نقدم طريقة مبتكرة للتغذية القسرية الدقيقة (microgavage) ليرقات سمك الزيبرا باستخدام معدات الحقن المجهري للأجنة والمجاهر الستيريوسكوبية القياسية. ونبين أن التغذية القسرية الدقيقة هي تقنية آمنة وفعالة ومفيدة لإيصال كميات محددة من مواد متنوعة بشكل خاص إلى التجويف المعوي ليرقات سمك الزيبرا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
برزت سمكة الزيبرا (zebrafish) ككائن نموذجي قوي لدراسة تطور الأمعاء1-5، ووظائفها6-11، والأمراض12-16، والتفاعلات بين المضيف والميكروبات17-25. غالبًا ما تتطلب النهج التجريبية لدراسة بيولوجيا الأمعاء إدخال مواد مختارة in vivo إلى تجويف الأمعاء. وفي نموذج يرقات سمكة الزيبرا، يتم تحقيق ذلك عادةً عن طريق غمر الأسماك في محلول من المادة المختارة، أو عن طريق الحقن عبر جدار البطن. وباستخدام طريقة الغمر، يصعب مراقبة أو التحكم بدقة في مسار أو توقيت إيصال المادة إلى الأمعاء. لهذا السبب، يمكن أن يتسبب التعرض عن طريق الغمر في سمية غير مقصودة وتأثيرات أخرى على الأنسجة خارج المعوية، مما يحد من النطاق المحتمل لكميات المواد التي يمكن إيصالها إلى الأمعاء. كما أن كمية المادة التي يتم ابتلاعها أثناء التعرض بالغمر يمكن أن تختلف بشكل كبير بين اليرقات الفردية26. وعلى الرغم من أن هذه المشكلات لا تظهر أثناء الحقن المباشر عبر جدار البطن، إلا أن الحقن السليم أمر صعب ويتسبب في تلف الأنسجة الذي قد يؤثر على النتائج التجريبية. نحن نقدم طريقة للتغذية الأنبوبية الدقيقة (microgavage) ليرقات سمكة الزيبرا. والهدف من هذه الطريقة هو توفير وسيلة آمنة وفعالة ومتسقة لإيصال المواد مباشرة إلى تجويف الأمعاء الأمامية في يرقات سمكة الزيبرا بتوقيت مضبوط. تعتمد التغذية الأنبوبية الدقيقة على معدات الحقن المجهري للأجنة والمجهر الستيريوتكسي القياسية الشائعة في معظم المختبرات التي تجري أبحاثًا على سمكة الزيبرا. وبمجرد وضع الأسماك بشكل صحيح في ميثيل السليلوز، يمكن إجراء التغذية الأنبوبية بسرعة بمعدل يتراوح تقريبًا بين 7-10 أسماك/ دقيقة، وتقترب نسبة البقاء على قيد الحياة بعد العملية من 100% اعتمادًا على المادة المستخدمة. كما نبين أن التغذية الأنبوبية الدقيقة يمكن أن تسمح بتحميل تجويف الأمعاء بتركيزات عالية من المواد التي تكون قاتلة للأسماك عند التعرض لها عن طريق الغمر. ولإثبات فائدة هذه الطريقة، نقدم اختبار التغذية الأنبوبية الدقيقة باستخدام الديكستران الفلوري الذي يمكن استخدامه لقياس الانتقال من تجويف الأمعاء إلى المساحات خارج المعوية. يمكن استخدام هذا الاختبار للتحقق من التنفيذ السليم لإجراء التغذية الأنبوبية الدقيقة، كما يوفر اختبارًا جديدًا لسمكة الزيبرا لفحص سلامة الحاجز الظهاري المعوي تحت ظروف تجريبية مختلفة (على سبيل المثال التلاعب الجيني، أو العلاج الدوائي، أو التعرض لعوامل بيئية). علاوة على ذلك، نوضح كيف يمكن استخدام التغذية الأنبوبية لتقييم حركة الأمعاء عن طريق إعطاء كرات مجهرية فلورية ومراقبة انتقالها اللاحق. يمكن تطبيق التغذية الأنبوبية الدقيقة لإيصال مواد متنوعة مثل الكائنات الحية الدقيقة الحية، والعوامل/السموم الميكروبية المفرزة، والعوامل الدوائية، والمجسات الفسيولوجية. وبهذه الإمكانات، تمتلك طريقة التغذية الأنبوبية الدقيقة ليرقات سمكة الزيبرا القدرة على تعزيز نطاق واسع من المجالات البحثية التي تستخدم نظام سمكة الزيبرا النموذجي.
