعام ممزوج بكريات بوليسترين مجهرية فلورية صفراء مخضرة26. وفي بعض الدراسات، تم تعزيز القياس الكمي لأنماط الحركية المعوية عن طريق غمر اليرقات في أوساط تحتوي على صبغة غذائية37 أو تقنية متخصصة في تحليل الفيديو تسمى الخرائط الزمانية المكانية (spatiotemporal mapping)38,39. ونقدم هنا دراسة إثبات مفهوم لإظهار إمكانية إجراء تغذية قسرية لكريات مجهرية فلورية في البصلة الأمامية للأمعاء، وأنه يمكن استخدام تتبع حركة الكريات المجهرية لتقييم الحركية المعوية (الشكل 6). ويكمن الفرق الأساسي بين هذه الطريقة ونهج Field وزملائه26 في أن الكريات يتم إدخالها بمفردها ولا يمكن دمجها في الطعام بسبب القيود المتعلقة بقطر إبرة التغذية القسرية.

  1. يتم الحفاظ على يرقات سمك الزيبرا في أطباق سعة 10 cm مع 35 ml من الوسط الغذائي حتى إجراء التجربة في اليوم السابع بعد الإخصاب (7 dpf). يبدأ تغذية اليرقات مرة واحدة كل صباح بدءاً من اليوم الخامس بعد الإخصاب (5 dpf) باستخدام ~0.6 mg من الغذاء المسحوق (نظام غذائي لليرقات، كما تم وصفه سابقاً40؛ ويتم تقديمه باستخدام حلقة تلقيح معقمة بقطر 1 mm).
  2. رج زجاجة الكرات الدقيقة من البوليسترين Fluoresbrite YG 2.0 μm (~2.5% معلق مائي) برفق لخلط المعلق. ضع قطرة من الزجاجة على غشاء البارافيلم حتى يمكن قياس حجم محدد بواسطة الماصة.
  3. في أنبوب إيبندورف، يتم طرد الكرات مركزياً بسرعة منخفضة في جهاز طرد مركزي دقيق مكتبي، ثم يُزال السائل الطافي ويُستبدل بـ 1x PBS بنفس الحجم الأصلي. تكرر هذه العملية لغسل الكرات الدقيقة مرتين.
  4. قم بتحضير معلق للتغذية القسرية يحتوي على 0.25% من الكرات الدقيقة (تخفيف 1:10 من المعلق الأساسي)/1x PBS/0.05% phenol red. يوجد ~2.6x103 من الكرات الدقيقة في حجم التغذية القسرية البالغ 4.6 nl الذي يتم تقديمه لكل يرقة.
  5. استخدم البروتوكول الوارد في القسم 3 لإجراء التغذية القسرية للعدد المطلوب من اليرقات. تتميز الكرات الدقيقة بأنها طافية نوعاً ما؛ لذا يجب إجراء التغذية القسرية بأسرع ما يمكن لضمان أقصى قدر من تجانس المعلق.
  6. في هذه التجربة، تم إجراء التغذية القسرية لـ 15 يرقة ثم الحفاظ عليها في آبار منفردة في طبق يحتوي على 12 بئراً بعد التعافي من التخدير من أجل تتبع العبور في كل فرد. ومع ذلك، يمكن أيضاً إجراء التغذية القسرية لمجموعات أكبر وتقييم العبور كعينة سكانية بدلاً من التقييم الفردي. يرجى الرجوع إلى Field et al. للاطلاع على الممارسات القياسية26.
  7. يتم تقييم الحركية المعوية من خلال تحديد الموقع الأكثر منقارية (أو أمامية) للكرات الدقيقة الفلورية في اليرقات الحية في أوقات مختلفة باستخدام مجهر ستيريو فلوري. يتم تخدير اليرقات لفترة وجيزة في 1x (0.017%) tricaine، وتحديد مناطق موقع الكرات الدقيقة أو التقاط صور لتقييمها لاحقاً.
  8. يتم رسم بياني ومقارنة النسبة المئوية لإجمالي اليرقات التي تحتوي على كرات دقيقة في منطقة معوية معينة بمرور الوقت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عند تنفيذ عملية التغذية القسرية (gavage) بشكل صحيح، يجب أن تكون المادة التي تم إيصالها محتواة بالكامل داخل الأمعاء الأمامية مع وجود القليل من المواد المتبقية أو عدم وجودها في المريء (الشكل 3). يجب اختيار حجم إيصال يمكن استيعابه داخل البصلة الأمامية ولا يتسرب عبر المجمع أو المريء. إذا كان حجم المادة أو ضغط الإيصال مرتفعًا جدًا، فقد تؤدي القوة الفيزيائية للتغذية القسرية إلى تلف الظهارة أو حدوث تسرب من خلالها. كما قد تؤدي إلى دفع أو تغيير المكونات الأخرى للوسط اللمعي (على سبيل المثال، الصفراء أو ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نصف في هذا العمل بروتوكولاً جديداً للإيصال المباشر للمواد إلى أمعاء يرقات سمك الزيبرفيش عن طريق التغذية الأنبوبية المجهرية (microgavage). هناك عدة خطوات حاسمة طوال الإجراء يجب وضعها في الاعتبار؛ أولاً، يجب أن تكون يرقات الزيبرفيش في حالة صحية جيدة قبل تجربة التغذية الأنبوبية لمنع حدوث وفيات غير مرتبطة بالعلاج. وهناك عامل مهم آخر وهو جودة إبرة التغذية، حيث يعد قص الإبرة في الموضع المناسب دون إحداث حواف حادة ومسننة أحد أصعب أجزاء البروتوكول. ويمكن استخدام جهاز صهر مجهري للماصات الدقيقة (micropipette microforge) لتحقيق كسر ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نتوجه بالشكر إلى أعضاء مختبر Rawls على مقترحاتهم المفيدة بشأن المحتوى، وإلى الدكتور Alan Fanning على المناقشات القيمة حول نفاذية حجم الموصلات المحكمة وطرق تعطيلها. كما نشكر الدكتور Michael Chua والدكتور Neal Kramarcy من مرفق Michael Hooker للمجاهر على الدعم المقدم باستخدام المجهر البؤري. وقد حظي هذا العمل بدعم من منح المعاهد الوطنية للصحة T32 DK007737-15 (للمتدرب J.L.C.)، وF32 DK094592 (لـ J.L.C.)، وR01 DK081426 (لـ J.F.R.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
فينكيل (تريكاين ميثان سلفونات)Argent Chemical LaboratoriesMS-222تخدير اليرقات
محلول أحمر الفينولSigma-AldrichP0290-100 ml0.5% في DPBS، مختبر لزراعة الخلايا
زيت معدني، خفيف، أبيض (عالي النقاء)AmrescoJ217-500 mlلإعادة ملء الإبرة واختبار الحجم
TxRed-Dextran، وزن جزيئي 10,000 MW، قابل للتثبيت باللايسينInvitrogen/ Molecular ProbesD-1863عالق بنسبة 1% في 1x PBS/أحمر الفينول
FM4-64FXInvitrogen/ Molecular ProbesF34653مخزون بتركيز 5 mM في الماء
ميثيل السليلوزMP Biochemicals0215549590
شعيرات زجاجية من البوروسيليكاتDrummond Scientific3-000-203-G/Xالقطر الخارجي 1.14 mm، القطر الداخلي 0.53 mm، الطول 3.5 in
قالب بلاستيكي لصنع القوالبAdaptive Science ToolsTU-1
وحدة الحقن المجهري Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204
سحب الماصات المجهرية باللهب، خيط بعرض مجرى 3.0 mmSutter Instrument Co.P-97, FT330Bتصنيع الإبر
ملقط طالب Dumont #5Fine Science Tools91150-200.1 x 0.06 mm، لقص الإبر
مقياس العينية، 5 mm - 100 قسمLeica10394771لقص الإبر
جهاز الصهر المجهري (Microforge)NarishigeMF-900لقص الإبر وصقلها بالنار
إبرة حقنة Tuberculin SlipTipBecton Dickinson3096261 ml، إبرة 25G 5/8
كرات مجهرية Fluoresbrite YG (2.0 μm)Polysciences, Inc.18338تحليل حركية الأمعاء
مجهر تشريحيLeicaS6Eإجراء التغذية الأنبوبية (Gavage)
مجهر ستيريو فلوريLeicaM205Cاختبار حاجز الديكستران
مجهر بؤري (Confocal)ZeissLSM510تصوير الديكستران في الدورة الدموية

المراجع

  1. Kuhlman, J., Eisen, J. S. Genetic screen for mutations affecting development and function of the enteric nervous system. Dev. Dyn. 236, 118-127 (2007).
  2. Pack, M., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
  3. Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Dev. Biol. 255, 12-29 (2003).
  4. Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mech. Dev. 122, 157-173 (2005).
  5. Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Dev. Biol. 286, 114-135 (2005).
  6. Hama, K., et al. In vivo imaging of zebrafish digestive organ function using multiple quenched fluorescent reporters. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 445-453 (2009).
  7. Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev. Biol. 360, 276-285 (2011).
  8. Rich, A. A new high-content model system for studies of gastrointestinal transit: the zebrafish. Neurogastroenterol Motil. 21, 225-228 (2009).
  9. Bagnat, M., Cheung, I. D., Mostov, K. E., Stainier, D. Y. Genetic control of single lumen formation in the zebrafish gut. Nat. Cell Biol. 9, 954-960 (2007).
  10. Bagnat, M., et al. Cse1l is a negative regulator of CFTR-dependent fluid secretion. Curr. Biol. 20, 1840-1845 (2010).