البروتوكول
نستخدم البروتوكولات المنشورة لتربية وصيانة أسماك الزيبرا القياسية للحصول على اليرقات من أجل التغذية القسرية الدقيقة (microgavage)27. نعتمد بشكل أساسي على التكاثر الطبيعي لإكثار الأسماك، ويتم الاحتفاظ بها في دورة ضوئية تبلغ 14 ساعة ضوء/10 ساعات ظلام. لقد تم تحسين هذا البروتوكول لعملية التغذية القسرية الدقيقة ليرقات أسماك الزيبرا في اليوم السادس إلى السابع بعد الإخصاب (dpf). ونتوقع أن تكون هذه الطرق قابلة للتطبيق عموماً على مراحل نمو أصغر أو أكبر مع إجراء تعديلات طفيفة. وما لم يُذكر خلاف ذلك، فقد استخدمنا سلالة أسماك الزيبرا البرية TL في اليوم السادس بعد الإخصاب، ولم يتم إطعام الأسماك. أُجريت جميع التجارب في مياه النظام التي تم الحصول عليها من منشأة تربية أسم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عند تنفيذ عملية التغذية القسرية (gavage) بشكل صحيح، يجب أن تكون المادة التي تم إيصالها محتواة بالكامل داخل الأمعاء الأمامية مع وجود القليل من المواد المتبقية أو عدم وجودها في المريء (الشكل 3). يجب اختيار حجم إيصال يمكن استيعابه داخل البصلة الأمامية ولا يتسرب عبر المجمع أو المريء. إذا كان حجم المادة أو ضغط الإيصال مرتفعًا جدًا، فقد تؤدي القوة الفيزيائية للتغذية القسرية إلى تلف الظهارة أو حدوث تسرب من خلالها. كما قد تؤدي إلى دفع أو تغيير المكونات الأخرى للوسط اللمعي (على سبيل المثال، الصفراء أو ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نصف في هذا العمل بروتوكولاً جديداً للإيصال المباشر للمواد إلى أمعاء يرقات سمك الزيبرفيش عن طريق التغذية الأنبوبية المجهرية (microgavage). هناك عدة خطوات حاسمة طوال الإجراء يجب وضعها في الاعتبار؛ أولاً، يجب أن تكون يرقات الزيبرفيش في حالة صحية جيدة قبل تجربة التغذية الأنبوبية لمنع حدوث وفيات غير مرتبطة بالعلاج. وهناك عامل مهم آخر وهو جودة إبرة التغذية، حيث يعد قص الإبرة في الموضع المناسب دون إحداث حواف حادة ومسننة أحد أصعب أجزاء البروتوكول. ويمكن استخدام جهاز صهر مجهري للماصات الدقيقة (micropipette microforge) لتحقيق كسر .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نتوجه بالشكر إلى أعضاء مختبر Rawls على مقترحاتهم المفيدة بشأن المحتوى، وإلى الدكتور Alan Fanning على المناقشات القيمة حول نفاذية حجم الموصلات المحكمة وطرق تعطيلها. كما نشكر الدكتور Michael Chua والدكتور Neal Kramarcy من مرفق Michael Hooker للمجاهر على الدعم المقدم باستخدام المجهر البؤري. وقد حظي هذا العمل بدعم من منح المعاهد الوطنية للصحة T32 DK007737-15 (للمتدرب J.L.C.)، وF32 DK094592 (لـ J.L.C.)، وR01 DK081426 (لـ J.F.R.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| فينكيل (تريكاين ميثان سلفونات) | Argent Chemical Laboratories | MS-222 | تخدير اليرقات |
| محلول أحمر الفينول | Sigma-Aldrich | P0290-100 ml | 0.5% في DPBS، مختبر لزراعة الخلايا |
| زيت معدني، خفيف، أبيض (عالي النقاء) | Amresco | J217-500 ml | لإعادة ملء الإبرة واختبار الحجم |
| TxRed-Dextran، وزن جزيئي 10,000 MW، قابل للتثبيت باللايسين | Invitrogen/ Molecular Probes | D-1863 | عالق بنسبة 1% في 1x PBS/أحمر الفينول |
| FM4-64FX | Invitrogen/ Molecular Probes | F34653 | مخزون بتركيز 5 mM في الماء |
| ميثيل السليلوز | MP Biochemicals | 0215549590 | |
| شعيرات زجاجية من البوروسيليكات | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | القطر الخارجي 1.14 mm، القطر الداخلي 0.53 mm، الطول 3.5 in |
| قالب بلاستيكي لصنع القوالب | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| وحدة الحقن المجهري Nanoject II | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| سحب الماصات المجهرية باللهب، خيط بعرض مجرى 3.0 mm | Sutter Instrument Co. | P-97, FT330B | تصنيع الإبر |
| ملقط طالب Dumont #5 | Fine Science Tools | 91150-20 | 0.1 x 0.06 mm، لقص الإبر |
| مقياس العينية، 5 mm - 100 قسم | Leica | 10394771 | لقص الإبر |
| جهاز الصهر المجهري (Microforge) | Narishige | MF-900 | لقص الإبر وصقلها بالنار |
| إبرة حقنة Tuberculin SlipTip | Becton Dickinson | 309626 | 1 ml، إبرة 25G 5/8 |
| كرات مجهرية Fluoresbrite YG (2.0 μm) | Polysciences, Inc. | 18338 | تحليل حركية الأمعاء |
| مجهر تشريحي | Leica | S6E | إجراء التغذية الأنبوبية (Gavage) |
| مجهر ستيريو فلوري | Leica | M205C | اختبار حاجز الديكستران |
| مجهر بؤري (Confocal) | Zeiss | LSM510 | تصوير الديكستران في الدورة الدموية |
المراجع
- Kuhlman, J., Eisen, J. S. Genetic screen for mutations affecting development and function of the enteric nervous system. Dev. Dyn. 236, 118-127 (2007).
- Pack, M., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