  11. Shepherd, I., Eisen, J. Development of the zebrafish enteric nervous system. Methods Cell Biol. 101, 143-160 (2011).
  12. Brugman, S., et al. Oxazolone-induced enterocolitis in zebrafish depends on the composition of the intestinal microbiota. Gastroenterology. 137, 1757-1767 (2009).
  13. Oehlers, S. H., et al. The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish. Dis. Model Mech. 4, 832-841 (2011).
  14. Oehlers, S. H., et al. A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents. Dev Dyn. 240, 288-298 (2011).
  15. Faro, A., Boj, S. F., Clevers, H. Fishing for intestinal cancer models: unraveling gastrointestinal homeostasis and tumorigenesis in zebrafish. Zebrafish. 6, 361-376 (2009).
  16. Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: a feasibility study. Inflamm. Bowel Dis. 16, 1162-1172 (2010).
  17. Kanther, M., et al. Microbial colonization induces dynamic temporal and spatial patterns of NF-kappaB activation in the zebrafish digestive tract. Gastroenterology. , (2011).
  18. Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4596-4601 (2004).
  19. Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Goodman, A. L., Trent, C. M., Gordon, J. I. In vivo imaging and genetic analysis link bacterial motility and symbiosis in the zebrafish gut. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7622-7627 (2007).
  20. Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).
  21. Bates, J. M., et al. Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation. Dev. Biol. 297, 374-386 (2006).
  22. Cheesman, S. E., Guillemin, K. We know you are in there: conversing with the indigenous gut microbiota. Res Microbiol. 158, 2-9 (2007).
  23. Bates, J. M., Akerlund, J., Mittge, E., Guillemin, K. Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota. Cell Host Microbe. 2, 371-382 (2007).
  24. Camp, J. G., Jazwa, A. L., Trent, C. M., Rawls, J. F. Intronic cis-regulatory modules mediate tissue-specific and microbial control of angptl4/fiaf transcription. PLoS Genetics. , In Press (2012).
  25. Cheesman, S. E., Neal, J. T., Mittge, E., Seredick, B. M., Guillemin, K. Epithelial cell proliferation in the developing zebrafish intestine is regulated by the Wnt pathway and microbial signaling via Myd88. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4570-4577 (2011).
  26. Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish. Neurogastroenterol. Motil. 21, 304-312 (2009).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book. , 4 edn, University of Oregon Press. (2000).
  28. Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nat. Protoc. 3, 1862-1875 (2008).
  29. Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: a dynamic duo. Annu. Rev. Physiol. 73, 283-309 (2011).
  30. Van Itallie, C. M., et al. The density of small tight junction pores varies among cell types and is increased by expression of claudin-2. J. Cell. Sci. 121, 298-305 (2008).
  31. Van Itallie, C. M., Anderson, J. M. Measuring size-dependent permeability of the tight junction using PEG profiling. Methods Mol. Biol. 762, 1-11 (2011).
  32. Watson, C. J., Rowland, M., Warhurst, G. Functional modeling of tight junctions in intestinal cell monolayers using polyethylene glycol oligomers. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, 388-397 (2001).
  33. Rodgers, L. S., Fanning, A. S. Regulation of epithelial permeability by the actin cytoskeleton. Cytoskeleton (Hoboken). 68, 653-660 (2011).
  34. Gonzalez-Mariscal, L., Chavez de Ramirez, B., Cereijido, M. Tight junction formation in cultured epithelial cells (MDCK). J. Membr. Biol. 86, 113-125 (1985).
  35. Palant, C. E., Duffey, M. E., Mookerjee, B. K., Ho, S., Bentzel, C. J. Ca2+ regulation of tight-junction permeability and structure in Necturus gallbladder. Am. J. Physiol. 245, C203-C212 (1983).
  36. Holmberg, A., Schwerte, T., Pelster, B., Holmgren, S. Ontogeny of the gut motility control system in zebrafish Danio rerio embryos and larvae. J. Exp. Biol. 207, 4085-4094 (2004).
  37. Rich, A., et al. Kit-like immunoreactivity in the zebrafish gastrointestinal tract reveals putative. 236, 903-911 (2007).
  38. Holmberg, A., Olsson, C., Hennig, G. W. TTX-sensitive and TTX-insensitive control of spontaneous gut motility in the developing zebrafish (Danio rerio) larvae. J. Exp. Biol. 210, 1084-1091 (2007).
  39. Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J. Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
  40. Flynn, E. J. 3rd, Trent, C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio. J. Lipid Res. 50, 1641-1652 (2009).
  41. Clifton, J. D., et al. Identification of novel inhibitors of dietary lipid absorption using zebrafish. PLoS One. 5, e12386(2010).
  42. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
  43. Berghmans, S., Hunt, J., Roach, A., Goldsmith, P. Zebrafish offer the potential for a primary screen to identify a wide variety of potential anticonvulsants. Epilepsy Res. 75, 18-28 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة